陳燕枝,于海勝,汪 煒,李 萱,張可麗,方義湖

心源性猝死(sudden cardiac death, SCD)是指由各種心臟原因引起的自然死亡,其特點是發(fā)病突然、進(jìn)展迅速、死亡發(fā)生在癥狀出現(xiàn)后1 h內(nèi)。SCD常見的病因有冠狀動脈病變(如冠心病)、心肌病變、心臟瓣膜病、先天性心臟病等[1]。早期心肌缺血(early myocardial ischemia, EMI)指猝死者在心肌缺血發(fā)生后6 h內(nèi)死亡,無典型病理變化。致命性心律失常、冠狀動脈痙攣導(dǎo)致的SCD,通常亦無典型心臟及血管病理變化,常較難發(fā)現(xiàn),如何準(zhǔn)確、客觀地診斷無典型病變SCD一直是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。尸檢數(shù)據(jù)表明,大多數(shù)SCD冠狀動脈病變并不十分嚴(yán)重,心肌缺血損傷不明顯,某些病理改變似乎不足以引起心肌梗死[2-4]。目前,SCD的法醫(yī)診斷主要依據(jù)冠狀動脈及心臟的形態(tài)學(xué)變化,包括冠狀動脈病變、心肌組織改變、各器官是否淤血等。對無明顯冠狀動脈和心肌病變的病例,主要通過排除其他死亡原因(如機械性窒息、急性中毒等)來做出診斷[5]。在實際法醫(yī)鑒定工作中,許多SCD與異常窒息、溺水、急性中毒、藥物過敏等的鑒別困難,血液生化指標(biāo)檢測、形態(tài)病理學(xué)檢查和免疫組化檢測等綜合應(yīng)用可顯著提高無典型病變SCD診斷的客觀性、準(zhǔn)確性和可靠性。本文對生物化學(xué)標(biāo)志物、病理學(xué)形態(tài)、組織特殊染色技術(shù)和免疫組化在無典型病變SCD法醫(yī)學(xué)診斷中的用途、特點和局限性進(jìn)行綜述,旨在提高無典型病變SCD法醫(yī)病理學(xué)診斷的客觀性、準(zhǔn)確性。

1 生化指標(biāo)檢測

心肌細(xì)胞損傷表現(xiàn)為輕度和重度,前者是可逆的,主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變,心肌細(xì)胞胞質(zhì)中可溶物質(zhì),如肌紅蛋白(Mb)和肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)滲透至心肌細(xì)胞外[6]。當(dāng)心肌持續(xù)性損傷,心肌細(xì)胞的肌原纖維出現(xiàn)損傷,就會變成重度損傷,即不可逆的心肌細(xì)胞壞死,這時可導(dǎo)致肌鈣蛋白(cTn)等肌原纖維蛋白成分從心肌細(xì)胞中流出[7]。因此,檢測心肌細(xì)胞質(zhì)的可溶性成分和肌原纖維蛋白成分,可以反映心肌損傷的程度和性質(zhì)[8]。cTn的特異性較高,在急性心肌梗死發(fā)生4～8 h后血液中cTn逐漸升高,8～16 h達(dá)到高峰。Mb在急性心肌梗死時出現(xiàn)最早,4～8 h達(dá)到高峰,24 h后可恢復(fù)到正常。需注意的是,嚴(yán)重的休克、廣泛的創(chuàng)傷、心肌炎、急性感染時,Mb也可以升高。

1.1 CK-MBCK-MB曾被認(rèn)為是診斷心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”,已廣泛應(yīng)用于心肌梗死的臨床診斷。研究表明[9],在機械性創(chuàng)傷、一氧化碳中毒、冰毒中毒等解剖病例中,心臟和外周血中均可檢測到CK-MB升高,表明CK-MB對心肌細(xì)胞的特異性作用相對有限。

1.2 cTnTcTnT是一種完全心肌細(xì)胞特異性鈣調(diào)蛋白,僅少量存在骨骼肌,可作為心肌梗死診斷的首選標(biāo)志物。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn),尸體血清(左右心腔、外周血)和心包液中cTnT的升高程度取決于死亡時心肌壞死范圍,同時與死亡時間有關(guān),死亡后12 h血液和心包液中cTnT濃度低于死后12～48 h。

1.3 cTnIcTnI是心臟肌原纖維的結(jié)構(gòu)蛋白,被認(rèn)為是心肌壞死的“金標(biāo)準(zhǔn)”,可以檢測微小的心肌損傷[11]。當(dāng)心肌細(xì)胞膜完整時,cTnI不能或較少能穿透細(xì)胞進(jìn)入血流;而當(dāng)心肌細(xì)胞缺血或壞死,cTnI可能會大量釋放到血液中。

1.4 心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)H-FABP是一種低分子量蛋白質(zhì),參與心肌的脂肪酸代謝,其可以評估疾病的預(yù)后。研究證實,H-FABP水平與患者10個月內(nèi)發(fā)生死亡、心肌梗塞或心力衰竭等心血管事件的可能性呈正相關(guān)[12]。H-FABP和cTn聯(lián)合應(yīng)用,可能會提高SCD的預(yù)測價值。

1.5 B型鈉尿肽(BNP)BNP是心室肌細(xì)胞分泌的一種蛋白,在心衰的診斷中有重要價值,EMI時存在BNP mRNA升高;檢測BNP mRNA可能對鑒別冠狀動脈性猝死和過敏性休克死亡有幫助[12]。

這些標(biāo)志物單一使用可能會存在一些局限性,聯(lián)合使用具有靈敏度高、特異性強、持續(xù)時間長等特性。孫進(jìn)廣等[13]觀察20例心肌梗死患者死后4項血液生化指標(biāo)LDH、cTnI、CK、CK-MB逐漸升高,有助于心肌梗死的診斷及死亡原因鑒定,對早期缺血性心肌病導(dǎo)致的SCD診斷有幫助。中國醫(yī)科大學(xué)[14]公布了一項發(fā)明專利,通過檢測尸體心包液中CK-MB、cTnT、NTproBNP三項生化指標(biāo),與截斷值進(jìn)行比較,用于鑒定缺血性心臟病導(dǎo)致的SCD,此發(fā)明可以提高法醫(yī)學(xué)鑒定SCD的準(zhǔn)確率,具有重大意義。Wang等[15]發(fā)現(xiàn),與單獨使用hs-cTnI相比,聯(lián)合使用hs-cTnI和NT-proBNP對有胸痛癥狀患者的急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)預(yù)測效果更好。

2 大體標(biāo)本染色法

心肌缺血梗死6 h后出現(xiàn)肉眼可見形態(tài)學(xué)變化,無典型病變SCD通常無明顯的形態(tài)學(xué)改變。氯化三苯基四唑(TTC)[16]是呼吸鏈吡啶和核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體,其與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)生成脂溶性紅色甲臜;而在缺血組織中脫氫酶活性降低,無法與之反應(yīng),所以不會有任何變化,表現(xiàn)為蒼白色,TTC染色法在形態(tài)學(xué)改變不明顯標(biāo)本中,廣泛用于測定心肌梗死面積[17]。硝基藍(lán)四氮唑(NBT)染色法浸染心肌組織,缺血、梗死區(qū)呈黑色改變,在心肌組織缺血發(fā)生3 h內(nèi)即出現(xiàn)陽性結(jié)果,該方法簡單、靈敏[18]。

3 HE染色

心肌組織在缺血缺氧損傷條件下,細(xì)胞功能代謝形態(tài)發(fā)生一系列變化,根據(jù)損傷程度表現(xiàn)為可逆性損傷和不可逆性損傷。早期主要以細(xì)胞質(zhì)嗜酸性改變?yōu)橹饕卣?胞質(zhì)顆粒變、細(xì)胞腫脹;梗死后2 h,心肌纖維變?yōu)椴y狀,肌質(zhì)不均;隨后壞死心肌收縮帶和壞死心肌纖維灶出現(xiàn)[19]。這些病變特征為診斷SCD提供依據(jù),但EMI、致命性心律失常、冠狀動脈痙攣導(dǎo)致的SCD因發(fā)病時間短暫,法醫(yī)鑒定標(biāo)本保存方法及時間的不確定性,通常HE染色難以觀察到有特征性的形態(tài)學(xué)改變。

4 組織化學(xué)特殊染色

組織化學(xué)特殊染色是較早用于心肌缺血死后診斷的方法,與免疫組化相比其更經(jīng)濟(jì)實惠,對于無典型病變SCD具有重要指導(dǎo)意義,即通過特定的染料和方法對正常心肌和缺血心肌組織的著色能力不同而呈現(xiàn)不同的結(jié)果。在法醫(yī)鑒定實踐過程中,本團(tuán)隊常用的特殊染色是鐵礬-蘇木精-伊紅(Heidenhain)染色法,將切片脫蠟媒染于5%硫酸鐵銨,蘇木精染色,5%硫酸鐵銨分化(鏡下控制到正常心肌纖維無色為止),伊紅染色。Heidenhain染色示正常心肌細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色,胞核呈灰色,缺血損傷心肌呈灰黑色[20]。劉英坤等[21]在心肌缺血的早期診斷中采用Heidenhain染色,結(jié)果顯示其能將冠心病猝死的缺血心肌染成黑色,且染色效果優(yōu)于HE、蘇木精-堿性復(fù)紅-苦味酸染(HBFP)染色。劉曉宇等[22]研究Heidenhain染色在缺血性心臟病猝死診斷中的應(yīng)用價值,結(jié)果表明Heidenhain染色在診斷CAD-SD中具有較高的敏感性和特異性。畢海濤等[23]通過對HBFP染色、變色酸2R-亮綠染色和Heidenhain染色進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,Heidenhain染色對于早期缺血心肌組織具有更高的穩(wěn)定性和可操作性。朱育連等[20]分別對組織樣本進(jìn)行HE染色、HBFP染色和Heidenhain染色,結(jié)果表明,Heidenhain染色可以清晰顯示EMI的形態(tài)變化,著色面積持續(xù)穩(wěn)定的擴展呈片狀和團(tuán)塊狀分布。因此,Heidenhain染色與HBEP染色、變色酸2R-亮綠染色等多種特殊染色法相比,對于無典型病變早期缺血心肌組織的染色具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、操作簡單、實用等特點,對無典型病變SCD的診斷及鑒別診斷具有重要指導(dǎo)意義。

5 免疫組化染色

心肌組織缺血至壞死呈現(xiàn)動態(tài)的病理變化:(1)心肌細(xì)胞膜損傷和通透性改變;(2)血漿中的特定成分通過受損的毛細(xì)血管壁進(jìn)入細(xì)胞間隙,黏附進(jìn)入到心肌細(xì)胞內(nèi);(3)受到缺血和缺氧刺激,心肌細(xì)胞快速合成特定蛋白質(zhì)分子(正常情況不表達(dá)或低表達(dá))[24]。基于以上三個方面,SCD常用的免疫組化檢測包括細(xì)胞標(biāo)志物:cTnI、cTnT、actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、縫隙連接蛋白(Cx)、Mb、CD59、desmin等;血漿標(biāo)志物:纖維蛋白原(Fg)、纖維連接蛋白(Fn)、補體(C5、C9、C5b-9等);缺血心肌誘導(dǎo)表達(dá)標(biāo)志物:HIF-1α、HIF-2α、VEGF、內(nèi)皮素(ET)、TGF-β1、聚集素蛋白(CLU)、含凝血酶敏感素基序的解聚素樣金屬蛋白酶(ADAMTS)等[24]。這些免疫組化標(biāo)志物在EMI組織、無典型病變心肌組織中均具有敏感性、特異性,隨著心肌壞死時間的延長可達(dá)到高峰。心肌缺血的免疫組化指標(biāo)能否用于法醫(yī)病理學(xué)實踐工作,取決于其特異性和敏感性及組織自溶、腐敗等因素對所檢測抗原的影響,也必須予以考慮。胡丙杰等[25]觀察EMI中死后診斷指標(biāo)desmin、actin(HHF35)、Mb受死后自溶影響,穩(wěn)定性較差,這些指標(biāo)僅適用于新鮮尸體。熊小明等[26]發(fā)現(xiàn)心肌標(biāo)本置于4 ℃保存后,正常心肌組織和缺血心肌組織中cTnT陽性隨著保存時間的延長而趨于下降,14天后完全消失,僅在4 ℃下1～7天內(nèi)缺血心肌與正常心肌之間cTnT陽性反應(yīng)有明顯差異。畢海濤[24]通過不同尸體保存條件對免疫組化標(biāo)志物的影響顯示actin(HHF35)、H-FABP及S100A1穩(wěn)定性最差,C5b-9、Fn、CLU、HIF-1ɑ、HIF-2α、ADAMTS-1均顯示出良好的穩(wěn)定性。龔超[27]通過與正常心肌、疑似梗死區(qū)對比顯示H-FABP和actin(HHF35)對心肌梗死的診斷特異性最差,不宜作為單獨診斷心肌梗死的診斷指標(biāo),CLU、Fn、C5b-9、HIF-1α和ADAMTS-1對心肌梗死的診斷價值較高,但也可在休克、煤氣中毒、電擊死亡等案例死亡者中表達(dá)。

鑒于法醫(yī)實踐中案件的復(fù)雜性,不僅要考慮到免疫組化指標(biāo)的敏感性、特異性,還需考慮到尸體保存及組織自溶等一些不可避免的因素。因此在法醫(yī)實踐過程中,我們力求尋找相對穩(wěn)定且敏感的指標(biāo),同時將多種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于SCD的死后診斷,尤其是無典型病變SCD的死后診斷。劉志峰等[28]在43例病理尸檢標(biāo)本中檢測到細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子-1(SOCS-1)和原癌基因蛋白(C-JUN),結(jié)果顯示SOCS-1和C-JUN均高于對照,且SOCS-1和C-JUN的表達(dá)量呈正相關(guān),兩者均可能參與SCD的發(fā)病機制,可作為法醫(yī)學(xué)鑒定SCD的重要指標(biāo)。Cao等[29]研究結(jié)果表明,BNP的分子病理學(xué)可用于SCD的終末期心功能測定,并在法醫(yī)實踐中分析其致死機制。李國良等[30]選擇20例因心血管系統(tǒng)疾病猝死者的心臟標(biāo)本,觀察SCD心肌組織中miR-17、HIF-1α和STAT3的表達(dá)水平,結(jié)果顯示miR-17和HIF-1α高表達(dá),STAT3弱表達(dá),HIF-1α和STAT3聯(lián)合使用將成為診斷SCD的客觀指標(biāo)。

6 其他檢測技術(shù)的應(yīng)用

6.1 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)成像技術(shù)和紅外圖像分析技術(shù)FTIR與紅外顯微鏡技術(shù)的聯(lián)用,即FTIR成像技術(shù),實現(xiàn)了將顯微觀察與紅外光譜測定的有機結(jié)合,又稱分子化學(xué)光譜成像技術(shù),利用光譜成像軟件,收集捕獲人體細(xì)胞組織中核酸(DNA和RNA)、蛋白質(zhì)、雙層磷脂膜等聚合物,形成不同像素的光譜信息[31-33]。紅外圖像分析技術(shù)是在FTIR成像技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的微區(qū)分析技術(shù),通過紅外圖像的不同色差來區(qū)分不同的組織細(xì)胞,能直觀顯示組織病理改變。建立組織光譜成像圖和組織病理的關(guān)系,最終用于疾病的分子診斷。鄭娜等[34]收集20例因缺血性心臟病猝死者(均含有陳舊性心肌梗死病灶)的心臟樣本,檢測分析顯示梗死區(qū)心肌頻譜大于鄰近非梗死區(qū)峰高Ⅰ/酰胺Ⅱ峰高增加,酰胺Ⅲ吸收峰出現(xiàn)峰位置、峰展寬和峰強度藍(lán)移下降,說明與未損傷心肌組織相比,心肌梗死后陳舊組織的蛋白質(zhì)含量和成分各不相同。Titus等[35]招募疑似急性冠脈綜合征患者,采用紅外光譜成像技術(shù)無創(chuàng)檢測cTn表達(dá)水平。

6.2 基于尸體影像學(xué)檢查的法醫(yī)虛擬解剖技術(shù)隨著醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的發(fā)展,為法醫(yī)檢查提供了一種無創(chuàng)/微創(chuàng)的尸檢方式——法醫(yī)虛擬解剖技術(shù),該技術(shù)采用數(shù)字成像技術(shù),主要包括CT和MRI作為主要診斷手段,獲取尸體表面和內(nèi)部的詳細(xì)成像數(shù)據(jù),由放射科醫(yī)師創(chuàng)建完整的三維圖像,然后由法醫(yī)通過圖像分析檢查骨骼、軟組織、氣管和血管,尋找死亡原因和方式的線索[36]。此前即有將尸檢CT血管造影(postmortem CT angiography, PMCTA)和尸檢磁共振成像(postmortem magnetic resonance imaging, PMMRI)用于AMI死后診斷的報道[37]。Grabherr等[38]和Saunderst等[39]先后建立了死后血管的PMCTA測試方法成像基礎(chǔ)知識。Michaud等[40]使用該技術(shù)研究了23例缺血性心臟病死亡尸體,78%(18/23)冠狀動脈發(fā)生鈣化,與傳統(tǒng)CT相比,其更易顯示病變血管的狹窄或閉塞程度,該技術(shù)是顯示死后冠狀動脈形態(tài)學(xué)的有效工具,并且Michaud等[41]最近提出尸檢成像技術(shù)(postmortem imaging, PMI)的侵入性技術(shù),在圖像引導(dǎo)下進(jìn)行心肌或主動脈活檢,進(jìn)一步完善心血管系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的死亡后診斷。

Jackowski等[42]利用PMMRI技術(shù)發(fā)現(xiàn),20例SCD病例中,19例有心臟損傷,其中13例經(jīng)后續(xù)組織學(xué)檢查(慢性、亞急性和急性梗死)證實;余6例肉眼觀察和組織學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,但PMMRI檢測到超急性損傷。這一研究結(jié)果表明PMMRI技術(shù)可檢測慢性、亞急性和急性病變,可能揭示傳統(tǒng)組織學(xué)無法檢測到的心肌超急性缺血性損傷。PMMRI技術(shù)被證實可以檢測冠狀動脈中形成的血栓[43];Ruder等[44]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在心肌梗死的PMMRI研究中,化學(xué)位移偽影的出現(xiàn)是檢查血管開放的標(biāo)志,而雙暗帶(成對的暗帶)現(xiàn)象表明檢查的血管變窄,這一發(fā)現(xiàn)將被有助于提高PMMRI對AMI病例的死亡后診斷能力。馬龍達(dá)等[45]通過CT虛擬解剖與尸檢結(jié)果對比分析3例,發(fā)現(xiàn)在交通事故死亡案例中,兩者結(jié)論較為一致:在SCD情況下,虛擬解剖提供的信息價值有限。該研究表明,虛擬解剖在交通事故案件中具有較高的應(yīng)用價值,在SCD病例的鑒定方面仍有改進(jìn)的空間。

6.3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)1994年澳大利亞科學(xué)家Wilkins和Williams提出了“蛋白質(zhì)組學(xué)”這一名詞。蛋白質(zhì)組學(xué)(pro-teomics)是蛋白質(zhì)組概念的延伸,是在一般水平上研究蛋白質(zhì)組學(xué)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能和運作的科學(xué)。隨著人類基因組計劃的結(jié)束,生命科學(xué)進(jìn)入了一個新時代,后基因組時代,蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為功能基因組研究的主要內(nèi)容之一[46-47]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段有雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等,Zhang等[48]采用質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠冠狀動脈15 min后血清中即出現(xiàn)7 564、7 586 Da兩個特異性的蛋白峰,而缺血心肌組織中則出現(xiàn)6 304、8 337、8 376 Da三個特異性的蛋白,它是最早檢測到的蛋白質(zhì)標(biāo)志物,有望用于臨床心肌缺血的早期診斷和法醫(yī)學(xué)SCD的診斷。Wang等[49]鑒定了一系列在線粒體功能障礙和代謝途徑中起關(guān)鍵作用的蛋白,這些蛋白在AMI心肌代謝重塑中的作用有待進(jìn)一步研究。越來越多的蛋白標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn),為尋找新的免疫組化指標(biāo)為SCD法醫(yī)診斷提供理論依據(jù),蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也更多、更系統(tǒng)的應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)研究當(dāng)中。

7 結(jié)語

SCD的診斷對于臨床和法醫(yī)學(xué)都具有重要意義。SCD發(fā)生突然,原因多樣,猝死機制復(fù)雜,尤其在心臟及冠狀動脈無明顯病理變化的猝死案例中一直是法醫(yī)實踐過程中的難點,單純依靠尸檢和簡單的病理學(xué)方法確定死因非常困難并缺乏說服力。結(jié)合我國冠心病患者冠狀動脈病變程度較歐美國家輕的特點,青年SCD案例不斷增長、法醫(yī)實踐等情況,如果尸檢顯示死者冠狀動脈狹窄不明顯,心臟無明顯的病理改變,可將不同的檢查方法系統(tǒng)化用于法醫(yī)工作,檢測敏感穩(wěn)定的生物化學(xué)標(biāo)志物、應(yīng)用大體標(biāo)本染色法、仔細(xì)尋找HE染色病變特征,輔助組織化學(xué)特殊染色技術(shù)、聯(lián)合特異性免疫組化標(biāo)志物檢測等,在充分排除暴力、中毒和其它自然疾病導(dǎo)致死亡后,結(jié)合案情可診斷為SCD。