徐正康 戴曉港 陳贏男

（林木遺傳育種國家重點實驗室 現(xiàn)代南方林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室 江蘇省林木遺傳和高效培育重點實驗室 南京林業(yè)大學 南京 210037）

玉蘭屬（Yulania）樹種，即原木蘭科（Magnoliaceae）木蘭屬（Magnolia）玉蘭亞屬（subgen. Yulania）植物（傅大立，2001），是中國最具傳統(tǒng)特色的觀賞花木之一，其花形多姿、花色多變、芳香典雅，被廣泛應用于園林景觀和園林綠化。此外，玉蘭屬樹種也是重要的藥用及香料植物，其干燥花蕾既可入藥（統(tǒng)稱“辛夷”）又可作為名貴香料原料，具有較高的經(jīng)濟價值。近年來玉蘭產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，種植規(guī)模、經(jīng)濟產(chǎn)值和從業(yè)人員逐年提高，以“中國玉蘭之鄉(xiāng)”河南省南召縣為例，2014 年南召縣玉蘭種植面積達1.79 萬hm2；產(chǎn)值達到18.7 億元（周虎等，2015）。在玉蘭產(chǎn)業(yè)蓬勃的同時，也出現(xiàn)了品種繁多名稱混亂、缺乏科學管理等問題。確保花木優(yōu)良品種種苗的真實性，是玉蘭產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展的基礎，建立一套便捷、快速、可靠的玉蘭良種鑒定技術，對于監(jiān)督種苗生產(chǎn)、新品種認定，以及保護育種工作者知識產(chǎn)權具有重要意義。

傳統(tǒng)的特異性、一致性和穩(wěn)定性（distinctness,uniformity and stability，DUS）測試是建立在觀察和測量部分植物表型基礎上，雖然受環(huán)境影響小、測試條件簡單可靠、適宜描述質(zhì)量性狀，但周期長、效率低、質(zhì)量難控制等問題。分子標記技術及構建DNA 指紋圖譜為DUS 測試提供強有力的輔助工具，并已成為一套完整的植物新品種保護測試技術體系不可或缺的一部分（李曉輝等，2003）。微衛(wèi)星（simple sequence repeat, SSR）標記技術，因其具有操作簡單、穩(wěn)定、靈敏、檢測多態(tài)性強等優(yōu)點，成為品種一致性和特異性檢驗以及植物新品種測試中應用最廣泛的標記技術（鐘海豐等，2017）。目前，我國對玉蘭屬植物的研究主要集中在傳統(tǒng)分類學、化學成分分析（傅大立等，2005）以及繁育等方面（王藝等，2019），仍缺少豐富的分子標記資源和準確的DNA 指紋圖譜信息。

望春玉蘭（Magnolia biondii）是玉蘭屬中優(yōu)良的早春觀花樹種，也是辛夷植物中栽培面積最大和藥用質(zhì)量最好的樹種（傅大立等，2003），具有觀賞、藥用、香料和用材等用途，是珍貴的多功能經(jīng)濟樹種。中國科學院仙湖植物園研究團隊首次發(fā)布了高質(zhì)量的望春玉蘭基因組信息（Donget al., 2021），為挖掘和開發(fā)SSR 標記提供了寶貴的序列信息?；谝压嫉耐河裉m全基因組序列，本研究對其微衛(wèi)星位點進行搜索，分析了微衛(wèi)星的序列特征、分布和組成等信息，在此基礎上設計和開發(fā)SSR 特異性引物，并構建了26分玉蘭商業(yè)品種的DNA 指紋圖譜，為玉蘭屬植物的分子遺傳學研究提供標記資源，也為玉蘭優(yōu)良品種的真實性鑒定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在河南省南召縣內(nèi)6 個不同地點選取6 株望春玉蘭自然單株（編號NZ1—NZ6）；此外，在南召縣林業(yè)局收集的玉蘭種質(zhì)資源庫中選取26 個不同商業(yè)品種的玉蘭植株（編號1—26，表1）。2022 年9 月，分別采集上述玉蘭植株的幼嫩葉片經(jīng)低溫保鮮運送，貯存于-80 ℃冰箱，待用。6 份自然單株和26 份商業(yè)品種分別用于篩選SSR 引物及構建SSR 指紋圖譜。

表1 26 份玉蘭商業(yè)品種信息Tab. 1 Information of 26 commercial Magnolia cultivars

1.2 基因組DNA 提取

稱取100 mg 葉片樣品，采用TIANGEN 公司的DNA 提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit，DP320）提取基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop-2000 分光光度儀分別對DNA 的質(zhì)量及濃度進行檢測，并將每份DNA 樣品稀釋至30 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存，待用。

1.3 望春玉蘭基因組SSR 特征分析

利用已公布的望春玉蘭基因組序列信息（https://datadryad.org/stash/dataset/doi:10.5061/dryad.s4mw6m947），采用MISA 軟件（http://www.pgrc.ipkgaters leben.de/misa）進行全基因組微衛(wèi)星序列查找。微衛(wèi)星查找參數(shù)設置為：單核苷酸重復≥12 bp；二核苷酸和三核苷酸重復次數(shù)最少分別為6 次和4 次；四核苷酸和五核苷酸重復次數(shù)最少為3 次；六核苷酸重復最少為2 次；如果SSR 位點之間的距離≤100 bp，則定義為復合型SSR。

1.4 SSR 引物設計、篩選與指紋圖譜構建

根據(jù)望春玉蘭基因組SSR 位點分析結果，除去復合型SSR 和單核苷酸重復 SSR，利用Primer Premier 5.0 軟件批量設計SSR 引物。引物設計參數(shù)設置為：引物長度18～28 bp，GC 含量在40%～60%之間，擴增產(chǎn)物大小為100～300 bp，退火溫度（Tm 值）在50～60 ℃之間。針對二～六核苷酸重復的SSR 位點，選取203對引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

利用合成的203 對引物對樣品NZ1—NZ6 的基因組DNA 進行PCR 擴增，用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對SSR 引物進行篩選，選擇電泳條帶清晰、容易判讀、多態(tài)性信息含量高的引物組合。PCR 反應體系為10 μL，包括基因組DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、10×PCR Buffer（Mg2+plus）1 μL、dNTP Mixture 0.4 μL、TaKaRa TaqTM聚合酶0.1 μL 和ddH2O 5.5 μL。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30 次，最后72 ℃延伸7 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為電壓180 V，電流200 mA 電泳90 min，電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳結束后采用銀染法染色，去離子水漂洗2 次后，置燈箱上拍照。

進一步根據(jù)引物的多態(tài)信息量（polymorphism information content, PIC）指數(shù)篩選出多態(tài)性較高的SSR 引物用于指紋圖譜構建。在擴增26 份玉蘭商業(yè)品種基因組DNA時，每個PCR 反應體系中加入1 μL稀釋100 倍的熒光dUTP（Thermol），將擴增產(chǎn)物在ABI-3730XL 測序儀進行毛細管電泳，利用Gene Mapper 基因型分析軟件對獲得的電泳譜帶進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

引物PIC 指數(shù)用下列公式進行計算：PIC=1-式中：n為某一對SSR 引物擴增的等位基因數(shù)，Pi為該位點第i個等位基因的頻率（Keimet al., 1992）。引物的鑒別力（discrimination power, DP）即一對引物所能區(qū)別的最大品種數(shù)（Brownet al., 1996；許鯤等，2008）。使用GenAIEx 軟件計算等位基因數(shù)、基因型數(shù)。

2 結果與分析

2.1 望春玉蘭長基因組SSR 位點特征

利用 MISA 軟件對已公布的望春玉蘭基因組序列（～2.22 Gb）進行搜索，在19 條染色體中發(fā)現(xiàn)符合條件的SSR 位點總計2 820 303 個。望春玉蘭基因組SSR 的長度分布在12～701 bp 之間，其中長度在12～16 bp 之間的有2 293 738 個，占總數(shù)的81.33%；長度在 17～21 bp 之間的有270 830 個，占總數(shù)的9.6%；長度在21 bp 以上的有255 735 個，占總數(shù)的9.07%（圖1）。

圖1 望春玉蘭SSR 長度與分布頻率Fig. 1 The length distribution and frequency of SSRs in M. biondii

在搜索到的望春玉蘭基因組SSR 位點中，單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸和六核苷酸重復類型出現(xiàn)的頻率占優(yōu)勢，所占比例分別為9.98%、12.02%、7.63%和62.13%；三核苷酸和五核苷酸重復類型出現(xiàn)頻率不高，分別占比5.43%和2.80%（表2）。SSR 重復單元的重復次數(shù)分布在 2～701 次之間，其中2～11 次重復的SSR 位點有2 385 718 個，占比84.59%；12～25 次重復的SSR 位點有353 970 個，占比12.55%；25 次重復以上的SSR 位點有80 615 個，占比2.86%（表2）。從SSR 的重復次數(shù)來看，單核苷酸主要分布在12～25 次，占單核苷酸總數(shù)的90.40%；二核苷酸主要分布在6～11 次，占二核苷酸總數(shù)的55.73%；三核苷酸主要分布在4～9 次，占三核苷酸總數(shù)的96%；四核苷酸、五核苷酸主要分布在3～6 次，分別占其總數(shù)99.41%和99.51%；六核苷酸主要分布在2～5 次，占六核苷酸總數(shù)的99.92%（表2）。

表2 望春玉蘭基因組SSR 的種類、數(shù)量及比例Tab. 2 Type, number and ratio of SSRs in the genome of M. biondii

從核苷酸重復基序的類型來看，望春玉蘭基因組2 820 303 個SSR 位點共包含501 種重復基序，二核苷酸至六核苷酸重復基序分別有4、10、33、102 和352 種。二核苷酸重復基序中AG/CT（166 489 個）、AT/AT（130 648 個）和AC/GT（41 152 個）的出現(xiàn)頻率較高，分別占二核苷酸重復總數(shù)的49.1%、38.53%和12.14%。三核苷酸中出現(xiàn)最多的重復基序是AAT/ATT（50 530 個）和AAG/CTT（47 939 個），分別占三核苷酸總數(shù)的33.02%和31.33%，其次是ATC/ATG（22 407 個），占三核苷酸總數(shù)的14.64%；最少的是CCG/CGG（255 個），只占三核苷酸總數(shù)的0.17%。四核苷酸中出現(xiàn)最多的重復基序是AAAT/ATTT（70 162 個）占四核苷酸總數(shù)的32.58%，其次是AAAG/CTTT（28 531 個）占四核苷酸總數(shù)的13.25%。五核苷酸中以AAAAT/ATTTT（21 301 個）和AAAAG/CTTTT（11 687個）出現(xiàn)頻率最高，分別占五核苷酸總數(shù)的26.96%和14.79%。六核苷酸中出現(xiàn)頻率最高的是 AAACCT/AGGTTT（464 338 個），占六核苷酸總數(shù)的26.50%，其次是AAAAAT/ATTTTT（86 617 個）、AACCTT/AAGGTT（464 338 個）和AAAAAG/CTTTTT（56 652 個），分別占六核苷酸總數(shù)的4.94%、4.24%和3.23%（附表1）。

2.2 望春玉蘭基因組SSR 引物的篩選與多態(tài)性分析

利用隨機選取的203 對SSR 引物對望春玉蘭樣品NZ1—NZ6 的基因組DNA 進行PCR 擴增，有94 對引物能夠得到預期產(chǎn)物，引物擴增有效率為46.31%；有25 對引物在不同樣品間呈現(xiàn)多態(tài)性，占有效引物的26.6%。這25 對多態(tài)性引物擴增望春玉蘭基因組產(chǎn)生的條帶數(shù)在2～5 之間（附表2），不同樣品間條帶呈現(xiàn)多態(tài)性（圖2）。

圖2 多態(tài)性引物擴增6 份望春玉蘭樣品的部分代表性結果Fig. 2 Representative results of the six M. biondii samples amplified with polymorphic primers

2.3 玉蘭商業(yè)品種的SSR 標記多態(tài)性及指紋圖譜構建

在上述25 對多態(tài)性引物中，選擇PIC 值最高的前10 對引物，對26 份玉蘭商業(yè)品種進行擴增。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳只能根據(jù)DNA Marker 判斷譜帶的相對大小，不夠精確，因此在分析玉蘭商業(yè)品種擴增結果時，采用了毛細管電泳對擴增譜帶進行判讀。每一對引物都可以對供試樣品產(chǎn)生清晰譜帶，表明篩選出的SSR 引物在不同玉蘭品種間表現(xiàn)出良好的通用性。10 對引物共擴增出85 個等位位點，最多的為18 個（Chr19-6），最少的為3 個（Chr08-5），平均每對引物檢測到8.5 個；基因型數(shù)最多的為19 個（Chr06-10），最少的為4 個（Chr08-5），平均每對引物檢測到8.4 個；PIC 指數(shù)在0.420～0.882 之間，平均為0.759（表3）。以引物Chr02-1 為例，該對引物擴增產(chǎn)生6 種不同基因型譜帶（圖3）。

圖3 引物Chr02-1 在26 份玉蘭商業(yè)品種中擴增出的6 種基因型Fig. 3 Six genotypes generated by the primer Chr02-1 amplified among 26 commercial cultivars

表3 10 對SSR 引物多態(tài)性及鑒別力分析Tab. 3 Polymorphic and discrimination power analysis of the 10 pairs of primers

某些玉蘭品種僅需一對引物即可與其他品種相互區(qū)分，例如引物Chr02-1 和Chr10-7 分別是‘日出’和‘玉玲瓏’的特異引物。但多數(shù)品種需要利用不同的引物組合才能實現(xiàn)與其他品種的區(qū)分。一對引物所能區(qū)分的最大品種數(shù)可以用于評價引物鑒別力。按照引物鑒別力大小排列，只需利用3 對引物（Chr06-10、Chr09-2、Chr19-6）作為首選引物組合即可將本研究中涉及26 份玉蘭商業(yè)品種一一區(qū)分，但是為了能夠更準確地反映某一品種的遺傳真實性，避免品種識別誤差，擴大指紋圖譜的適用范圍，本研究整合匯總了10對SSR 引物對每一個品種的擴增結果，每一對引物的擴增帶型按照大小進行編碼處理，得到每一個玉蘭品種對應A-F 引物的10 個編號，按固定的順序?qū)?0 個編號串聯(lián)形成字符串，由此得到以字符串表示的26份玉蘭商業(yè)品種的DNA 指紋代碼，并進一步利用二維碼生成器將指紋圖譜代碼信息轉(zhuǎn)換為便于市場流通和栽培管理的二維碼（表4）。

表4 26 個玉蘭品種的指紋代碼Tab. 4 Fingerprints of 26 Magnolia cultivars

3 討論

木蘭類（Magnoliids）植物在被子植物演化系統(tǒng)中占有特殊地位，是探究被子植物起源與進化的代表性植物（Chenet al., 2019）。目前，完成全基因組測序的木蘭類植物僅有6 個物種，包括：鵝掌楸（Liriodendron chinense）（Chenet al., 2019）、牛油果（Persea americana）（Rendón-Anayaet al., 2019）、黑胡椒（Piper nigrum）（Huet al., 2019）、刺果番荔枝（Annona muricata）（Strijket al., 2021）、牛樟（Cinnamomum kanehirae）（Chawetal., 2019）和望春玉蘭（Donget al., 2021），其中望春玉蘭基因組（～2.2 GB）是迄今報道的木蘭類植物中最大的。這些基因組序列的公布不僅為研究木蘭類植物在被子植物演化歷史中的系統(tǒng)位置提供了關鍵信息，也為充分開發(fā)分子標記資源提供了豐富的序列。本研究根據(jù)望春玉蘭全基因組的SSR 位點序列信息，篩選出10 對擴增譜帶清晰的SSR 引物，在擴增不同玉蘭品種基因組DNA 時表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重復性，這些引物擴增的等位基因數(shù)≥3，PIC 值均大于0.65（除Chr08-5 外），顯示出較高的多態(tài)信息。此外，最終篩選出的10 對SSR 引物分散在10 條不同染色體上，能夠充分反映不同玉蘭品種之間的遺傳差異，提高鑒定結果的可靠性，可以作為玉蘭品種鑒定的核心引物。利用這些引物首次構建了26 個玉蘭商業(yè)品種的DNA 指紋圖譜，其中包括12 個國家林業(yè)草原局授權植物新品種。由于玉蘭屬植物極佳的觀賞性和較高的經(jīng)濟價值性，栽培范圍廣泛，自然雜交現(xiàn)象較多，部分品種間性狀變異幅度小、交叉多，僅憑葉形、花型、果實等形態(tài)特征難以對相似品種的遺傳真實性進行準確判斷。通過比對玉蘭DNA 指紋圖，結果顯示本研究所涉及的26 個玉蘭商業(yè)不存在同種異名或異種同名現(xiàn)象。

中國是玉蘭屬植物起源中心，也是玉蘭屬植物資源最為豐富的國家（田國行等，2006），僅望春玉蘭就包括6 個品種群和24 個品種（孫軍等，2008）。近年來，國外新優(yōu)品種不斷被引入，國內(nèi)自主培育的新品種也不斷涌現(xiàn)，為望春玉蘭良種選育和推廣應用提供了豐富種質(zhì)資源，但由于栽培歷史悠久、來源復雜、品種繁多，為優(yōu)良品種的純度和真實性鑒定，充分保障育種知識產(chǎn)權提出了更高的要求。本研究開發(fā)的SSR引物具有多態(tài)性高、穩(wěn)定好等特點，在少量玉蘭商業(yè)品種中的應用和初探，證明了SSR 標記用于玉蘭種質(zhì)資源DNA 指紋圖譜構建和品種鑒別的可行性。在后續(xù)研究工作中，廣泛收集和系統(tǒng)整理玉蘭品種資源，構建包含更多玉蘭品種的SSR 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫具有重要意義。建立和完善玉蘭品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，進一步實現(xiàn)指紋圖的查詢和比對功能，不僅可以為玉蘭品種快速和準確鑒別提供遺傳信息，也為玉蘭新品種的審定和登記提供一個基礎平臺。此外，玉蘭屬植物系統(tǒng)分類和親緣關系研究存在較大爭議（傅大立，2001）。以形態(tài)學特征為基礎，以分子標記等多種遺傳標記技術為輔助，綜合形態(tài)特征和基因型數(shù)據(jù)，將有利于系統(tǒng)梳理玉蘭屬植物復雜的分類關系。本研究開發(fā)的SSR 引物也為玉蘭屬植物的系統(tǒng)分類和遺傳背景分析提供了分子標記資源。

4 結論

本研究通過對望春玉蘭全基因組微衛(wèi)星序列進行查找和分析，共獲得重復單元長度為1～6 堿基的微衛(wèi)星位點2 820 303 個，其中六核苷酸重復基序AAACCT/AGGTTT 數(shù)量最多（464 338 個），占六核苷酸重復總數(shù)的26.50%。在此基礎上，設計開發(fā)和篩選出譜帶清晰、易于判讀、多態(tài)性高的SSR 引物25 對，平均每對引物產(chǎn)生1.28 個多態(tài)性條帶，PIC 值在0.24～0.72。進一步利用PIC 值最高的前10 對引物構建了玉蘭商業(yè)品種的DNA 指紋圖譜，結果表明這10對引物在不同品種中具有良好通用性，可以準確鑒別26 個商業(yè)品種。本研究不僅為玉蘭屬植物群體遺傳結構和遺傳多樣性研究提供了豐富的分子標記資源，也為玉蘭優(yōu)良品種的遺傳真實性鑒別和品種保護工作提供了技術支撐和科學依據(jù)。

附表 1 望春玉蘭基因組SSR 各重復基序類型及數(shù)量Appendix Tab. 1 The type and number of SSR repeat motifs in the M. biondii genome

附表 2 望春玉蘭25 對多態(tài)性SSR 引物信息Appendix Tab. 2 Information of 25 polymorphic primers developed from M. biondii