嚴(yán) 莉，仝 鑄，何秀娟，肖 翠，王澤瓊，袁龍義，孫中海，邱文明

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果樹茶葉研究分中心，武漢 430064；2.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434025）

山桐子（Idesia polycarpaMaxim.）是楊柳科（Salicaceae）山桐子屬高大落葉喬木，在中國主要分布在秦嶺、淮河以南，其果實和種子中富含豐富的油脂，是優(yōu)質(zhì)的木本油料樹種［1，2］。隨著中國木本油料行業(yè)的發(fā)展，山桐子的栽培面積不斷增加，栽培優(yōu)良新品種具有重要意義［3］。山桐子為雌雄異株植物，雌株果實和種子可用于油料生產(chǎn)，雄株在生產(chǎn)上多作為授粉樹，雌株的經(jīng)濟(jì)價值明顯高于雄株。目前，山桐子的育種工作重點在雌性品種選育方面［4］。生產(chǎn)中，山桐子多用種子繁殖或者無性扦插繁殖［5］。實生繁殖過程中童期漫長，一般要經(jīng)過4～5 年的營養(yǎng)生長期，才能進(jìn)入生殖成熟期［4，5］；而無性繁殖成活率低，操作難度也較大，成本也較高［6］。雌雄異株植物在幼苗期的性別很難區(qū)分，因此，開發(fā)用于山桐子幼苗早期性別鑒定的技術(shù)，可以極大程度地節(jié)約育種成本、縮短育種周期，在生產(chǎn)和育種方面具有極其重要的意義［7，8］。

宋雨［9］利用表型性狀、分子標(biāo)記技術(shù)對山桐子的地理分布、遺傳多樣性及種質(zhì)資源鑒定等方面進(jìn)行研究。在表型性狀方面，歲立云等［10］根據(jù)果實性狀自然變異將陜西省的山桐子劃分為6 種果實形態(tài)變異類型；張小雪等［11］通過對不同種源的2 年生山桐子生長規(guī)律差異的分析，發(fā)現(xiàn)不同種源山桐子之間具有一定的遺傳差異性；李大偉［12］通過對8 省16個不同產(chǎn)地山桐子的15 個表型性狀指標(biāo)的研究，將43 個山桐子單株分為3 類。在DNA 分子標(biāo)記方面已有一些關(guān)于山桐子植物性別鑒定和遺傳資源多樣性分析的標(biāo)記被報道。簡單重復(fù)序列間區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是基于基因組微衛(wèi)星的分子標(biāo)記，為通用標(biāo)記，該標(biāo)記已在多種植物遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、遺傳多樣性分析等研究中得到應(yīng)用［13］。王艷梅等［13］以12 個不同分布區(qū)的山桐子為材料，利用ISSR 分子標(biāo)記對山桐子的遺傳差異進(jìn)行分析；代莉等［14］建立了適用于山桐子ISSR-PCR 的反應(yīng)體系；董娜等［15］以毛葉山桐子為材料，利用ISSR 分子標(biāo)記篩選出能夠鑒別毛葉山桐子性別的特異標(biāo)記UBC841。目前關(guān)于UBC841 的準(zhǔn)確性鮮見報道，該標(biāo)記為雌性特異標(biāo)記，僅在8 份（其中6 份雌株、2 份雄株）毛葉山桐子中表現(xiàn)出特異性，而沒有在更大群體中進(jìn)行驗證［15］。因此，本研究選用來自其他群體的山桐子對該標(biāo)記進(jìn)行通用性驗證，以驗證其準(zhǔn)確性。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence related amplified polymorphism，SRAP）是一種基于PCR（Polymerase chain reaction）的新型分子標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記不需預(yù)知物種基因序列信息，已在多種植物中得到應(yīng)用［16］；雷瀚等［17］篩選出2 對SRAP分子標(biāo)記引物，可以準(zhǔn)確對滇楊（Populus yunnanensisDode）早期性別進(jìn)行鑒定；嚴(yán)武平等［18］和魏麗麗等［16］分別優(yōu)化了適用于鷓鴣茶［Mallotus oblongifolius（Miq.）Muell. Arg.］和草莓（Fragaria ananassaDuch.）的SRAP-PCR 反應(yīng)體系。在山桐子中，Wang等［19］利用SRAP 分子標(biāo)記篩選得到1 個與山桐子性別關(guān)聯(lián)的雌性特異標(biāo)記，該標(biāo)記為雌性特異標(biāo)記，其可靠性在原報道所用52 份（包括30 份雌株、22 份雄株）樣本中均可得到驗證，將該雌性特異標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR 標(biāo)記，STZ 標(biāo)記在上述樣本中均表現(xiàn)出特異性，表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確率。目前STZ 標(biāo)記僅在所涉及的材料中進(jìn)行了應(yīng)用驗證，且所涉及的山桐子樣品均來自同一地區(qū)，并沒有在更大的群體中和更廣泛地域中進(jìn)行檢測，其可靠性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步檢測。

本研究利用已知性別的山桐子種質(zhì)資源作為材料，旨在探討UBC841 和STZ 2 個分子標(biāo)記在山桐子性別鑒定中的通用性，以期為山桐子的早期性別分子鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

試驗于2020—2022 年進(jìn)行，試料取自湖北省利川市、襄陽市等地，采集已知性別的山桐子資源120份（其中雌株60 份，雄株60 份），選擇樹齡相近、無病蟲害、生長結(jié)果正常的成齡植株，隨機(jī)采集樹體不同部位枝條上的幼嫩葉片，經(jīng)清水洗凈后晾干，并用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 的獲取及檢測

采用杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA 快速提取試劑盒提取上述120 份山桐子樣品的DNA，具體提取步驟按照試劑盒說明進(jìn)行，所得DNA 用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質(zhì)量及完整性。將總DNA 稀釋至30 ng/μL，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。其中離心機(jī)為Eppendorf Centrifuge 5810 R 型，微量紫外分光光度計為Nano drop 1000 型，所用凝膠成像系統(tǒng)生產(chǎn)商為Bio-Rad Laboratories Inc.，型號為Gel Doc XR+。

1.3 標(biāo)記來源

UBC841 標(biāo)記來源于董娜等［15］；STZ 標(biāo)記來源于Wang 等［19］，所用引物均為武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物信息具體見表1。

表1 山桐子性別標(biāo)記引物信息

1.4 UBC841、STZ 性別分子標(biāo)記反應(yīng)體系的建立

為分析標(biāo)記UBC841 的有效性，本研究參照董娜等［15］采用的PCR 條件，以24 份山桐子樣品（12 份雌株，12 份雄株）的DNA 為模板，對引物UBC841 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果所得產(chǎn)物中有多態(tài)性條帶，均未發(fā)現(xiàn)性別特異條帶。因此，為了更好地驗證其通用性，進(jìn)行了體系優(yōu)化試驗。選擇2 個雌株和1 個雄株樣品作為模板進(jìn)行體系優(yōu)化試驗，反應(yīng)體系如下：使用25 μL 反應(yīng)體系，2×PCR Mix（預(yù)混TaqDNA Polymerase、Mg2+、dNTPs，指示染料和反應(yīng)Buffer）（武漢吉泰克基因技術(shù)有限公司）12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL；PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，49.5～56.0 ℃（分別是49.5、51.8、53.5、54.8、55.6、56.0 ℃）退火40 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。PCR 采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以擴(kuò)增條帶多態(tài)性和清晰程度為選擇最佳退火溫度的依據(jù)。

采用120 份（雌株60 株，雄株60 株）山桐子進(jìn)行STZ 標(biāo)記的通用性驗證。引物STZ 的PCR 擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 ISSR 引物PCR 擴(kuò)增

采用“1.4”中反應(yīng)體系，利用26 對ISSR 引物（表2）進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度根據(jù)引物而不同，擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用引物均為武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表2 26 對ISSR 引物信息

1.6 SRAP 引物PCR 擴(kuò)增

選取2 份山桐子模板對隨機(jī)合成的870 對SRAP 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系同“1.4”，退火溫度根據(jù)引物而不同，擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用引物均為武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 UBC841 標(biāo)記在已知性別山桐子樣品中的體系優(yōu)化及驗證結(jié)果

選取山桐子2 份雌性樣品和1 份雄性樣品對引物UBC841 的擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化，最終得出引物UBC841 在山桐子中的擴(kuò)增最適退火溫度為53.5 ℃。由圖1 可以看出，UBC841 標(biāo)記在所有溫度下均能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，但均未表現(xiàn)出性別差異；UBC841 標(biāo)記在53.5 ℃退火溫度時，擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性較高，擴(kuò)增條帶比較清晰，非特異性擴(kuò)增較少，因此確定引物UBC841 的最適退火溫度為53.5 ℃；為驗證引物的有效性，繼續(xù)擴(kuò)大樣本檢測，采用優(yōu)化后的最適退火溫度在24 份（12 份雌株，12 份雄株）山桐子樣品中進(jìn)行檢驗，結(jié)果如圖2 所示。UBC841 引物標(biāo)記在24 份山桐子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物中，均在250～300 bp 有多態(tài)性片段出現(xiàn)，但都沒有表現(xiàn)出性別特異性。因為該標(biāo)記在所用材料中未表現(xiàn)出良好的性別特異性，所以沒有繼續(xù)擴(kuò)大樣本檢測。

圖1 引物UBC841 退火溫度梯度

圖2 引物UBC841 在24 份山桐子樣品中的驗證結(jié)果

2.2 STZ標(biāo)記在已知性別山桐子樣品中的驗證結(jié)果

利用“1.4”中反應(yīng)體系對120 份（雌株60 份，雄株60 份）山桐子樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3 所示。在60 份雌株樣品中共有26 份樣品擴(kuò)增出明亮的特異條帶，占比為43.3%，有9 份樣品擴(kuò)增條帶較弱，占比為15%；而在60 份雄性樣品中也擴(kuò)增出特異片段，且與標(biāo)記條帶大小一致，有27 份樣品擴(kuò)增出明亮的條帶，占比為45%，有7 份樣品擴(kuò)增出較暗的條帶，占比為11.7%；在雌雄株中均能擴(kuò)增出特異片段，雌雄株擴(kuò)增出特異片段的比例相近，并沒有在雌株中表現(xiàn)出性別差異，因此沒有性別特異性，而在Wang等［19］報道中STZ 是雌性特異標(biāo)記，僅出現(xiàn)在雌性樣品中。

2.3 ISSR 引物擴(kuò)增多態(tài)性

選取6 份山桐子樣品對26 對ISSR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，部分引物擴(kuò)增結(jié)果如圖4 所示。26 對引物共有20 對引物能夠擴(kuò)增出條帶，引物有效率為76.9%，共擴(kuò)增出176 條條帶，其中引物UBC829 擴(kuò)增條帶數(shù)最多，為13 條；其次是引物UBC812 和UBC864，均擴(kuò)增出12 條條帶；但是該20 對引物在6 份山桐子樣品中均未表現(xiàn)出性別特異性，因此沒有繼續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行檢測。

圖4 部分ISSR 引物在6 份山桐子樣品中的擴(kuò)增圖譜

2.4 SRAP 引物擴(kuò)增多態(tài)性

經(jīng)過SRAP-PCR 擴(kuò)增篩選，846 對引物中有792對引物可擴(kuò)增出清晰的條帶，引物的有效擴(kuò)增率達(dá)91.03%；有231 對引物能夠擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，部分引物擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖5 所示。初步統(tǒng)計結(jié)果顯示，265 對引物共擴(kuò)增得到1 338 條條帶，其中引物組合me04/em04 條帶數(shù)最多，為15 條，選取6 份模板（雌株3 份，雄株3 份）對該265 對引物進(jìn)行擴(kuò)大樣本篩選，在雌雄株中均未表現(xiàn)出特異性。

圖5 部分SRAP 引物在2 份山桐子樣品中的擴(kuò)增圖譜

3 討論

山桐子早期性別鑒定對育種和栽培實踐有重要意義。山桐子作為雌雄異株植物，其雌株的經(jīng)濟(jì)價值遠(yuǎn)高于雄株，但由于山桐子的童期較長，且結(jié)實較晚，幼年期的山桐子雌、雄株在形態(tài)上很難將其區(qū)分，通常需要經(jīng)過3～5 年，在開花期通過雌雄花才能準(zhǔn)確區(qū)分，這給生產(chǎn)帶來極大不便，因此，研究山桐子早期性別分化，在生產(chǎn)上合理配置雌雄個體，對提高山桐子產(chǎn)量具有重要意義［8，15］。

已報道的有關(guān)植物性別鑒定的方法有很多，包括形態(tài)學(xué)［20］、生理生化［21］、同工酶［22］等，這些方法大都是對已成熟個體性別差異的研究。植物個體性別分化會受到多種因素的影響，因此上述方法用于早期性別鑒定時，結(jié)果可靠性往往較差［23］。DNA 分子標(biāo)記受發(fā)育階段及外界環(huán)境的影響小，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性高，因此被廣泛應(yīng)用于雌雄異株植物的早期性別鑒定中［8，23］。目前被報道的分子標(biāo)記中，應(yīng)用到山桐子中的主要有SSR、ISSR、SRAP 和SCAR等［5，15，19］；李娜等［5］基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的SSR 分子標(biāo)記可將4 個不同地區(qū)的山桐子進(jìn)行區(qū)分；王艷梅等［13］、代莉等［14］和董娜等［15］分別利用ISSR 分子標(biāo)記對山桐子的遺傳差異進(jìn)行分析，優(yōu)化了適用于山桐子的體系，篩選出了能夠鑒別山桐子性別的特異標(biāo)記；Wang 等［19］利用SRAP 分子標(biāo)記開發(fā)了可以鑒別山桐子雌雄株的特異標(biāo)記，并將此標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR 分子標(biāo)記，該標(biāo)記為雌性特異標(biāo)記。ISSR分子標(biāo)記為通用性分子標(biāo)記，無需預(yù)先知道物種基因組的序列［15］；目前ISSR 已廣泛應(yīng)用于美洲黑楊（Populus deltoidsMarshall）的新無性系材料鑒定、紅橘（Citrus reticulataBlanco）種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、番茄（Lycopersicon esculentumMiller）種質(zhì)資源遺傳多樣性分析等方面［24-26］。董娜等［15］在ISSR 分子標(biāo)記開發(fā)過程中，所選用材料是毛葉山桐子，采用優(yōu)化后的體系對100 條引物進(jìn)行檢測，最終在100 對引物中發(fā)現(xiàn)引物UBC841 能夠在雌株中擴(kuò)增出特異性條帶并且可以穩(wěn)定存在，該條帶大小為250～300 bp；本研究在對UBC841 標(biāo)記引物進(jìn)行重復(fù)驗證時，先對其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，后為驗證引物有效性在24 份山桐子樣品中進(jìn)行擴(kuò)大樣本驗證，結(jié)果顯示，該引物在250～300 bp 有多態(tài)性片段出現(xiàn)，但是在雌雄株中并沒有表現(xiàn)出性別特異性，因此沒有繼續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行檢測。此外，對該擴(kuò)增片段進(jìn)行回收測序，共獲得10 條不同的序列，因此該引物不宜用于山桐子雌雄株的早期鑒定。

SRAP 分子標(biāo)記根據(jù)基因外顯子和啟動子中堿基特征，設(shè)計獨特的雙引物來擴(kuò)增開放閱讀框架（ORFs）的特定區(qū)域，與ISSR 分子標(biāo)記相同，SRAP標(biāo)記不需要事先獲取被檢測物種的基因組序列，具有簡單、高效的特點［16，18，27］。目前SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在滇楊（Populus yunnanensisDode）［17］、獼猴桃屬（ActinidiaLindl.）［28］、蘋果（Malus domesticaMill.）［29］、草莓［16］等植物中均有應(yīng)用。山桐子STZ 標(biāo)記就是利用SRAP擴(kuò)增到的210 bp雌株特異片段轉(zhuǎn)化而來［19］。但是本研究在驗證該標(biāo)記的通用性時，雌株中有35份樣品有該特異條帶，雄株中有34 份樣品有該條帶，并未表現(xiàn)性別特異性。推測可能是使用的山桐子樣本太少，獲得的差異片段并不與性別連鎖［19］。

本研究除檢驗UBC841 和STZ 分子標(biāo)記的通用性外，還分析了大量的ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記引物，但未篩選出山桐子性別特異標(biāo)記。隨著中國木本油料行業(yè)的快速發(fā)展，急需開發(fā)可靠的分子標(biāo)記進(jìn)行山桐子早期性別鑒定。下一步，除了嘗試其他新的分子標(biāo)記技術(shù)外，更需加強(qiáng)山桐子性別分化分子機(jī)制的研究，探明其性別分化、形成的機(jī)理，開發(fā)簡單、高效、可靠的性別鑒定方法，節(jié)約育種成本，加快育種進(jìn)度，更好地支撐產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。