申雋于，李懷志，陳夢(mèng)麟，鄭姍姍，張粲粲，韓 博，吳 堅(jiān)，孫慶敏

基于多組學(xué)探討川陳皮素調(diào)控脂質(zhì)合成氧化逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥的機(jī)制

申雋于1，李懷志1，陳夢(mèng)麟1，鄭姍姍1，張粲粲1，韓 博1，吳 堅(jiān)2*，孫慶敏2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

運(yùn)用脂質(zhì)代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尋找川陳皮素對(duì)胃癌順鉑耐藥細(xì)胞（AGS-DDP）的核心靶點(diǎn)，并結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究川陳皮素逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥的機(jī)制。采用UPLC-Orbitrap質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。利用GENE Card、TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘川陳皮素和甘油磷脂代謝通路的潛在靶點(diǎn)，通過微生信在線作圖工具平臺(tái)整合二者的交集靶點(diǎn)，并進(jìn)行基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，通過STRING數(shù)據(jù)庫繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Cytoscape軟件將川陳皮素的核心靶點(diǎn)可視化。川陳皮素給藥后，通過CCK-8法檢測(cè)AGS和AGS-DDP細(xì)胞的存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞的凋亡情況；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞的遷移能力；Western blotting檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞的B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）和三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase，ACLY）蛋白表達(dá)。AGS和AGS-DDP細(xì)胞通過脂質(zhì)組學(xué)分析檢測(cè)得到31個(gè)亞類中的1450個(gè)差異的脂質(zhì)化合物，主要富集在甘油磷脂代謝通路，對(duì)川陳皮素潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析結(jié)果顯示川陳皮素具有逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥的潛力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，川陳皮素劑量相關(guān)性地抑制AGS-DDP細(xì)胞的存活率（＜0.05、0.01），增加AGS-DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性（＜0.05），且能誘導(dǎo)AGS-DDP細(xì)胞凋亡并抑制其遷移能力（＜0.05、0.01）。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川陳皮素組Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），Bcl-2、N-cadherin、Vimentin、ACLY和PPARγ蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。AGS和AGS-DDP細(xì)胞的差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物主要富集在甘油磷脂代謝通路，川陳皮素通過調(diào)控脂質(zhì)合成氧化關(guān)鍵基因抑制AGS-DDP細(xì)胞增殖、遷移，最終逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥。

胃癌；川陳皮素；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；順鉑耐藥；脂質(zhì)合成氧化；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位列全球惡性腫瘤的前5名，對(duì)人們的健康造成巨大威脅[1-2]。順鉑是一種能夠產(chǎn)生有效細(xì)胞毒性的非特異性抗腫瘤藥物，被廣泛應(yīng)用于胃癌的治療。但其在治療過程中的持續(xù)使用會(huì)逐漸產(chǎn)生耐藥性[3-4]，因此尋求一種療效確切且可以減少胃癌細(xì)胞順鉑耐藥性的藥物尤為重要。

腫瘤細(xì)胞的代謝重編程是腫瘤的重要特征，代謝重編程發(fā)生在腫瘤生成的各個(gè)階段，與細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性也有很密切的關(guān)系。相較于糖代謝，對(duì)腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的研究較少，但近年越來越多的研究證明在腫瘤細(xì)胞中，脂質(zhì)代謝也發(fā)生了明顯的變化[5]。脂質(zhì)作為第二信使和激素在信號(hào)傳遞中扮演著重要的角色，脂質(zhì)堆積在腫瘤中非常常見，它本身被視為癌癥的標(biāo)志[6]，脂肪酸的合成和氧化也受到過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）轉(zhuǎn)錄因子家族的調(diào)控[7]。腫瘤耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)抑制PPAR對(duì)于治療腫瘤耐藥有顯著的抑制作用，PPAR介導(dǎo)的脂肪酸氧化水平升高會(huì)導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[8]。三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase，ACLY）是糖酵解和脂質(zhì)代謝的連接酶，是腫瘤細(xì)胞脂肪酸從頭合成的第一步，在多種腫瘤中表達(dá)增加[9]，已有研究發(fā)現(xiàn)可通過下調(diào)ACLY抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路和激活單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/活性氧（reactive oxygen species，ROS）通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥[10]。因此，抑制PPAR和ACLY可能是克服腫瘤順鉑耐藥的新策略。通過調(diào)控脂代謝可以改善胃癌細(xì)胞耐藥性，研究脂質(zhì)代謝物的改變對(duì)于闡明脂質(zhì)代謝在胃癌細(xì)胞耐藥中的作用意義重大[11]。

中醫(yī)治療腫瘤類疾病依據(jù)扶正祛邪的原則，中藥輔助放射治療、化療可增敏減毒，改善耐藥，減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提高患者生存質(zhì)量[12-13]。因此，研究中醫(yī)藥改善腫瘤耐藥的機(jī)制具有重大意義。陳皮是最常用的理氣藥，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效。藥理學(xué)研究表明陳皮及其有效成分類黃酮可以減少肝臟中的脂質(zhì)堆積[14]。川陳皮素是多甲氧基黃酮類化合物，是陳皮中發(fā)揮作用的重要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激、降血糖、調(diào)血脂等多種藥理活性[15-17]，川陳皮素作為一類天然的活性物質(zhì)，具有較高安全性。已有研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素能有效緩解由高脂膳食誘導(dǎo)的代謝紊亂，可改善血脂水平和肝臟脂肪變性程度[18]，但其對(duì)胃癌耐藥的作用卻鮮有報(bào)道。因此，本研究基于中藥理論并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)方法探究川陳皮素在胃癌順鉑耐藥中的作用，并從分子層面揭示川陳皮素改善胃癌細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人胃腺癌細(xì)胞株（AGS）和人胃腺癌順鉑耐藥株（AGS-DDP）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥品與試劑

川陳皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)Must-22100917）購自成都Must生物科技有限公司；順鉑（批號(hào)WA2A1210）購自齊魯制藥有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)BC-M-018）、PBS溶液（批號(hào)BC-BPBS-04）購自Bio-Channel生航生物公司；新生牛血清（批號(hào)22011-8612）購自浙江天杭生物科技股份有限公司；胰酶細(xì)胞消化液（批號(hào)C0201）、RIPA裂解液（批號(hào)P0013B）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號(hào)P1005）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0010）、Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C1062）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)FD3788）購自杭州弗德生物科技有限公司；ECL發(fā)光液（批號(hào)BL520B）購自Biosharp公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)12789）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)89477）、E-cadherin抗體（批號(hào)220874）、N-cadherin抗體（批號(hào)22018）、Vimentin抗體（批號(hào)10366）、PPARγ抗體（批號(hào)16643）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ACLY抗體（批號(hào)AB40793）購自英國Abcam公司；二抗（批號(hào)ZB-2301、ZB-2305）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

UHPLC Nexera LC-30A型超高效液相色譜（日本島津公司）；ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)（美國Bio-Tek公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（美國FORMA公司）；SW-CJ-HS2型細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；IX71型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；5430R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；電泳儀、MP-4型電泳槽（美國Bio-Rad公司）；Tanon-4600型化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon公司）；渦旋混合器（Thermolyne公司）。

1.4 數(shù)據(jù)庫與軟件

MetaboAnalyst 5.0網(wǎng)站（https://www. metaboanalyst.ca/home.xhtml）；TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；GSEA GENE Set Enrichment Analysis網(wǎng)站（http://www.gsea-msigdb. org/gsea/index.jsp）；Sangerbox 3.0在線平臺(tái)（http:// vip.sangerbox.com/home.html）；STRING網(wǎng)站（https://cn.string-db.org/cgi/input），GENE Card數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；微生信網(wǎng)站（www. bioinformatics.com.cn）；LipidSearch（Thermo Scientific）自動(dòng)化脂質(zhì)組學(xué)分析軟件；Cytoscape 3.7.2軟件。

2 方法

2.1 AGS和AGS-DDP細(xì)胞的脂質(zhì)代謝組學(xué)檢測(cè)與分析

將樣本加入200 μL 4 ℃超純水中，渦旋混勻，加入240 μL預(yù)冷甲醇，渦旋混合后加入800 μL甲基叔丁基醚，再次渦旋混合后低溫水浴中超聲20 min，室溫放置30 min，10 ℃、14 000×離心15 min，取上層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈桑?80 ℃保存樣本。樣品采用UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，柱溫45 ℃；體積流量300 μL/min；流動(dòng)相A為10 mmol/L甲酸銨乙腈水溶液（乙腈-水6∶4），B為10 mmol/L甲酸銨乙腈異丙醇溶液（乙腈-異丙醇1∶9），梯度洗脫：0～2 min，30% B；2～25 min，30%～100% B；25～35 min，100%～30% B。整個(gè)分析過程中樣品置于10 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)而造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。

當(dāng)白砂糖添加量12%，姜水比1∶1，姜汁添加量14%，檸檬酸添加量0.625%，β-環(huán)狀糊精添加量0.04%時(shí)，在配比為7∶1∶1的卡拉膠、黃原膠、槐豆膠的膠凝劑添加量分別為1.00%，1.10%，1.20%，1.30%，1.40%時(shí)，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

采用LipidSearch自動(dòng)化脂質(zhì)組學(xué)分析軟件進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、脂質(zhì)鑒定等處理，主要參數(shù)：前體耐受性5×10?6，產(chǎn)物離子閾值5%。對(duì)LipidSearch提取得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括單變量統(tǒng)計(jì)分析、多元變量統(tǒng)計(jì)分析、層次聚類分析和相關(guān)性分析等；單變量統(tǒng)計(jì)分析包括Student’s-test/非參檢驗(yàn)和變異倍數(shù)分析。

2.2 MetaboAnalyst通路分析

在脂質(zhì)代謝組學(xué)分析得到的結(jié)果中，根據(jù)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）值由高到低篩選出前20個(gè)耐藥細(xì)胞的代謝物，并將其導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行系統(tǒng)通路分析[19]。以Impact＞0.1和＜0.05為篩選條件，確定最相關(guān)的路徑，最后將分析出的代謝途徑輸入GSEA GENE Set Enrichment Analysis網(wǎng)站獲得該代謝途徑的相關(guān)靶點(diǎn)信息。

2.3 川陳皮素的京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

在TCMSP中預(yù)測(cè)的川陳皮素靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析。使用Sangerbox 3.0 在線平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和可視化的KEGG富集分析。最后將＜0.01設(shè)定為閾值，以確定具有顯著差異的生物過程和信號(hào)通路。

2.4 川陳皮素與代謝途徑靶點(diǎn)的獲取和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

TCMSP數(shù)據(jù)庫是根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)的相關(guān)理論建立的。藥物篩選以吸收、分布、代謝、排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）為標(biāo)準(zhǔn)，如人體口服生物利用度、半衰期、藥物親和性、Caco-2滲透性、血腦屏障和Lipinski規(guī)則[20]。從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索川陳皮素中的靶點(diǎn)；以“glycerophospholipid metabolism”為關(guān)鍵詞，在GENE Card數(shù)據(jù)庫中檢索甘油磷脂代謝通路相關(guān)的靶點(diǎn)，得到的結(jié)果以“Relevance”為指標(biāo)獲得相關(guān)靶點(diǎn)，將預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與川陳皮素的靶點(diǎn)聯(lián)系起來，得到的交集基因上傳到STRING網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，根據(jù)PPI的結(jié)果，建立了包含藥物和代謝物相互作用的基因之間關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 CCK-8法檢測(cè)AGS細(xì)胞和AGS-DDP細(xì)胞的存活率

將處于對(duì)數(shù)生長期的AGS和AGS-DDP細(xì)胞細(xì)胞分別用胰酶消化，離心收集后重懸，然后以5000個(gè)/孔接種于96孔板中。分別用不同濃度（0、1、5、10、50、100 μmol/L）的順鉑或者不同濃度（0、5、10、100、150、200 μmol/L）的川陳皮素分別處理細(xì)胞24、48 h，或者50 μmol/L的川陳皮素聯(lián)合不同濃度（0、1、5、10、50、100 μmol/L）的順鉑處理24 h，另設(shè)置不接種細(xì)胞不加入藥物的空白孔，每孔加入10 μL的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對(duì)照－空白)

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞凋亡

AGS-DDP細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）的川陳皮素處理24 h，收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次。采用Annexin-V和碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞的凋亡，將細(xì)胞重懸于195 μL結(jié)合緩沖液中，然后依次加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI。避光孵育15 min后，上機(jī)檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞的凋亡情況。

2.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞增殖

AGS-DDP細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于6孔板中，用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）的川陳皮素處理24 h后，更換完全培養(yǎng)基生長10 d，然后用多聚甲醛固定細(xì)胞，再加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，染色后拍照，最后進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)。

2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGS-DDP細(xì)胞遷移

2.9 Western blotting檢測(cè)Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、ACLY和PPARγ蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期AGS-DDP細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）的川陳皮素處理24 h，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解15 min。4 ℃、12 000×離心20 min，吸取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白溶液封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫?fù)u床孵育1 h后，經(jīng)TBST漂洗，使用ECL液進(jìn)行發(fā)光，用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，兩組間比較采用檢驗(yàn)分析，兩組以上比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 AGS和AGS-DDP細(xì)胞的脂質(zhì)代謝物存在顯著差異

主成分分析結(jié)果表明2組細(xì)胞能夠得到明顯的區(qū)分，提示本實(shí)驗(yàn)建立的模型具有較高可靠性（圖1-A）；火山圖展示AGS和AGS-DDP細(xì)胞中脂質(zhì)分子的整體差異表達(dá)倍數(shù)情況，圖中的點(diǎn)為FC＞1.5或FC＜0.67、＜0.05的脂質(zhì)分子，即單變量統(tǒng)計(jì)分析篩選的差異脂質(zhì)分子（圖1-B）；熱圖顯示了AGS-DDP和AGS細(xì)胞差異脂質(zhì)的層次聚類結(jié)果（圖1-C）；弦圖顯示了AGS和AGS-DDP細(xì)胞差異脂質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果（圖1-D）。

A-AGS與AGS-DDP細(xì)胞的PCA得分圖 B-差異脂質(zhì)分子火山圖 C-AGS與AGS-DDP細(xì)胞差異脂質(zhì)的層次聚類熱圖 D-差異脂質(zhì)的相關(guān)性分析弦圖

3.2 MetaboAnalyst通路分析脂質(zhì)代謝產(chǎn)物富集在甘油磷脂代謝通路

根據(jù)FC值篩選出了差異最為顯著的前20個(gè)脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，熱圖顯示了這20個(gè)代謝物（圖2）。將這20個(gè)代謝產(chǎn)物導(dǎo)入MetaboAnalyst網(wǎng)站中，最終分析得到的5條代謝通路（甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨生物合成、花生四烯酸代謝）。以Impact＞0.1、＜0.05為指標(biāo)來確定最相關(guān)的途徑，重點(diǎn)分析了差異最為顯著的甘油磷脂代謝途徑。

3.3 川陳皮素潛在靶點(diǎn)與鉑類耐藥相關(guān)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到川陳皮素的34個(gè)潛在靶點(diǎn)，分別是環(huán)加氧酶1（prostaglandin endoperoxide synthase 1，PTGS1）、PPARγ、凝血因子X（F10）、PTGS2、雌激素受體2（estrogen receptor 2，ESR2）、核受體共激活因子2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1，CREB1）、磷脂酶A2組IVA（phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、兔抗凝血酶III（rabbit antithrombin-III，SERPINC1）、鉀電壓門控通道亞家族H成員2（potassium voltage-gated channel KQT-like subfamily member 2，KCNH2）、ESR1、雄激素受體（androgen receptor，AR）、凝血因子VII（F7）、蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPN1）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα（TOP2A）、TOP2B、二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）、熱休克蛋白90AB1（heat shock protein 90 kDa alpha class B member 1，HSP90AB1）、檢查點(diǎn)激酶1（cell cycle checkpoint kinase 1，CHEK1）、絲氨酸蛋白酶1（protease serine 1，PRSS1）、大電導(dǎo)鈣離子激活的鉀通道M亞族α亞基（potassium large conductance calcium-activated channel subfamily M alpha member 1，KCNMA1）、糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3B）、電壓門控鈉通道α亞基5（sodium voltage-gated channel alpha subunit 5，SCN5A）、BCL2、BAX、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cystein-asparate protease 9，CASP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、Jun原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、CD163、促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞B2受體（erythropoietin-producing hepatocyte B2 receptor，EPHB2）。對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)川陳皮素具有逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥的潛力（圖3）。

3.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)川陳皮素抑制胃癌鉑類耐藥的潛在靶點(diǎn)

將川陳皮素的34個(gè)靶點(diǎn)與從GENE Card數(shù)據(jù)庫獲得甘油磷脂代謝相關(guān)的548個(gè)潛在靶點(diǎn)相交，其中共同作用的靶點(diǎn)有8個(gè)，分別是PTGS1、PPARγ、F10、PTGS2、ESR2、NCOA2、CREB1、PLA2G4A。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化后顯示2個(gè)節(jié)點(diǎn)（紅色倒三角表示川陳皮素，深藍(lán)色倒三角表示甘油磷脂代謝）和34個(gè)潛在靶點(diǎn)（菱形表示潛在靶點(diǎn)），每條連線表示節(jié)點(diǎn)之間的相互作用（圖4）。

圖2 AGS和AGS-DDP細(xì)胞的前20個(gè)差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物熱圖

圖3 KEGG通路富集分析

3.5 川陳皮素濃度-時(shí)間相關(guān)性地逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥

如圖5所示，不同濃度順鉑處理后的AGS-DDP細(xì)胞存活率在給藥48 h后高于AGS細(xì)胞。與對(duì)照組比較，10、50、100、200 μmol/L川陳皮素處理24 h后，AGS和AGS-DDP細(xì)胞的存活率均顯著降低（＜0.05、0.01），5、10、50、100、200 μmol/L川陳皮素處理48 h后的AGS和AGS-DDP細(xì)胞的存活率均顯著降低（＜0.05、0.01）。50 μmol/L的川陳皮素和不同濃度（0、1、5、10、50、100 μmol/L）的順鉑聯(lián)用時(shí)，AGS-DDP細(xì)胞的存活率與僅用順鉑給藥時(shí)相比有顯著性差異（＜0.05），說明川陳皮素能增強(qiáng)AGS-DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。

3.6 川陳皮素誘導(dǎo)AGS-DDP細(xì)胞凋亡

如圖6所示，與對(duì)照組比較，川陳皮素各劑量組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

3.7 川陳皮素抑制AGS-DDP細(xì)胞增殖能力

如圖7所示，與對(duì)照組比較，川陳皮素各劑量組細(xì)胞克隆形成數(shù)目均顯著減少（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

3.8 川陳皮素抑制AGS-DDP細(xì)胞遷移能力

如圖8所示，與對(duì)照組比較，川陳皮素各劑量組給藥12 h后細(xì)胞遷移能力均顯著降低（＜0.05、0.01），川陳皮素中、高劑量組給藥24、48 h后細(xì)胞遷移能力均顯著降低（＜0.05、0.01），且呈時(shí)間-劑量相關(guān)性。

3.9 川陳皮素可以調(diào)控Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、ACLY和PPARγ蛋白表達(dá)

如圖9～11所示，與對(duì)照組比較，川陳皮素中、高劑量組Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），ACLY蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；川陳皮素高劑量組Bcl-2、N-cadherin、Vimentin和PPARγ蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

A-DDP作用24 h后細(xì)胞存活率 B-DDP作用48 h后細(xì)胞存活率 C-川陳皮素作用24 h后細(xì)胞存活率 D-川陳皮素作用48h后細(xì)胞存活率 E-川陳皮素與順鉑共同作用24 h后細(xì)胞存活率 與對(duì)照組（0 μmol·L?1）比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與AGS-DDP組比較：#P＜0.05，下圖同

圖6 川陳皮素對(duì)AGS-DDP細(xì)胞凋亡的影響(, n = 3)

圖7 川陳皮素對(duì)AGS-DDP細(xì)胞增殖的影響(, n = 3)

圖8 川陳皮素對(duì)AGS-DDP細(xì)胞遷移的影響(, n = 3)

圖9 川陳皮素對(duì)AGS-DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖10 川陳皮素對(duì)AGS-DDP細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖11 川陳皮素對(duì)AGS-DDP細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

順鉑為金屬鉑類絡(luò)合物，是一種周期非特異性抗腫瘤藥，被廣泛應(yīng)用于胃癌的治療，但長期使用順鉑會(huì)產(chǎn)生獲得性的耐藥[3]。近年來，天然活性化合物的潛在機(jī)制已成為藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，越來越多研究證實(shí)了陳皮有抗癌的功效[21]，川陳皮素是從陳皮中分離得到的一種多甲氧基黃酮類化合物[22]，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、控制癌癥發(fā)生和發(fā)展的作用，對(duì)多種癌癥都有著極強(qiáng)的抗癌功效[23-24]。在課題組前期研究中已經(jīng)證實(shí)了川陳皮素在胃癌中的作用，并且通過抑制脂肪酸的從頭合成以改善胃癌的進(jìn)展[25]，因此選取了川陳皮素繼續(xù)展開接下來的研究，探索川陳皮素對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞AGS-DDP的潛在抗癌和逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制。

本研究首先采用了超高效液相色譜脂質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)，其主要研究目標(biāo)為各機(jī)體內(nèi)的脂類物質(zhì)、鑒定脂類分子在蛋白表達(dá)和基因代謝中的調(diào)控機(jī)制[26]。結(jié)果顯示，AGS與AGS-DDP細(xì)胞的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物有顯著的差異，根據(jù)FC值篩選出了差異最顯著的20個(gè)代謝產(chǎn)物集中在甘油磷脂代謝途徑，預(yù)測(cè)胃癌耐藥可能與甘油磷脂通路的脂質(zhì)代謝相關(guān)。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)川陳皮素的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示川陳皮素可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)川陳皮素與甘油磷脂代謝通路預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)中共同作用的有8個(gè)，分別是PTGS1、PPARγ、F10、PTGS2、ESR2、NCOA2、CREB1、PLA2G4A，其中PPARγ重組蛋白與脂質(zhì)的合成與代謝密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素可上調(diào)脂肪組織中PPAR家族mRNA表達(dá)水平，表明川陳皮素可以誘導(dǎo)脂質(zhì)貯積和脂肪酸氧化[27]，因此PPARγ可能是川陳皮素治療胃癌細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

隨后在體外進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度順鉑處理后的AGS-DDP細(xì)胞的存活率在處理48 h后明顯高于AGS細(xì)胞，證實(shí)AGS-DDP細(xì)胞對(duì)順鉑更不敏感，產(chǎn)生了耐藥性；與對(duì)照組比較，用不同濃度川陳皮素處理24、48 h后的AGS和AGS-DDP細(xì)胞的存活率均降低，50 μmol/L的川陳皮素和順鉑聯(lián)用時(shí)，AGS-DDP細(xì)胞的存活率與僅用順鉑給藥時(shí)相比明顯降低，說明川陳皮素能增強(qiáng)AGS-DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥，且呈時(shí)間-劑量相關(guān)性，因此選用對(duì)照組和川陳皮素低、中、高劑量（50、100、200 μmol/L）組進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)AGS-DDP細(xì)胞凋亡數(shù)量隨著川陳皮素濃度的升高而增加，并且有顯著的差異，說明川陳皮素能誘導(dǎo)AGS-DDP細(xì)胞凋亡。平板克隆形成結(jié)果顯示川陳皮素給藥后的克隆形成數(shù)目與對(duì)照組克隆形成數(shù)目相比降低，并且有顯著性差異，說明川陳皮素能抑制AGS-DDP細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川陳皮素可以明顯抑制AGS-DDP細(xì)胞的遷移能力。

Bcl家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，Bcl-2在細(xì)胞凋亡中起抑制作用，Bax則起到促進(jìn)作用，Bcl-2、Bax在評(píng)定細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[28]。Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高，且與給藥劑量呈正相關(guān)，說明川陳皮素能誘導(dǎo)AGS-DDP細(xì)胞的凋亡；E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是維持細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附能力的重要蛋白，是評(píng)定細(xì)胞遷移能力的重要標(biāo)志[29]。E-cadherin表達(dá)水平升高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)降低，且與給藥劑量呈正相關(guān)，說明川陳皮素能抑制AGS-DDP細(xì)胞的遷移能力；PPARγ是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞分化中起控制作用[30]，文獻(xiàn)報(bào)道PPARγ表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)與肌肉內(nèi)脂質(zhì)沉積有關(guān)，拮抗PPARγ可以成功阻止各種來源腫瘤細(xì)胞的體外生長，而激活PPARγ則可通過將有毒脂肪酸轉(zhuǎn)化為惰性三酰甘油促進(jìn)腫瘤生長，并且PPARγ還可以調(diào)控ACLY的表達(dá)量，ACLY是葡萄糖代謝和脂肪酸合成的橋梁，能催化檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA），從而將過量的糖酵解產(chǎn)物導(dǎo)向脂質(zhì)合成，從而促進(jìn)腫瘤的生長和分化。因此，PPARγ和ACLY可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[31-32]。為了探究川陳皮素是否能調(diào)控AGS-DDP細(xì)胞的脂質(zhì)合成和氧化，Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PPARγ和ACLY的蛋白表達(dá)水平，在給藥24 h后均減低，且與給藥劑量呈正相關(guān)，說明川陳皮素可以通過PPARγ和ACLY調(diào)控AGS-DDP細(xì)胞的脂質(zhì)合成和氧化過程。

綜上，本研究運(yùn)用脂質(zhì)代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究川陳皮素通過調(diào)控脂質(zhì)合成和氧化改善胃癌順鉑耐藥的作用機(jī)制，并結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了川陳皮素對(duì)順鉑胃癌耐藥細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的作用，為后續(xù)川陳皮素治療胃癌耐藥的研究提供新思路、新方向，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of nobiletin on reversing cisplatin resistance in gastric cancer by regulating lipid synthesis and oxidation based on multiomics

SHEN Jun-yu1, LI Huai-zhi1, CHEN Meng-lin1, ZHENG Shan-shan1, ZHANG Can-can1, HAN Bo1, WU Jian2, SUN Qing-min2

1. The First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China

To search for the core targets of nobiletin on gastric cancer cisplatin resistant cells (AGS-DDP) by lipid metabolomics and network pharmacology, and further explore the mechanism of nobiletin on reversing gastric cancer cisplatin resistance through cell experiments.UPLC-Orbitrap mass spectrometry system was used for non-targeted lipidomics analysis. GENE Card and TCMSP databases were utilized to explore potential targets for the metabolic pathways of nobiletin and glycerol phospholipids, the intersection targets were integrated through Microbioinformatics online mapping tool platform, and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis was performed. STRING database was used to construct protein-protein interaction (PPI) network, the core targets of nobiletin was visualized by Cytoscape software. After administration of nobiletin, the survival rate of AGS and AGS-DDP cells was detected by CCK-8 method; Flow cytometry was used to detect the apoptosis of AGS-DDP cells; Scratch experiment was used to detect the migration ability of AGS-DDP cells; Western blotting was used to detect B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax), E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ) and adenosine triphosphate citrate lyase (ACL) protein expressions in AGS-DDP cells.A total of 1450 different lipid compounds were detected in 31 subclasses of AGS and AGS-DDP cells through lipidomics analysis, mainly enriched in glycerol phospholipid metabolism pathway. KEGG enrichment analysis of potential targets of nobiletin showed that nobiletin had the potential to reverse platinum resistance. The results of cell experiment showed that compared with control group, nobiletin significantly inhibited the survival rate of AGS-DDP cells in a dose-dependent manner (< 0.05, 0.01), increased the sensitivity of AGS-DDP cells to cisplatin (< 0.05), induced AGS-DDP cells apoptosis and inhibited its migration ability (< 0.05, 0.01). The results of Western blotting experiments showed that Bax and E-cadherin protein expression levels were significantly increased (< 0.05, 0.01), as well as Bcl-2, N-cadherin, Vimentin, ACL and PPARγ protein expression levels were significantly reduced (< 0.05, 0.01).The differential lipid metabolites between AGS and AGS-DDP cells are mainly enriched in glycerol phospholipid metabolism pathway. Nobiletin inhibits the proliferation and migration of AGS-DDP cells by regulating key genes for lipid synthesis and oxidation, ultimately reversing cisplatin resistance in gastric cancer.

gastric cancer; nobiletin; network pharmacology; cisplatin resistance; lipid synthesis and oxidation; peroxisome proliferators-activated receptor γ

R28.5

A

0253 - 2670(2023)21 - 7066 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.015

2023-07-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973609）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973782）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82174197）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20211392）；江蘇省醫(yī)學(xué)青年人才項(xiàng)目（QNRC2016641）；江蘇省“333”計(jì)劃項(xiàng)目（LGY2018065）；江蘇省中醫(yī)院學(xué)術(shù)人才計(jì)劃項(xiàng)目（Y2021RC29，Y2021RC45）

申雋于，碩士研究生，從事腫瘤臨床藥學(xué)研究。E-mail: 20210143@njucm.edu.cn

通信作者：孫慶敏，副主任藥師，從事腫瘤臨床藥學(xué)研究。E-mail: qingminsun@njucm.edu.cn

吳 堅(jiān)，副研究員，從事腫瘤微環(huán)境的研究。E-mail: czcyg@sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]