高媛，周新佳，周妍，趙立

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1. 呼吸與危重癥科； 2. 耳鼻咽喉頭頸外科，沈陽 110004）

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 是一種常見的慢性氣道炎癥疾病，嚴重危害人類身體健康［1］。研究［2］表明，免疫失衡在COPD中起重要作用。作為免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，輔助T細胞及其產(chǎn)生的細胞因子參與黏膜炎癥的各種免疫反應(yīng)［3-4］。白細胞介素-9 （interlukin-9，IL-9） 是一種多功能細胞因子，主要由活化的Th9細胞分泌。 IL-9與IL-9受體 （IL-9 receptor，IL-9R） 結(jié)合后，激活STAT3通路，啟動一系列基因表達，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用［5］。既往研究［6］表明，COPD患者肺組織中IL-9的表達上調(diào)。此外，也有研究［7］表明IL-9促進COPD疾病進展，具體機制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，通過抗原呈遞參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，是COPD免疫致病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［8-9］。 巨噬細胞具有高度可塑性，當受到微環(huán)境的刺激時，其表型和功能會發(fā)生適應(yīng)性變化［10］。 香煙煙霧可誘導(dǎo)巨噬細胞活化并增加數(shù)量。 活化的巨噬細胞釋放趨化因子和基質(zhì)金屬酶，促進炎癥并破壞肺微環(huán)境［11］。JAK/STAT3是COPD發(fā)生發(fā)展的重要信號通路之一。 它參與多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響T細胞的分化。有研究［12］表明，IL-9與IL-9R結(jié)合可以激活巨噬細胞。目前，IL-9在COPD發(fā)展中的調(diào)控機制尚未闡明，IL-9在COPD病程中對巨噬細胞功能的影響亦不清楚。本研究通過構(gòu)建香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠模型，探討 IL-9及IL-9R在COPD進展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料及實驗動物

紅雙喜香煙 （煙尼古丁含量1.2 mg/支，焦油含量15 mg/支） 購自上海卷煙廠。IL-9多克隆抗體 （bs-2428R）、P-STAT3抗體 （bs-1658R） 和基質(zhì)金屬蛋白酶12 （matrix metalloproteinase，MMP12） 抗體 （bs-1854R） 購自北京Bioss公司。 IL-9R 抗體 （ab233757） 購自英國Abcam公司，STAT3 抗體 （#12640S）、GAPDH （#5174S） 購自美國CST公司，p-STAT3 （sc-8059P） 購自美國Santa Cruz 公司。白細胞介素-6 （interleukin-6，IL6） 檢測試劑盒 （SEA079Hu） 購自美國USCN公司，腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 檢測試劑盒 （SEA133Hu） 購自美國USCN公司，MMP-12檢測試劑盒 （SEA402Hu） 購自美國USCN公司。AG490（CSGC13854） 購自武漢科斯坦生物科技公司。小鼠肺泡巨噬細胞 （MH-S） 購自上海酶研生物科技有限公司。24只雄性C57BL/6小鼠 （8周齡，體質(zhì)量20～25 g） 購自遼寧長生生物技術(shù)公司。

1.2 實驗分組及香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠模型建立

小鼠在 （22±2） ℃、相對濕度 （55±15） %、光照12 h/黑暗12 h的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)。應(yīng)用隨機數(shù)字表將24只小鼠均分為3組：吸煙組［CS組，每天放置在艙內(nèi)，建立香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠模型 （香煙暴露：10支/次，2次/d，60 min/次，5 d/周，連續(xù)暴露6個月） ］、戒煙組［cession-CS組，小鼠每天置于艙內(nèi)，連續(xù)香煙暴露 （10支/次，2次/d，60 min/次，5 d/周） 6個月，停止煙霧暴露6個月］、對照組 （小鼠暴露于過濾空氣中，除香煙暴露外，其他條件與吸煙組相同，連續(xù)暴露6個月）。3組均在實驗后 24 h內(nèi)腹腔麻醉小鼠 （10%水合氯醛溶液，0.3 mL/100 g），通過眶后動脈放血處死。取出左肺，10%甲醛灌注左肺下葉，使之膨脹后再用10%甲醛固定48 h后石蠟包埋保存?zhèn)溆谩Ｓ曳谓M織迅速移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院動物倫理委員會批準 （批準文號：2016PS179K）。

小鼠肺泡巨噬細胞 （MH-S）給予不同濃度 （0、10、30 ng /mL） IL-9干預(yù)，干預(yù) 2、4、6、12 h時檢測IL-6、TNF-α、MMP-12水平。進一步將小鼠肺泡巨噬細胞（MH-S） 分為對照組、干預(yù)組 （加入30 ng /mL IL-9干預(yù)12 h）、AG490+IL-9干預(yù)組 （加入AG490、30 ng/mL IL-9干預(yù)12 h）。采用PCR及Western blotting檢測STAT3、p-STAT3及MMP-12的表達情況。

1.3 方法

1.3.1 HE 染色：取石蠟包埋的肺組織，在距肺門 3 mm 處連續(xù)水平切片 （厚度3～4 μm）。乙醇和二甲苯脫蠟至水，蘇木精浸漬，1%鹽酸乙醇分化，0.5%伊紅溶液復(fù)染，透明蓋玻片脫水。每張切片在10 倍物鏡下隨機選取10 個非重復(fù)視野，在 100 倍物鏡下采集圖像，由2位病理醫(yī)生讀片，獲得肺泡間隔 （linear intercept，Lm） 和肺泡破壞指數(shù) （destructive index，DI）。Lm反映肺泡直徑，具體測量方法：避開大血管和支氣管，在視野的中心畫十字，計算與十字相交的肺泡間隔數(shù)，測量十字的總長度，根據(jù)Lm=十字總長度/肺泡格數(shù)來計算。DI反映肺泡壁結(jié)構(gòu)的破壞程度，具體測量方法：目鏡內(nèi)放置一個標有42個點的計數(shù)網(wǎng)格。如果視野中的標記點落在所見的肺泡腔或肺泡囊腔內(nèi)，則記為肺泡正常 （normal alveolar and/or duct spaces，N） 或肺泡破壞 （destroyed alveolar and/or duct spaces，D）；如果標記點落在其他結(jié)構(gòu)上則不記錄。計算DI=D /（D + N） 。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色：取3組石蠟包埋肺組織，切片、脫蠟、水化后，抗原修復(fù)，用3%過氧化氫去除內(nèi)源性氧化酶，山羊血清封閉，滴加一抗 （1 ∶400）、二抗PBS洗片孵育，DAB顯色、復(fù)染、封片。各型炎癥細胞以胞質(zhì)和 （或） 胞膜呈棕黃色或棕褐色判定為陽性表達［13］。采用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡 （40倍） 觀察切片，通過Image-ProPlusV6.O圖像軟件分析3組陽性表達結(jié)果。

1.3.3 ELISA檢測：小鼠肺泡巨噬細胞 （MH-S） 于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過加入不同濃度 （0、10、30 ng /mL） IL-9干預(yù)MH-S細胞，在干預(yù)2、4、6、12 h后使用檢測試劑盒檢測TNF-α、IL-6和MMP-12的表達水平，操作均按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 實時定量PCR （real-time quantitative PCR，qRT-PCR）：使用Mini BEST Universal RNA Extraction Kit （9767，日本TaKaRa公司） 提取3組小鼠肺組織標本及肺泡巨噬細胞總RNA，并使用PrimeScriptTMRT Master MIX （RR036A，日本TaKaRa公司） 合成cDNA模板。使用紫外分光光度法測定 RNA 濃度和純度。采用 One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PR KitⅡ（日本TaKaRa公司） 將 0.5 μg 總 RNA 逆轉(zhuǎn)為 cDNA。使用 BIO-RAD （美國伯樂公司） 進行檢測。引物序列：β-actin，正向5’-GCAGAAGGAGATTACTGCTCT-3’，反向5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’；IL-9，正向5’-CTGCTTGTGTCTCTCCGT-3’，反向5’-GACT TCAACTATCCTTTTCACC-3’；IL-9R，正向5’-GCTT TGTCCACCTTCTGTT-3’，反向5’-CACCATTCTGTCT TGCTTG-3’；MMP-12，正向5’-ATTTCCACACACTTCC CA-3’，反向5’-ACCCTTCACTACATTCTTCCT-3’；STAT3，正向5’-TCTACCTCTACCCCGACATT-3’，反向5’-ACTCAAACTGCCCTCCTG-3’。擴增產(chǎn)物長度為 135 bp。利用 2-ΔΔCt計算基因表達水平。

1.3.5 Western blotting檢測：提取組織總蛋白，采用BCA法定量。 按每孔30 μg蛋白量進行電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗孵育。用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水洗滌膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗。 室溫孵育1 h，洗膜后顯色。采用江蘇捷達801成像系統(tǒng)分析IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12蛋白的吸光度。相對蛋白含量采用目標蛋白條帶值/內(nèi)參GAPDH條帶值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示。 多組間比較采用單因素方差分析。組間兩兩比較方差一致的采用 Bonferroni 檢驗，方差不一致的采用Dunnett’s T 3 檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠氣道炎癥及肺泡損傷結(jié)果

HE 染色結(jié)果 （圖1A） 顯示，對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細胞浸潤。 CS組小鼠支氣管壁、血管壁、肺泡均有明顯的炎性細胞浸潤，杯狀細胞有不同程度增殖。與對照組比較，CS組肺泡腔變大，肺泡間隔破裂。肺大泡融合，炎癥細胞浸潤明顯。cession-CS組小鼠肺泡腔擴大，肺泡間隔破裂，炎癥細胞浸潤程度較CS組加重。進一步分析結(jié)果表明，CS組和cession-CS組Lm和DI均顯著高于對照組 （P<0.001）。與CS組比較，cession-CS組Lm和DI顯著升高（P< 0.05）。見圖1B。表明香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠模型建立成功。香煙煙霧暴露對小鼠肺組織造成嚴重損害，并且戒煙后損害仍然加重。

圖1 3組肺組織HE染色及病理形態(tài)學(xué)定量分析結(jié)果Fig.1 HE staining and histopathologic quantitative analysis of lung tissue in 3 groups

2.2 各組小鼠肺組織IL-9、IL-9R表達變化

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，IL-9和IL-9R 陽性細胞分布于肺泡壁、氣道壁和巨噬細胞壁。 IL-9主要在浸潤性炎癥細胞中表達。CS組及cession-CS組肺泡壁和小氣道IL-9和IL-9R陽性表達高于對照組 （均P<0.05）；而CS組IL-9和IL-9R陽性表達高于cession-CS組 （P< 0.05），見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測各組肺組織中IL-9和IL-9R陽性表達Fig.2 Positive expressions of IL-9 and IL-9R in lung tissues of each group determined using immunohistochemistry

2.3 各組小鼠肺組織IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12表達

通過qRT-PCR及Western blotting檢測小鼠肺組織IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12表達的變化。結(jié)果顯示，與對照組比較，CS組小鼠肺組織IL-9、IL-9R、STAT3和MMP-12表達顯著升高 （均P< 0.01）。與CS組比較，cession-CS組IL-9、IL-9R、STAT3和MMP-12表達顯著降低 （均P< 0.05），見圖3A。 進一步Western blot-ting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，CS組小鼠肺組織IL-9、IL-9R、p-STAT3和MMP-12表達顯著升高（P< 0.01）。與CS組比較，cession-CS組小鼠肺組織IL-9、IL-9R、p-STAT3及MMP-12水平降低 （P< 0.01），但仍顯著高于對照組，見圖3B。

圖3 3組小鼠肺組織中IL-9、IL-9R、MMP-12、STAT3表達比較Fig.3 Comparison of IL-9，IL-9R，MMP-12，and STAT3 expressions in lung tissue of mice in 3 study groups

2.4 不同濃度 IL-9 對肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，與0 ng /mL IL-9比較，10、30 ng /mL IL-9干預(yù)2、4、6、12 h時肺泡巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α和MMP-12水平逐漸增加 （P< 0.05）。與0 ng /mL IL-9比較，30 ng /mL IL-9干預(yù)12 h肺泡巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α和MMP-12水平增加更明顯 （均P< 0.000 1）?？梢姡S著IL-9濃度增加，肺泡巨噬細胞分泌 TNF-α、IL-6和MMP-12的水平也提高，見圖4。

2.5 IL-9通過JAK/STAT3通路促進巨噬細胞活化

AG490可抑制JAK的激活，進而抑制下游因子p-STAT3水平。進一步將小鼠肺泡巨噬細胞分為對照組、IL-9 （30 ng /mL） 組、AG490+IL-9組，觀察IL-9通過JAK/STAT3通路對MMP-12轉(zhuǎn)錄的影響。PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-9組MMP-12表達上調(diào)，而AG490+IL-9組逆轉(zhuǎn)了這種上調(diào) （均P< 0.001）。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-9組MMP-12、p-STAT3表達升高，STAT3表達下降 （均P<0.05）；與IL-9組比較，AG490+ IL-9組MMP-12、p-STAT3表達下降，而STAT3表達升高 （均P< 0.05）。表明IL-9通過JAK/STAT3通路促進MMP-12的轉(zhuǎn)錄。見圖5。

3 討論

COPD是一種進行性慢性氣道炎癥疾病，臨床表現(xiàn)為不完全可逆的氣流受限和肺功能下降［14］。吸煙是發(fā)生COPD的主要危險因素。炎癥反應(yīng)是COPD的核心機制，主要影響小氣道和肺實質(zhì)，引起小氣道阻塞［15］。戒煙后COPD炎癥并不能完全消除，COPD患者戒煙后肺部炎癥持續(xù)存在，并繼續(xù)發(fā)展為肺氣腫［16］。本研究構(gòu)建了香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠模型。結(jié)果表明，戒煙后很長時間吸煙引起的損害仍然持續(xù)存在，與以往研究結(jié)果一致。

免疫調(diào)節(jié)在炎癥的發(fā)展中起重要作用。多項研究表明，CD4+T細胞亞群 （包括Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞） 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 Th9 細胞由 VELDHOEN 等［17］和 DARDALHON等［18］發(fā)現(xiàn)，是CD4+T淋巴細胞的一個新亞群。研究［19-20］顯示Th9細胞及其分泌的細胞因子 IL-9參與免疫介導(dǎo)的疾病。哮喘或接觸性皮炎患者外周血中Th9細胞明顯增加，提示Th9細胞可能與過敏性疾病的發(fā)病有關(guān)。近期關(guān)于COPD的研究［5-6］表明，COPD患者誘導(dǎo)痰液中IL-9水平顯著升高，提示IL-9參與了疾病進展。本研究免疫組化、Western blotting和PCR檢測結(jié)果顯示，香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的COPD小鼠IL-9和下游信號通路激活。而戒煙后小鼠肺部IL-9和下游的STAT3/MMP-12通路仍處于過度激活狀態(tài)。這些結(jié)果表明IL-9在COPD的疾病進展中起重要作用，在戒煙后也是持續(xù)氣道重塑和肺氣腫進展的重要因素。

IL-9R屬于γ鏈細胞因子受體家族，由一條α鏈和一條γ鏈組成［21］。IL-9R在許多免疫細胞 （肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞） 中表達［22］。其中，巨噬細胞是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁，是呼吸道和肺部抵御微生物感染的第一道防線。巨噬細胞活化在肺部疾病，尤其是COPD 中起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果顯示，隨著IL-9干預(yù)濃度的增加，小鼠肺泡巨噬細胞炎性細胞因子TNF-α、IL-6和MMP-12分泌顯著增加，表明IL-9通過受體IL-9R影響巨噬細胞炎癥反應(yīng)。研究［23］表明，IL-9與靶細胞表面的IL-9R結(jié)合后，激活JAK/STAT3通路，啟動一系列炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究結(jié)果表明，Th9細胞分泌的IL-9 通過JAK/STAT3通路促進巨噬細胞活化，與以往研究結(jié)果一致。

綜上所述，香煙煙霧誘導(dǎo)的 COPD 小鼠IL-9 及其下游信號通路激活；而戒煙后小鼠肺氣腫持續(xù)加重，IL-9及其下游信號通路持續(xù)激活。IL-9 及IL-9R通過STAT3 通路激活巨噬細胞，促進COPD進展。本研究存在一定局限性：IL-9調(diào)控巨噬細胞功能的具體機制尚未明確；此外，缺乏臨床病理標本的驗證，因此仍需進一步研究論證。