劉軍民，潘倍莎

1.中共舟曲縣委組織部，甘肅 甘南 746300；2.甘肅農業(yè)大學，甘肅 蘭州 730070

在我國干旱、半干旱的黃土丘陵區(qū)，土壤水分影響著植物生理生態(tài)特性和生理生化特性[1]。在生長發(fā)育過程中，不同的水分脅迫會對植物的生長和生存帶來不同的影響[2]，所以對植物的抗旱性進行研究具有必要性。

紫花苜蓿（Medicago sativa L）是干旱、半干旱地區(qū)普遍種植且產業(yè)化發(fā)展前景良好的優(yōu)良牧草品種，雖其耐旱性強，但需水量也高，故缺水是限制其生長及牧草產量的主要因素[3]。新疆大葉苜蓿（Medicago sativa L .cv .Xingjiang Daye）是西北地區(qū)大面積種植的紫花苜蓿品種，土壤水分對其生長發(fā)育及生理生化特性有著十分重要的影響，進而可能會影響到其產量和品質。因此，研究新疆大葉苜蓿在不同水分條件下的生理生化特性至關重要。

在植物抗旱生理研究中，MDA 含量是一個常用指標。植物器官在逆境下遭受傷害，往往會發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA 從膜上產生的位置釋放出后，可以與蛋白質、核酸發(fā)生反應，使之喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松弛，或抑制蛋白質的合成，因此，MDA 的積累會對膜和細胞造成一定的傷害，反過來說，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。植物在干旱條件下會產生大量的活性氧，如超氧化陰離子、過氧化氫、羥自由基等[4]。活性氧具有很強的化學活性[5]，能夠改變蛋白質結構，使核酸斷裂突變，損壞細胞膜，而抗氧化酶可以減少這種傷害[6]。在植物體抗氧化過程中，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等各自分工，能夠清除部分活性氧自由基，減少活性氧對植物體的傷害[7]。在已有的研究中，月季在生育過程中MDA 含量呈緩慢增長趨勢[8]，唐苜蒲衰老過程中，MDA 含量一直在增長[9]，含醉花在發(fā)育過程中MDA 含量逐漸增高[10]。

因此，研究土壤水分脅迫對不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶活性的影響，被認為是培育耐旱基因植株富有前途的課題。

本研究通過在不同土壤水分脅迫下，研究不同茬次新疆大葉苜蓿葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT酶活性和MDA 的酶含量，對數(shù)據進行整理，為干旱、半干旱地區(qū)植物的抗旱性研究提供科學依據，以期提高其產量，發(fā)揮其優(yōu)良生態(tài)和經濟效益。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

盆栽試驗于2020 年甘肅農業(yè)大學林學樓下模擬徑流場內（103.69°E，36.09°N；海拔1 534.2 m）進行，屬于溫帶大陸性氣候。

1.2 試驗內容與方法

1.2.1 試驗內容

通過測定不同水分條件下不同茬次的新疆大葉苜蓿丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性，分析土壤水分脅迫對不同茬次紫花苜蓿丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響，為紫花苜蓿在干旱、半干旱地區(qū)的種植提供參考依據。

1.2.2 試驗方法

采用盆栽觀測的方法：盆栽實驗選用圓柱形聚乙烯桶，桶內裝上過篩壤土，栽植新疆大葉苜蓿。

返青后用稱重法控制土壤水分，試驗設3 個處理，即土壤水分含量保持田間持水量的85 %，土壤水分含量保持田間持水量的65%，土壤水分含量保持田間持水量的45%。每個處理12 桶，共36 桶新疆大葉苜蓿。

生育期內的全部降水用防雨棚遮去，每晚用稱重法均勻澆水，平衡桶重，并記錄每天的耗水量。

1.2.3 試驗材料

兩年生的新疆大葉苜蓿。

1.2.4 測定方法

（1）過氧化物酶（POD）活性：愈創(chuàng)木酚比色法

在比色杯中依次加入0.05 mL 的上清液、2.65 mL 的0.3%愈創(chuàng)木酚，將比色杯放入分光光度計的比色槽中，加入0.3 mL 的0.6% H2O2（比色杯中液體總體積為3 mL），立即按開始鍵，自動計時2 min，記錄470 nm 處OD 值，按式（1）計算POD 活性。

（2）超氧物歧化酶（SOD）活性：氮藍四唑法

取5 mL 透明度好的指形管，依次加入1.5 mL的0.05 mol/L 磷酸緩沖液、0.3 mL 的130 mol/L Met、0.3 mL 的750 umol/L NBT 溶液、0.3 mL 的100 umol/L EDTA-Na2 溶液、0.25 mL 的蒸餾水，0.3 mL的20 umol/L 核黃素溶液和0.05 mL 的上清液（對照管中以緩沖液代替上清液），搖勻，將對照管置于暗處，測定管置于4 000 x 日光燈下顯色20 min 后，立即用黑色塑料袋進行遮光處理，終止反應。以對照管作空白調零，分別測出各測定管在560 nm 處的吸光度，按下式計算SOD 活性：

式中：Ao對照管吸光度；As樣品測定管吸光度；VT樣品提取液的總體積（mL）；Vs測定時取酶液量（mL）；FW 樣品鮮重（g）。

（3）過氧化氫酶（CAT）活性：紫外線吸收法

在比色杯中加入0.2 mL 上清液，將比色杯放入分光光度計的比色槽中，加入2.8 mL 的0.067 mo/L H2O2（比色杯中液體總體積為3 mL），立即按開始鍵，自動計時2 min，記錄240 nm 處的OD 值，按下式計算CAT 活性：

（4）丙二醛（MDA）測定：硫代巴比妥酸法

取0.3 g 植物樣片，放入冰浴的研缽中，加入少許石英砂和2 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液，研磨成勻漿；將勻漿轉移到試管中，在用3 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液，分2 次（每次1.5 mL）沖洗研缽，合并濾液；在提取液中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液；將試管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內溶液出現(xiàn)小氣泡開始計時）；到時間后，立即將試管取出放入冷水浴中；試管溶液冷卻后，3 000 r/min 離心15 min 取上清液并量體積，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白測532 nm、600 nm、450 nm 處的吸光度，計算MDA 含量。

1.2.5 技術路線圖

下圖1 為研究土壤水分脅迫對不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶含量影響的技術線路圖：

圖1 技術線路圖

2 實驗處理與分析

研究抗氧化酶活性，采用盆栽觀測法，選擇圓形塑料桶，處理兩年生的新疆大葉苜蓿。采用稱重法控制土壤水分，設置3 個水分梯度（如下表1）。

表1 水分梯度

土壤水分處理標記為TA、TB、TC；土壤含水量占田間持水量的百分比分別為85%、65%、45%；每個梯度選擇4 個桶進行試驗，每桶各取3 個植株，測定其葉片中各個抗氧化酶的活性和丙二醛含量。

2.1 數(shù)據處理

使用Excel 2010 進行數(shù)據整理與繪圖；使用SPSS 進行顯著性分析。

2.2 數(shù)據分析

2.2.1 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿丙二醛含量的影響

從總趨勢來看，兩茬MDA 含量均隨著生育期逐漸增長。就TB 而言，第一茬從0.03 增加到0.07，第二茬從0.016 增加到0.072，且各個生育期內的MDA 含量均是TC>TB>TC。第一茬中分枝期內TA與TC 差異顯著，TB 與TC 同樣差異顯著（P<0.05）；在現(xiàn)蕾期內TA 與TC 差異顯著，TB 與TC 差異顯著；其他生育期內無顯著性差異。第二茬中只有現(xiàn)蕾期內TA 與TC 差異顯著，TA 與TB 差異顯著，其余各個生育期內均無顯著性差異。如圖2 所示。

圖2 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿丙二醛含量的影響

2.2.2 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿POD 活性的影響

圖3 顯示，兩茬中POD 活性均在分枝期達到最大值，且各時期POD 活性均在TB 下達最大值，說明輕度水分脅迫有利于POD 酶活性的增強。在第一茬分枝期中，TA 與TB 差異性顯著，TB 與TC 差異性顯著（P<0.05）；開花期中TA 與TC 差異性顯著，TA 與TB 差異性顯著，TB 與TC 同樣差異性顯著，且隨著生育期的發(fā)展呈先增高后降低的趨勢。POD活性在分枝期3 種水分脅迫下均達到最大值，同時在各個時期，POD 酶活性均在TB 下達最高值。在第二茬分枝期中TA 與TC 均與TB 差異性顯著，POD活性在現(xiàn)蕾期中3 種水分脅迫下兩兩差異性顯著，開花期中TA 與TC 均與TB 差異性顯著。同樣，隨著生育期發(fā)展呈先增長后降低的趨勢。就TB 而言，第一茬POD 活性從返青期的3.157 8 增長到分枝期的6.543 6，再降低到開花期的3.111 7，且在各個時期中POD 酶活性均在TB 下達到最大值。

圖3 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿POD 活性的影響

2.2.3 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿SOD 活性的影響

圖4 表明，從總體上看，兩茬中SOD 活性在分枝期達到最大值，且各時期SOD 酶活性均在TB 下達最大值，說明相比之下輕度水分脅迫有利于SOD酶活性的增強。在第一茬中，除了現(xiàn)蕾期內TA 與TC 沒有顯著性差異外（P<0.05），其余的各個時期均是兩兩有顯著性差異。且隨著生育期的發(fā)展呈先增高后降低的趨勢，在分枝期3 種水分脅迫下均達到最大值，同時在各個時期，SOD 酶活性均在TB 下達最高值。在第二茬中返青期與分枝期內，均是兩兩有顯著性差異。現(xiàn)蕾期內TA 與TB 和TC 都有顯著性差異，開花期內TA 與TB 和TC 有顯著性差異，同樣隨著生育期發(fā)展呈先增長后降低的趨勢，在第一茬TB 中從返青期的161.598 5 增長到分枝期的266.383 1，再降低到開花期的136.787 8，且在各個時期中SOD 酶活性均在TB 下達到最大值。

圖4 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿SOD 活性的影響

2.4 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿CAT活性的影響

圖5 表明，隨著生育期的發(fā)展，CAT 活性呈先增長后降低的趨勢。圖中第二茬TB 下從返青期的16.868 4 增長到分枝期的23.917 3，再降低到開花期的18.295 0。在各個時期內，CAT 酶活性均在TB下達到最大值。從兩茬的總體情況來看，在輕度水分脅迫（TB）下有利于CAT 酶活性的增強。在第一茬返青期和分枝期內，TB 與TA 和TC 均有顯著性差異，在現(xiàn)蕾期和開花期內TC 與TA 和TB 均有顯著性差異（P<0.05），同時隨著生育期的發(fā)展，CAT 呈逐漸增長趨勢，且從整體上看，在各個時期內，CAT 活性都在TB 下達到最大值；在第二茬返青期和分枝期內，TB 與TA 和TB 均有顯著性差異，在現(xiàn)蕾期內，TC 與TA 和TB 均有顯著性差異。

圖5 土壤水分脅迫對不同茬次新疆大葉苜蓿CAT 活性的影響

3 討論與結論

3.1 討論

在本次研究中，隨著土壤水分脅迫的加劇，MDA 酶含量呈增長趨勢（TC>TB>TA），而且隨著新疆大葉苜蓿生育期的發(fā)展而發(fā)展，即隨著植物器官衰老，MDA 酶含量逐漸增長。這表明越是在逆境條件下，或者在植物器官衰老時，膜脂過氧化作用就越強烈，相應地，其反應的產物丙二醛（MDA）就越多。此實驗數(shù)據符合MDA 在逆境或衰老時含量越高的規(guī)律。MDA 是對膜系統(tǒng)有毒害作用的物質，其含量的多少能夠反應出膜脂過氧化的程度，同時也能夠反應出質膜被破壞的程度。MDA 與膜結構上的蛋白和酶結合，使蛋白結構和酶失去活性，從而對膜結構造成破壞，膜結構被破壞后，自然其水勢會發(fā)生變化，所以植物進入了衰老過程，隨著MDA 的積累，植物衰老的就越快。上述實驗正好證明了這一點。而且CAT、SOD、POD 等保護性酶活性隨著紫花苜蓿的衰老，其活性降低，也是因為隨著器官衰老MDA 逐漸積累而造成的。

此外，隨著水分脅迫的加劇，MDA 含量也呈增長趨勢。這表明，隨著水分脅迫的加劇，植物器官能吸收的水分就相應減少，滲透壓進一步失調，加速了植物的衰老，因此MDA 的含量也就呈增長趨勢。這與張建文等對萱草MDA 含量的研究結果相似。張建文等研究表明月季切花在衰老過程中MDA 是緩慢增多的，郁金香在整個衰老過程中MDA 也是逐漸增多的[11-15]。本實驗也同樣證明隨著紫花苜蓿的衰老，其MDA 含量是逐漸增多的。

過氧化物酶（POD）是最重要的抗氧化酶之一，POD 催化過氧化氫氧化氨類和酚類脫氫，脫下來的氫把H2O2還原成水，從而保護了膜系統(tǒng)[16]。本實驗表明，在兩茬紫花苜蓿中POD 酶活性均是隨著生育期的發(fā)展，呈先增長后緩慢降低的趨勢，在分枝期達到最大值。且在各個生育期內，POD 酶活性均是在TB 下達到最大值。這說明，在紫花苜蓿前期，MDA含量較少，因而保護酶活性較高，而隨著生育后期MDA 含量積累逐漸增多，對膜的危害越嚴重，加劇了植物器官的衰老，因此保護酶活性也相應的降低。POD 酶在TB 水分脅迫下達到最大值，表明在TB 水分脅迫下POD 酶能起到最佳的抗旱和抗氧化的作用。

超氧化歧化酶（SOD）在植物體內的含量很多，能夠清除氧自由基，使其生成氧分子和水，起到相應的保護作用[17-18]，提高了植物的抗旱性。本次實驗表明，兩茬紫花苜蓿均是隨著生育期的發(fā)展而增長，SOD 酶活性呈先增長后緩慢降低的趨勢，在分枝期達到最大值。在各個生育期內，SOD 酶活性均是在TB 下達到最大值，其在紫花苜蓿生育后期活性降低的原因也跟MDA 酶含量增高有關系。同時，在兩茬紫花苜蓿中SOD 酶活性均在TB 下達最大值，這同樣說明，在輕度水分脅迫下有利于增強SOD 酶的活性，提高紫花苜蓿的抗旱性。相反，在充分供水條件下，SOD 酶的活性則相對較低，這說明在充分供水條件下不利于增強SOD 酶的活性。

過氧化氫酶（CAT）同樣也是植物體內膜質過氧化過程中主要的保護酶之一，它是最重要的抗氧化酶，CAT 可以催化兩個過氧化氫分子生成氧氣和水，從而保護膜系統(tǒng)[19-20]。在第一茬中，CAT 酶活性在前期增長明顯，而在后期則趨于緩慢增長趨勢，說明在生育前期MDA 含量少，因此CAT 保護酶活性強，而后期因為MDA 含量積累過多，抑制了CAT 酶的活性。在第一茬的各個時期內，CAT 酶活性均在TB 狀態(tài)下達到最大值，這表明在中度水分脅迫下有利于CAT 酶活性的增強。在第二茬中，隨著生育期的發(fā)展，在紫花苜蓿生育后期CAT 酶活性有所降低，這與MDA 含量積累過高有關。隨著植物器官的衰老，各項生理機能的減弱，有關保護酶活性自然會降低。在第二茬的各個時期，CAT 酶活性在TB 下達到最大值，這說明在輕度水分脅迫下有利于CAT 酶的活性，而在充分供水條件下CAT 酶含量有所降低，可能是因為過多的水分破壞了CAT 的分子結構，導致其活性降低。

總之，本次研究表明，隨著紫花苜蓿生育期的發(fā)展，MDA 酶含量逐漸增高。而3 種保護酶活性則呈現(xiàn)先增高后降低的變化。同時，在不同水分脅迫下，MDA 含量在TC 下達最大值，而3 種保護酶活性則在TB 下達到最大值。說明MDA 酶和3 種保護酶之間相互影響，彼此制約；同樣表明紫花苜蓿有較強的抗旱性，在干旱地區(qū)種植該種植物，有利于促進當?shù)氐男竽翗I(yè)發(fā)展。

3.2 結論

本實驗對土壤水分脅迫對不同茬次紫花苜蓿丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響進行研究。研究表明，隨著紫花苜蓿的生育期發(fā)展，丙二醛含量呈逐漸增長趨勢（TC>TB>TA），且隨著土壤水分脅迫的加劇，丙二醛含量也呈逐漸增長的趨勢。這說明在逆境或衰老情況下，紫花苜蓿的丙二醛含量會增高。

同樣，隨著紫花苜蓿生育期的發(fā)展，3 種保護性抗氧化酶的活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在分枝期達到最大值，且在各個時期，3 種保護性抗氧化酶的活性均在輕度水分脅迫（TB）下達到最大值，說明輕度水分脅迫下有利于增強紫花苜蓿保護性酶的活性。這一結論也說明，紫花苜蓿具有較強的抗氧化性和抗旱性，適合在干旱和半干旱地區(qū)種植，能夠發(fā)揮出其巨大的生態(tài)價值和經濟價值。