趙玉泉 韓吳琦 張 峰 李習(xí)瑩 謝曉燕

（開封市食品藥品檢驗(yàn)所，開封 475000）

阿托伐他汀鈣片是最常用的降脂藥物之一，以2017～2019年度天津某醫(yī)院數(shù)據(jù)統(tǒng)計為例，在降脂類藥物中，立普妥用量連續(xù)3年呈逐年上升趨勢[1]。近年來，市場監(jiān)管部門屢次發(fā)現(xiàn)制售假冒立普妥的案例，嚴(yán)重?fù)p害了患者的利益，給藥品安全造成危害。目前，市場監(jiān)管定性判定真假藥品通常采用高效液相色譜法，存在預(yù)處理麻煩、使用大量的有機(jī)試劑、對環(huán)保不友好等問題，大規(guī)模篩查偽品耗費(fèi)時間長，無法滿足藥品現(xiàn)場快速檢測的需求[2]。

近紅外技術(shù)是一種簡便快速的綠色分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于制藥、農(nóng)業(yè)、食品以及醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域[3-7]。近紅外光譜是物質(zhì)分子指紋圖譜，藥品光譜包含有效成分、輔料以及包裝等所有信息，是藥品檢驗(yàn)、藥物鑒定中一種有效手段，也用于檢測藥品中非法添加成分、原料污染或物料配比異常等情況。

本研究運(yùn)用藥品快檢車上的車載傅里葉近紅外光譜儀，采用一致性驗(yàn)證方法建立偽品立普妥鑒別模型，用于快速篩查出偽品立普妥，同時也能準(zhǔn)確區(qū)分不同廠家的阿托伐他汀鈣片，為解決阿托伐他汀鈣片質(zhì)量現(xiàn)場監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑

乙腈，四氫呋喃（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；枸櫞酸銨（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.2 試藥

阿托伐他汀鈣對照品（純度，94.9%，中國食品藥品檢定研究院，批號100590-201804）；收集市售阿托伐他汀鈣片樣品，共70批次，規(guī)格均為10 mg/片，疑似偽品立普妥2批（批號X47646，X88639），藥品來源詳細(xì)見表1。

表1 不同廠家阿托伐他汀鈣片

1.2 儀器與條件

1.2.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（e2695，Waters公司，美國），配DAD檢測器；分析天平（MS205DU，梅特勒-托利多，瑞士）；傅里葉變換近紅外光譜儀（MATRIX-F，布魯克公司，德國），配漫反射光纖探頭附件，光譜處理軟件OPUS 5.0。

1.2.2 儀器條件參數(shù)

（1）液相色譜儀：反相色譜柱C18(5 μm，4.6mm×150 mm, Thermo Syncronis)；流動相：乙腈-四氫呋喃-0.05 mol·L-1枸櫞酸銨溶液（pH值為4.00，27∶20∶53）；檢測波長：244 nm；進(jìn)樣體積均為10μL。

（2）近紅外光譜儀：波數(shù)范圍為4000 cm-1～12000 cm-1，漫反射測定，分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)為32次，環(huán)境溫度：20 ℃～25 ℃，空氣相對濕度：30%～35%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理-高效液相色譜檢測

取適量樣品，混合均勻，研細(xì)，精密稱取（約相當(dāng)于阿托伐他汀鈣10 mg），置100 mL 量瓶中，加混合溶液：乙腈-0.05 mol·L-1枸櫞酸銨溶液（pH 值為7.40，1∶1），溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液備用；取阿托伐他汀鈣對照品約10 mg，精密稱重，加上述混合溶液定容至刻度，作為對照品溶液備用。

1.3.2 鑒別真?zhèn)瘟⑵胀?高效液相色譜法

疑似假冒立普妥樣品采用高效液相色譜法進(jìn)行初篩，參照阿托伐他汀鈣片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（YBH19122005-2014Z）[8]進(jìn)行鑒定。精密吸取對照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，以保留時間定性鑒定。

1.3.3 光譜采集方法

每批次樣品各取7片，用光纖探頭抵住藥片，按設(shè)定參數(shù)采集70批次樣品光譜，共得到490張樣品光 譜。

1.3.4 一致性檢驗(yàn)原理與評價方法

本研究采用一致性檢驗(yàn)的原理進(jìn)行樣品一致性判別，該原理通過計算參考樣品集光譜上每個波長點(diǎn)的漫反射吸光度平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，并以此波長點(diǎn)吸光度的平均值加或減一定倍數(shù)（CI值）的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為該波長點(diǎn)的可信區(qū)間，以CI值作為一致性檢驗(yàn)的限度值；一致性檢驗(yàn)過程是將待測樣品光譜的吸光度值與參考光譜吸光度平均值的差值除以標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，得到該未知樣的一致性指數(shù)CI，即第i個波長點(diǎn)的CI值：

在譜段內(nèi)所有波長點(diǎn)的吸光度總體上達(dá)到0.9999 概率下均不超限度，CI 值在Excel中的計算命令是TINV( ( 1～0. 9999 ^( 1 /a) ) ，( b-1) ) ，式中a是波長點(diǎn)數(shù)，b是參考光譜數(shù)量)[9]。

該待測樣CI與參考光譜集CI限度值進(jìn)行比較，判定待測樣光譜與參考光譜是否一致；如CI值≤CI限度值，則表示通過一致性檢驗(yàn)；如CI值＞CI限度值，則判定樣品不一致。不同波長點(diǎn)CI值不同，一般取重要波長范圍建立模型，也可以采用全光譜范圍來建模，以最大CI值（最大一致性指數(shù)max CI值）來進(jìn)行比較，判斷是否滿足上述條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜法鑒定真?zhèn)伟⑼蟹ニ♀}

圖1為阿托伐他汀鈣對照品、立普妥（批號8173）、2個疑似偽品立普妥以及其他廠家制劑優(yōu)力平的液相色譜圖。從圖中看出，阿托伐他汀鈣對照品和真品立普妥以及優(yōu)力平樣品中的有效成分色譜保留時間均在15.92 min附近，而偽品立普妥在該保留時間未出峰，依此確定兩個疑似樣品是偽立普妥。

圖1 阿托伐他汀鈣對照品和真?zhèn)瘟⑵胀讟悠芬合嗌V圖

2.2 近紅外光譜法快速鑒別真?zhèn)瘟⑵胀?/h3>

2.2.1 真?zhèn)瘟⑵胀椎慕t外光譜

圖2 為真、假樣品的近紅外光譜，從圖2可以看出，立普妥真品在4029 cm-1、4764 cm-1、5175 cm-1附近有強(qiáng)吸收峰，而偽品在5715 cm-1和6861 cm-1有兩個尖銳吸收峰，光譜差異較大，光譜特征明顯不同，因此可以通過圖譜比對直觀區(qū)別真、假立普妥。但是考慮到監(jiān)管一線使用人員識別近紅外光譜存在一定的困難，為了方便使用，提高方法的可靠性，本研究采用一致性原理建立了算法模型判定的方法。

圖2 真、偽品立普妥近紅外光譜圖

2.2.2 建立真?zhèn)瘟⑵胀椎慕t外光譜判別方法

（1）光譜預(yù)處理

由于近紅外光譜峰形較鈍、重疊嚴(yán)重，且含有目標(biāo)成分外其它成分的信息，例如輔料、光的散射、雜散光和噪聲等，這些因素導(dǎo)致光譜圖基線漂移，影響光譜的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。對光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，能夠降低或者消除無關(guān)信息和噪聲對光譜的影響[10]。不同樣品在9000 cm-1～7400 cm-1、7000 cm-1～5600 cm-1、5100 cm-1～4000 cm-1區(qū)域吸收峰有明顯區(qū)別，而且這3個譜段分別是CH、NH和OH的合頻和倍頻吸收，信息量豐富，所以建模時選取這3個波段。

本研究選擇一階導(dǎo)數(shù)（17點(diǎn)）結(jié)合矢量歸一化預(yù)處理方法，不同廠家阿托伐他汀鈣片（真品）光譜處理后如圖3所示，從圖中可以看出，經(jīng)過預(yù)處理后，不同樣品光譜基線基本重疊，光譜一致性較好。

圖3 不同廠家阿托伐他汀鈣片特征光譜（一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化）

（2）鑒別一致性驗(yàn)證模型建立與驗(yàn)證

將樣品光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)（17點(diǎn)）結(jié)合矢量歸一化預(yù)處理后，建立一致性模型。以15批次立普妥樣品共計105張光譜作為參考集，建立一致性驗(yàn)證模型，將其他4個廠家（55批次）阿托伐他汀鈣制劑樣品共計385張光譜作為驗(yàn)證集，驗(yàn)證結(jié)果見圖4。建模選取9000 cm-1～7400 cm-1、7000 cm-1～5600 cm-1、5100 cm-1～4000 cm-13個譜段，在分辨率為8 cm-1時共計512個波長點(diǎn)，參考光譜為105張，根據(jù)1.3.4中計算公式得到CI值應(yīng)設(shè)定為5.6。從圖上可以看出其他4個廠家55批次樣品光譜的CI 值都大于5.6但小于30.7，差異明顯，分離效果良好。將2批次偽品立普妥共14張光譜作為未知樣，一致性結(jié)果見圖5，CI值遠(yuǎn)大于5.6，也遠(yuǎn)大于30.7，明顯異于參考光譜，模型判別該樣品為偽品立普妥，該結(jié)果與高效液相色譜判定的一致。

圖4 不同廠家阿托伐他汀鈣片模型驗(yàn)證結(jié)果橫坐標(biāo)為光譜數(shù)量，縱坐標(biāo)為最大CI 值

圖5 偽品立普妥判別結(jié)果橫坐標(biāo)為光譜數(shù)量，縱坐標(biāo)為最大CI 值2.2.4討論

2.2.3 討論

本研究建模針對的是特定廠家、特定規(guī)格的產(chǎn)品，進(jìn)一步研究可以收集更多不同廠家的各種規(guī)格的制劑，調(diào)整模型參數(shù)，優(yōu)化模型使其應(yīng)用范圍更廣。另外也可以嘗試建立近紅外光譜定量模型，用來快速測定阿托伐他汀鈣制劑的含量均勻度或溶出度項(xiàng)目。

3 結(jié)論

針對偽品立普妥包裝、藥片性狀上與真品無明顯差異，執(zhí)法人員難以從外觀上判斷真假的問題，采用近紅外光譜法建立了真?zhèn)瘟⑵胀滓恢滦詸z驗(yàn)?zāi)Ｐ?，模型對偽品立普妥鑒別的正確率為100%，對兩個偽品立普妥判別結(jié)果與液相色譜法一致，結(jié)果表明近紅外光譜法可以快速鑒別出偽品立普妥，且方法簡便快速，檢測成本低，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場無損檢測，大大提高藥品流通市場監(jiān)管工作時效性，為凈化藥品市場提供了有力的技術(shù)支撐。