李趣嫦，江艷芳，賴(lài)珊

廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基為藥品無(wú)菌檢查法中用于培養(yǎng)厭氧菌和需氧菌的培養(yǎng)基。查閱《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2015、2020年版［1-2］及相關(guān)文獻(xiàn)［3-6］，藥品無(wú)菌檢查一般采用直接接種法和薄膜過(guò)濾法兩種方法。直接接種法為取規(guī)定量供試品接種至裝量不少于15 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行培養(yǎng)觀察。薄膜過(guò)濾法則是取規(guī)定量供試品，用一次性封閉式薄膜過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾沖洗，濾干后在薄膜過(guò)濾器里加入體積為100 mL 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)觀察。本文研究5 種細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和洋蔥伯克霍爾德菌）在一次性封閉式薄膜過(guò)濾器與試管的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)是否存在差異，旨在為檢測(cè)機(jī)構(gòu)和藥品生產(chǎn)廠家提供參考，更好地監(jiān)測(cè)和保障無(wú)菌檢查的科學(xué)性和真實(shí)性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BRE240 型生化培養(yǎng)箱（法國(guó)Froilabo 公司）；Thermo Scientific 1300 Series A2 型生物安全柜（美國(guó)賽默飛世爾科技）；Lab dancer 漩渦混合器(德國(guó)IKA 艾卡集團(tuán)）；WJ-6 無(wú)菌檢查儀（天津羅根科技）；NS01-3 型一次性封閉式薄膜過(guò)濾器（北京牛牛科技）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10 104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)［CMCC（B）63 501］、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64 941］和洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）［CMCC（B）23 005］均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：1086401)、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號(hào)：1091325)、胰酪大豆胨瓊脂(批號(hào)：2002202)均購(gòu)自北京三藥科技有限公司；哥倫比亞瓊脂養(yǎng)基(批號(hào)：1082711)購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 試藥

自編號(hào)1～8 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家及批號(hào)分別為：1.北京三藥科技有限公司，1 091325；2.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1 095281；3.北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司，201110；4.青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，20 201107；5.北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，20 201208；6.北京陸橋技術(shù)股份有限公司，201107；7.Becton，Dickinson and Company，0 048064；8.默克股份兩合公司，654833。培養(yǎng)基1～8 均為脫水培養(yǎng)基。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和洋蔥伯克霍爾德菌的新鮮培養(yǎng)物，按照《中國(guó)藥典》2020 年版制備成濃度為10～100 cfu/mL 的菌懸液；取上述菌懸液，按十倍稀釋法稀釋制成1～10 cfu/mL 的菌懸液。

2.2 菌液的計(jì)數(shù)

取上述制備好的濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 的各菌懸液各1 mL 注入平皿中，其中接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和洋蔥伯克霍爾德菌菌懸液的平皿傾注胰酪大豆胨瓊脂，置32.5 ℃培養(yǎng)；接種生孢梭菌菌懸液的平皿傾注哥倫比亞瓊脂，置32.5 ℃厭氧培養(yǎng)，平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定各菌懸液的菌落數(shù)（表1）。

表1 菌液計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 生長(zhǎng)情況檢查

實(shí)驗(yàn)前先測(cè)量各廠家培養(yǎng)基的氧化層高度和培養(yǎng)基的總高度，計(jì)算二者比值，結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》2020 年版的規(guī)定（表2）。然后取一次性薄膜過(guò)濾器，分別加入8 個(gè)廠家的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，裝量為100 mL、50 mL；另取無(wú)菌試管，加入上述培養(yǎng)基，裝量為15 mL。各廠家的培養(yǎng)基每個(gè)不同的裝量各制備21 支，分別接種濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和洋蔥伯克霍爾德菌的菌懸液，各菌株兩個(gè)濃度各接種2 管，另取1 管不接種作為空白對(duì)照，置32.5 ℃培養(yǎng)3 d，每株菌共4 管均生長(zhǎng)良好判為該培養(yǎng)基通過(guò)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，以保證實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。

表2 氧化層測(cè)量結(jié)果

2.4 結(jié)果

一次性薄膜過(guò)濾器裝量50 mL 及試管裝量15 mL，菌懸液濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 中，5 種細(xì)菌在規(guī)定時(shí)間內(nèi)均生長(zhǎng)良好；一次性薄膜過(guò)濾器裝量100 mL，菌懸液濃度為10～100 cfu/mL，5 種細(xì)菌在規(guī)定時(shí)間內(nèi)也均生長(zhǎng)良好。而在一次性薄膜過(guò)濾器裝量100 mL，菌懸液濃度為1～10 cfu/mL的生長(zhǎng)檢查中，8 批次中有2 批次的銅綠假單胞菌不生長(zhǎng)（表3），有3 批次的枯草芽孢桿菌不生長(zhǎng)（表4）。

表3 銅綠假單胞菌（1～10 cfu/mL）生長(zhǎng)情況結(jié)果

表4 枯草芽孢桿菌（1～10 cfu/mL）生長(zhǎng)情況結(jié)果

3 討論

在本研究中，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)除了使用《中國(guó)藥典》2020 版中靈敏度檢查規(guī)定的3 個(gè)菌株外，還加入了枯草芽孢桿菌和洋蔥伯克霍爾德菌，原因?yàn)榭莶菅挎邨U菌屬于芽孢桿菌類(lèi)細(xì)菌，該類(lèi)細(xì)菌在生長(zhǎng)環(huán)境不利的條件下可轉(zhuǎn)為芽孢，污染藥品后很難對(duì)其殺滅；而洋蔥伯克霍爾德菌為條件致病菌，為最近幾年研究熱點(diǎn)，易在制藥行業(yè)中水系統(tǒng)生存，藥品生產(chǎn)中易受到其污染［7-10］，故增加這兩株菌作為生長(zhǎng)檢查的挑戰(zhàn)菌株。

在本研究結(jié)果中，5 種細(xì)菌在一次性薄膜過(guò)濾器裝量為100 mL，菌懸液濃度為1～10 cfu/mL 的生長(zhǎng)檢查中，8 批次培養(yǎng)基中有2 批次的銅綠假單胞菌不生長(zhǎng)，有3 批次的枯草芽孢桿菌不生長(zhǎng)，通過(guò)率為38%。而在試管裝量為15 mL，菌懸液濃度為1～10 cfu/mL 的生長(zhǎng)檢查通過(guò)率為100%。所有廠家的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基按照藥典方法，用試管裝量為15 mL 做生長(zhǎng)檢查試驗(yàn)，菌懸液濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 均能全部通過(guò)，說(shuō)明所有廠家的培養(yǎng)基質(zhì)量是符合現(xiàn)行藥典規(guī)定。故結(jié)果存在差異主要原因分析為：一次性薄膜過(guò)濾器裝量為100 mL 與其裝量為50 mL 和試管裝量為15 mL 的培養(yǎng)基用量和高度不一致，裝量為15 mL 的試管和裝量為50 mL 過(guò)濾器的培養(yǎng)基的容器內(nèi)部空氣含量較大，含氧總量比裝量為100 mL 的過(guò)濾器多；且裝量為15 mL 的試管和裝量為50 mL 過(guò)濾器的培養(yǎng)基的體積較少，培養(yǎng)基的氧化層更容易受到氧氣的影響。而硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基會(huì)根據(jù)含氧量調(diào)節(jié)氧化層，從而導(dǎo)致培養(yǎng)系統(tǒng)不一致。這可從裝量為100 mL 的一次性薄膜過(guò)濾器生長(zhǎng)檢查不通過(guò)的菌株為需氧菌類(lèi)的枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌可推斷。故在使用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基時(shí)按實(shí)際選取恰當(dāng)?shù)娜萜骺疾炱渖L(zhǎng)，必要時(shí)增加產(chǎn)品易受污染的菌株或環(huán)境分離的菌株考察其生長(zhǎng)情況，以降低無(wú)菌檢查中硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基假陰性出現(xiàn)的概率。