王 輝，馬夢潔，許劍鋒*

1.上海海洋大學(xué)，上海 201306；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203;3.食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306

谷氨酸（Glutamate，Glu）主要是在Glu 受體（Glu receptor，GluR）介導(dǎo)下調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元興奮性和代謝活動的重要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，代謝型谷氨酸受體（Metabotropic glutamate receptors，mGluR）屬于谷氨酸受體的一種類型（另一類為離子型谷氨酸受體），該受體是GPCR 家族C 組成員[1]。mGluR5 主要以二聚體的形式分布在大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體等區(qū)域，通過激活信號通路，廣泛參與調(diào)控突觸傳遞、突觸可塑性、神經(jīng)興奮性/抑制性平衡等生理過程，對維系神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要[2]。在病理條件下，它是一種公認的治療靶點，與多種腦疾病有關(guān)。盡管有可靠的臨床前數(shù)據(jù)，但mGluR5 拮抗劑在幾項臨床試驗中都失敗了，這表明需要深入地了解mGluR5 功能背后的機制[3]，其作為神經(jīng)和精神疾病的潛在藥物靶標日益受到相關(guān)研究人員的關(guān)注。

納米抗體只包括一個重鏈可變區(qū)（VHH）和兩個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，不像經(jīng)過人工改造的單鏈抗體片段（scFv）那樣容易互相沾粘，甚至聚集成塊[4]。相反，其具備分子質(zhì)量小，能夠穿透血腦屏障，特異性和親和力高，表達量高和對人體的免疫原性較弱等優(yōu)勢。本文通過對駱駝免疫，篩選出與mGluR5特異性結(jié)合較高的納米抗體，然后以納米抗體為中間體進行一系列改造，使mGluR5 靶向成藥成為可能[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DNA Polymerase、T4 DNA Ligase 從南京諾唯贊購入；淋巴細胞分離液從GE Healthcare 公司購入；RNeasy PlusMiniKit 從 QIAGEN 公司購入；TIANquick Midi Purification Kit、TIANgel Midi PurificationKit 均購自天根生化科技（北京）有限公司；293s 細胞、M13KO7 輔助噬菌體購自NEB 公司；Mouse Anti- HA-tag Antibody、HRP Goat Antimouse IgGH+L）Antibody 從上海翌圣生物科技有限公司購入；M2 親和層析柱；Ni-NTA His 結(jié)合樹脂從Sigma 公司購入。

1.2 方法

1.2.1 mGluR5 真核表達載體的構(gòu)建

從NCBI 上查找編碼野生型人mGluR5 的21-835 位氨基酸殘基的堿基序列，將血凝素（HA）信號肽、標志表位標簽（DYKDDDDK）和3-丙氨酸連接物添加到N 端，然后在蘇州金唯智生物科技有限公司合成，設(shè)計上游引物、下游引物；將改造后的mGluR5 和CMV-Flag 載體進行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物提純后進行連接，將連接好的產(chǎn)物用Top10 感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，次日隨機挑取轉(zhuǎn)化出來的細菌，用上下游引物進行菌落PCR，將菌落PCR 結(jié)果為陽性的進行質(zhì)粒測序，和原始序列進行對比[6]。

1.2.2 mGluR5 的表達純化

利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統(tǒng)（Invitgen）制備重組桿狀病毒[7]。800 mL 293 s 細胞，病毒比例1∶20，用10 mM 正丁酸鈉30 ℃和135RPM 誘導(dǎo)3 d，離心收集細胞，在含有10 mM Tris 和1 mM EDTA 的低滲緩沖液中（pH 為7.8）和1 mM EDTA中裂解，然后勻漿[8]；用離心法收集細胞膜微球，分別用20 mM HEPES，10% Glycerol，10 mM NaCl，0.01% LMNG，1% Coaktail，10 μM FFMTEP，0.2%膽固醇琥珀酸半酯（CHS）（類固醇）和10 μM FFMTEB（化合物）在4 ℃冷庫旋轉(zhuǎn)孵育2 h。FFMTEB（3-fluoro-5-（2-（2-（fluoromethyl）thiazol-4-yl）ethynyl）benzonitrile）是F-MTEB 的氟化類似物，對mGluR5具有極高的親和力及選擇性；用20 mM HEPES，10% Glycerol，10 mM NaCl，0.01% LMNG，10 μM FFMTEP，2 mM CaCl2洗滌[9]。與M2 柱子結(jié)合的mGluR5 在20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl，0.005% （W/V）LMNG，10 μM FFMTEP，0.2 mg/mL flag 和5 mM EDTA 洗脫。蛋白經(jīng)50 kDa 截留的Vivaspin（微孔）濾膜濃縮，濃縮至500 μL 過Superose 6，10/300 GL 柱（GE Healthcare）進行分離，測濃度計算質(zhì)量，在蛋白中稱取3 倍質(zhì)量的A835，混合均勻吸取蛋白體積1/2 活化的Bio-beads（500 uL），將蛋白加入其中，4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜吸附Detergent后，換等量的活化Bio-beads 4 ℃旋轉(zhuǎn)吸附4 h，經(jīng)吸附A835 包裝后的蛋白過Superose 6 柱子進行分離[10]。通過SDS-PAGE 凝膠電泳確認蛋白。

圖1 mGluR5-CMV-Flag 載體的構(gòu)建

圖3 噬菌體展示抗體庫的構(gòu)建

圖4 抗mGluR5 納米抗體的篩選

1.2.3 mGluR5 蛋白免疫野生單峰駝

將1 mg mGluR5 蛋白與GERBU Adjuvant FamaTM 佐劑按1∶1 混勻，注射于野生雙峰駝頸部的淋巴結(jié)處，總共需要對駱駝進行7 次免疫，每次間隔時間為1 周，最后一次免疫1 周后抽取200 mL駱駝的外周血[11]。

1.2.4 噬菌體展示抗體庫的構(gòu)建

將150 mL 的駱駝外周血與等體積的0.9%氯化鈉溶液輕晃混勻，將稀釋的外周血按10 mL 每管慢慢注入15 mL 每管淋巴細胞分離液液面上，通過低速離心使外周血分為4 層，用移液槍小心吸出淋巴細胞層進行總RNA 的提取，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA[12]。用表1 中的引物對cDNA 進行巢式PCR 將VHH 片段進行擴增并與pMECS 噬菌粒載體進行連接；用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到TG1 大腸桿菌中（條件為：電壓1 800 V，電阻200 Ω，電容25 μF，時間恒定值在4.5～5.5 ms 之內(nèi)）；用SOC 培養(yǎng)基進行復(fù)蘇1 h，吸出10 μL 細菌懸液加入到990 μL 37 ℃預(yù)熱的SOC 培養(yǎng)基中，混勻；取100 μL 涂布在含2%葡萄糖，氨芐抗性的9 cm 直徑LB 平板上（即稀釋103 倍，可進一步梯度稀釋至104 倍、105 倍和106 倍），37 ℃倒置培養(yǎng)過夜后，統(tǒng)計菌落數(shù)用來測噬菌體抗體庫的庫容[13]。將剩下的細菌懸液每200 μL 涂布在1 塊含2%葡萄糖，氨芐抗性的15 cm 直徑LB 平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜；用6 mL LB 培養(yǎng)基潤濕15 cm 直徑LB 平板，用無菌細胞刮將細菌收集到一個100 mL 收菌瓶中；取10 μL 細菌，稀釋200 倍，測量并記錄OD600nm值（擴增倍數(shù)為104 以上）；向收菌瓶中加入1/3 體積的無菌80%甘油，混勻后在保存在-80 ℃; 隨機挑取20 個菌落，從9 cm 直徑LB 平板上，用MP57 引物和GIII 引物進行菌落PCR（如果連接體系中每100 ng 載體的轉(zhuǎn)化效率低于5×105，或插入抗體片段的比例小于75%，則需要重新進行酶切和連接）[14]。

表1 VHH 片段PCR 擴增引物

1.2.5 mGluR5 特異性納米抗體的液相淘選

將M13KO7 輔助噬菌體和文庫菌按20∶1 的量進行混勻，在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育30 min，用3 200 g 離心10 min 棄去多余的噬菌體，再用2×YT/Amp/Kana 培養(yǎng)基，將菌重懸起來過夜培養(yǎng)；次日3 200 g 離心取上清，用1/4 倍體積的PEG/NaCl 沉淀噬菌體0.5 h 后離心棄上清，用PBS 重懸噬菌體后測滴度備用[15]。用含5 μg/mL NeutrAvidin biotinbinding protein 的PBS 4 ℃過夜包被Maxisorp 96 孔板（每孔100 μL），棄去NeutrAvidin，用含1% BSA的Buffer（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl）洗5 次，加入2% BSA 封閉2 h，洗去BSA，實驗組加入5 μg/mL 抑制狀態(tài)的mGluR5 抗原稀釋液封閉30 min（對照組不加抗原），洗去抗原稀釋液，加入1×1012CFU/孔噬菌體稀釋液封閉2 h，洗去噬菌體封閉液，加入25 μg 胰酶消化30 min，加入1/20 體積的4 mg/mL AEBSF 來終止胰酶消化[16]。實驗組/對照組各取10 μL 洗脫噬菌體進行10 倍梯度稀釋，測定Output 噬菌體的滴度。計算特異性結(jié)合的富集率，如需新一輪淘選，過程同上[17]。

1.2.6 mGluR5 特異性納米抗體的鑒定

從最后一輪淘選的TG1 大腸桿菌中隨機挑選單克隆制備母板，從制備的母板中吸取20 uL～1 mL的2×YT/Amp 刻培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃培養(yǎng)5 h后加入IPTG 進行過夜誘導(dǎo)表達納米抗體[18]。用含5 μg/mL NeutrAvidin biotin-binding protein 的PBS 4℃過夜包被Maxisorp 96 孔板（每孔100 μL），次日將菌液離心后棄去上清，每孔加入100 uL 的PBS進行反復(fù)凍融裂解細菌，離心后取上清備用；用含1% BSA 的buffer（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl）將過夜包被的96 孔板洗5 次，加入2% BSA封閉2 h，洗去BSA，加入5 μg/mL 抑制狀態(tài)的mGluR5 抗原稀釋液封閉30 min；洗去未結(jié)合的抗原，加入備用的納米抗體孵育1 h，加入Mouse Anti-HA-tag Antibody 稀釋液孵育1 h；洗去一抗加入HRP Goat Anti-mouse IgG（H+L）稀釋液孵育1 h，洗去二抗采用ELISA-TMB 顯色試劑盒進行顯色[19]。用SpectraMax M5 Microplate reader 在450 nm 處讀取光吸收值，將吸收值大于對照組3 倍以上的納米抗體進行測序，用Vector NTI 軟件對堿基序列進行分析[20]。

2 結(jié)果討論

2.1 mGluR5 真核表達載體的構(gòu)建

mGluR5 片段大小為2 529 bp，將mGluR5 片段進行PCR 擴增后，用1%的凝膠進行電泳驗證結(jié)果（圖1a）與目的條帶相符合，將mGluR5 片段構(gòu)建到CMV-Flag 載體中（圖1b），進行菌落PCR 驗證的結(jié)果（圖1c）。

2.2 mGluR5 的表達純化

將蛋白表達后融膜進行純化，用Superose 6，10/300 GL 柱進行分離（圖2a），將鋒尖蛋白跑SDSPAGE 凝膠電泳確認蛋白大小，確認鋒尖蛋白為目的蛋白（圖2c），經(jīng)吸附過后A835 包裝后的蛋白過superose 6 柱子（圖2b）進行分離，將鋒尖蛋白跑SDS-PAGE 凝膠電泳進行確認（圖2d），確認鋒尖蛋白為目的蛋白收集峰尖蛋白，將濃縮至一定濃度，加甘油分裝凍存。

2.3 噬菌體展示抗體庫的構(gòu)建及庫容的測定

對分離后的淋巴細胞總RNA 進行提取，RNA提取結(jié)果如圖3a，用巢式PCR 對250～500 bp 之間的VHH 片段進行擴增（圖3b），將擴增后的片段插到pMECS 噬菌粒載體中，通過電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TG1 電感受態(tài)細胞中，進行噬菌體展示抗體庫的構(gòu)建；通過測量大腸桿菌轉(zhuǎn)化的效率對庫容進行計算5.47×108CFU/mL，陽性率為95%（圖3c）。

2.4 mGluR5 特異性納米抗體的液相淘選

利用抑制狀態(tài)的mGluR5 對構(gòu)建的噬菌體展示抗體庫進行液相淘選，經(jīng)過兩輪的富集淘選，實驗組比對照組的富集度達到了30 倍（圖4a），用最后一輪洗脫的噬菌體侵染TG1 大腸桿菌，按合適的倍數(shù)進行稀釋，涂布到150 mm 的2×YT/Amp/Glu 平板上，隨機挑取190 個單克隆進行納米抗體的粗表達，通過Elisa 進行驗證結(jié)合，淘選出12 個讀數(shù)較高的納米抗體，用Vector NTI 對納米抗體進行序列分析（圖4b）。

3 討論

純化出抑制狀態(tài)的mGluR5，通過免疫雙峰駝構(gòu)建了庫容為5.47×108CFU/mL 陽性率為95%的噬菌體文庫，并通過噬菌體展示技術(shù)，篩選出了12 個不同的陽性克隆。本研究獲得的高親和力納米抗體可以為研究mGluR5 蛋白的性質(zhì)和介導(dǎo)的信號通路提供很好的納米抗體工具，為mGluR5 的深層次研究奠定了基礎(chǔ)。

mGluR5 是信號通路中的一個重要蛋白，調(diào)控著眾多信號傳導(dǎo)，通過作用于它，可以治療很多相關(guān)疾病，順利構(gòu)建純化出人的抑制型mGluR5 蛋白；利用包裹A8-35 的方法對蛋白進行生物素化，很好地避免了淘選時對蛋白表位的遮擋，通過多次液相淘選，可以篩選出各個表位、高親和力的納米抗體。傳統(tǒng)的抗體體積都比較大，納米抗體具有體積小特異性強等特點，可以更好地與mGluR5 蛋白結(jié)合并且減少對蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響；筆者成功免疫雙峰駝篩選出抑制型mGluR5 蛋白的納米抗體，為后續(xù)研究mGluR5 奠定了基礎(chǔ)。

mGluR5 蛋白是一個很有潛力的靶點，直接作用于它是比較困難的，現(xiàn)有的一些激動劑或抑制劑都有一定的局限性，可以通過改造與mGluR5 蛋白特異性結(jié)合的納米抗體來間接作用于它，開發(fā)和運用一些具有高選擇性的激動劑和拮抗劑。這為研究mGluR5 蛋白的性質(zhì)和介導(dǎo)的信號通路提供了方法，可以推動mGluR5 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新思路，最終能夠達到治療疾病的目的。