郭 薇，楊慧君，莫愛杰，孫俊霄，翟昱翔，矣林園，袁勇超

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

攝食是機(jī)體的重要生理活動之一，食物攝入量決定著動物機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和體內(nèi)能量的平衡狀態(tài)。長期攝食量減少會導(dǎo)致動物生長性能低下，生產(chǎn)效率降低；攝食過量則會導(dǎo)致機(jī)體并發(fā)代謝綜合癥、脂肪沉積異常、產(chǎn)品質(zhì)量降低、飼料利用率下降、資源浪費(fèi)和水環(huán)境污染等問題。攝食活動主要是通過攝食調(diào)控相關(guān)的內(nèi)分泌激素促食欲因子（Orexigenic）和抑制食欲因子（Anorexigenic）作用于大腦的攝食調(diào)控中心，具有短期和長期的攝食調(diào)節(jié)作用［1］。胃饑餓素（Ghrelin）是目前已知惟一的外周循環(huán)型促攝食的腦腸肽，為生長激素促分泌劑受體（GHSR）的內(nèi)源性配體，Ghrelin 可以促進(jìn)飲食、調(diào)節(jié)體重、參與調(diào)節(jié)能量平衡［2］。神經(jīng)肽Y（NPY）和可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽（CART）主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，分別刺激和抑制魚的攝食活動［3］。膽囊收縮素（CCK）和瘦素（Leptin）作為飽腹感因子，胃饑餓素作為促食欲因子，主要分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)［4，5］。研究表明，哺乳動物中這些因子綜合調(diào)控機(jī)體攝食生長、能量代謝等。而魚類是最多樣化的脊椎動物，雖然關(guān)于魚類攝食的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是只有相對較少的魚類種類被研究［4］。

草魚（Ctenopharyngodon idella）是一種典型的草食性魚類，能有效將植物蛋白轉(zhuǎn)化為動物蛋白；其生長迅速、飼料來源廣，是中國最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。據(jù)《2021 年中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，草魚產(chǎn)量位于漁業(yè)總產(chǎn)量之首，每年高達(dá)557 萬t［6］。草魚作為攝食量大、攝食食欲強(qiáng)的魚類代表，根據(jù)草魚攝食前后機(jī)體食欲因子的變化規(guī)律，制定精準(zhǔn)的投喂策略既有利于草魚攝食代謝，同時又能有效提高飼料利用效率。因此，本試驗(yàn)選取草魚為研究對象，利用實(shí)時熒光定量PCR 對草魚攝食前后ghrelin、npy、cart、cck和leptin等促食欲和抑制食欲相關(guān)因子mRNA 的表達(dá)量進(jìn)行了研究，以期通過對草魚短期食欲調(diào)控的探究，闡明食欲因子在草魚攝食調(diào)控過程中所起作用及調(diào)節(jié)機(jī)制，為建立合理的草魚投飼策略和促進(jìn)草魚快速生長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)魚由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。將試驗(yàn)草魚幼魚暫養(yǎng)在120 L養(yǎng)殖桶中，暫養(yǎng)2周以適應(yīng)試驗(yàn)養(yǎng)殖環(huán)境。試驗(yàn)魚暫養(yǎng)和試驗(yàn)期間每天投喂1次，均在上午9：00，投喂占魚體重4%～5%的飼料（廣東海大集團(tuán)），投喂過程大約持續(xù)15 min，投喂1 h后吸除殘餌。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨機(jī)選取150 尾初始體重為（17.6±0.1）g 的草魚篩分到大小為120 L 的循環(huán)水養(yǎng)殖桶中，每桶投放25 尾試驗(yàn)草魚，設(shè)置2 個處理組［正常投喂處理組（Fed）和禁食處理組（Fasted）］，每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。試驗(yàn)期間，光周期為14 h∶10 h、水溫（27.1±1.31）℃、pH 8.3±0.6、溶解氧含量（7.35±0.31）mg/L，保持微流水。投喂組試驗(yàn)魚投喂時間為上午9：00，而禁食組試驗(yàn)魚采取饑餓處理。采樣處理時間節(jié)點(diǎn)設(shè)計(jì)為將上午9：00 定義為投喂0 h 處理組，其他采樣處理組（投喂前2 h、1 h、投喂后1 h、2 h 和4 h）分別對應(yīng)標(biāo)記為-2 h、-1 h、1 h、2 h 和4 h 共6 個采樣時間點(diǎn)，每個采樣時間節(jié)點(diǎn)從每個養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取出3 尾魚進(jìn)行相應(yīng)樣品的采集。將魚放在2 %間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）溶液中麻醉，注射器從尾靜脈抽血，離心后收集血漿樣品，在液態(tài)氮下迅速冷凍并保存在-80 ℃條件下，用于生長激素（Growth hormone，GH）的分析，使用生長激素（GH）測試盒進(jìn)行檢測（南京建成生物工程研究所）。利用無菌解剖工具將草魚腦和前腸組織取出，在液態(tài)氮下迅速冷凍并保存在-80 ℃條件下，用于促食欲因子和抑制食欲因子mRNA 的表達(dá)分析。

1.3 總RNA 的提取和轉(zhuǎn)錄

使用Trizol法提取魚腦和前腸組織總RNA，利用Nano Drop 2000 核酸蛋白儀檢測總RNA 的純度和數(shù)量，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。根據(jù)PrimeScriptTMRT試劑盒說明書，1 μg總RNA通過Revert AidTM逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成為cDNA用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR

本試驗(yàn)中用于實(shí)時熒光定量PCR 的ghrelin、leptin、npy、cck和cart基因的引物如表1 所示。β-actin基因作為內(nèi)源參考基因，基因擴(kuò)增效率在96%～104%之間。每個RNA 樣本設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系包括10 μL GoTaq qPCR Master Mix（Bio-Rad，USA），1 μL cDNA，每個引物0.2 μmol/L。PCR程序?yàn)?5 ℃下預(yù)變性1 min，40 個循環(huán)，分別為95 ℃變性15 s，60℃退火15 s，72 ℃延伸45 s。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析［7］。

表1 熒光定量PCR 的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)分析前對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊次性檢驗(yàn)。同一處理下基因在不同時間點(diǎn)的表達(dá)量運(yùn)用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和鄧肯氏檢驗(yàn)，P＜0.05視為差異顯著。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚攝食前后腦和前腸組織中促食欲因子mRNA 的表達(dá)

攝食前2 h，草魚腦組織中g(shù)hrelinmRNA 表達(dá)水平達(dá)到最大峰值（P＜0.05），隨后表現(xiàn)出下降趨勢，投喂后的4 h 內(nèi)，其表達(dá)水平?jīng)]有顯著性變化（P＞0.05）；但草魚前腸組織中g(shù)hrelinmRNA 表達(dá)水平的最大峰值出現(xiàn)在投喂前1 h（P＜0.05），隨后表現(xiàn)出下降趨勢，投喂后的4 h 內(nèi)，其表達(dá)水平也沒有顯著性變化（P＞0.05）；禁食組草魚腦組織和前腸組織中g(shù)hrelinmRNA表達(dá)水平要高于投喂處理組（圖1）。

圖1 草魚腦（A）和前腸（B）中g(shù)hrelin mRNA 在攝食前后的表達(dá)量變化

如圖2A 所示，攝食前草魚腦組織中npymRNA表達(dá)水平表現(xiàn)出上升趨勢，在攝食前1 h 時到達(dá)最大值（P＜0.05），攝食后表現(xiàn)出先下降后顯著性上升到攝食前水平（P＜0.05）。相比于npymRNA 在腦組織中的表達(dá)變化，攝食前和禁食處理，草魚前腸組織中npymRNA 表達(dá)無顯著性變化（P＞0.05）。投喂處理后，草魚前腸組織中npymRNA 表達(dá)先顯著性上調(diào)后顯著性下調(diào)到攝食前水平（P＜0.05），并在攝食后1 h 時達(dá)到峰值（圖2B）。

圖2 草魚腦（A）和前腸（B）中npy mRNA 在攝食前后的表達(dá)量變化

2.2 草魚攝食前后腦和前腸組織抑制食欲因子mRNA 的表達(dá)

攝食前2 h 內(nèi)，腦組織中抑制食欲因子cckmRNA 表達(dá)水平無顯著性變化（P＞0.05），禁食處理對腦組織和前腸組織中抑制食欲因子cckmRNA 表達(dá)水平也無顯著性變化（P＞0.05）。相反，投喂處理后草魚腦組織和前腸組織中其表達(dá)量急劇上調(diào)（P＜0.05），在攝食后1 h 時最高，攝食后2 h 表現(xiàn)出顯著性下調(diào)（P＜0.05），隨后在攝食后2～4 h 保持穩(wěn)定（P＞0.05）。前腸中抑制食欲因子cckmRNA 豐度與腦組織中變化趨勢相似（圖3B）。

禁食組草魚腦組織cartmRNA 表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），投喂組在1 h 達(dá)到峰值（P＜0.05）（圖4A）。圖4B 顯示草魚前腸組織cartmRNA表達(dá)水平在攝食前2 h 內(nèi)沒有出現(xiàn)顯著性變化（P＞0.05），持續(xù)饑餓會導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，并在2 h 后穩(wěn)定在較低豐度水平。投喂組草魚前腸組織cartmRNA表達(dá)水平在攝食后呈上升趨勢并在攝食后2 h達(dá)到峰值（P＜0.05），最后在攝食后4 h 回歸到攝食前水平。

圖4 草魚腦（A）和前腸（B）中cart mRNA 在攝食前后的表達(dá)量變化

禁食組草魚腦和前腸組織中l(wèi)eptinmRNA 豐度均沒有較為明顯的變化（圖5）。投喂組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但腦組織中l(wèi)eptinmRNA 表達(dá)量在攝食后2 h 達(dá)到峰值，而前腸組織中l(wèi)eptinmRNA 表達(dá)量在攝食后1 h 達(dá)到峰值。同時，投喂后4 h 草魚腦和前腸組織中l(wèi)eptinmRNA 表達(dá)量都顯著高于投喂前2 h（P＜0.05）。

2.3 草魚攝食前后血漿中生長激素含量的變化

0 h 前草魚血漿中GH 含量比較穩(wěn)定，而0 h 后投喂組草魚血漿中GH 含量急劇上升，在1 h 達(dá)到峰值后開始下降（P＜0.05）；禁食組草魚血漿中GH 含量呈現(xiàn)緩慢上升狀態(tài)。在4 h 時，禁食組和投喂組草魚血漿中GH 含量近乎相同（圖6）。

圖6 草魚血漿中GH 在攝食前后的含量變化

3 討論

與哺乳動物一樣，魚類的能量穩(wěn)態(tài)、攝食行為和食物攝入是由中樞和外周內(nèi)分泌通路的相互作用來調(diào)節(jié)，對機(jī)體的能量狀態(tài)和食欲調(diào)控作出響應(yīng)和反應(yīng)［8］。Ghrelin 和NPY 是在胃和腦中合成的一種促食欲肽，在機(jī)體內(nèi)參與了攝食調(diào)控、能量平衡、吸收代謝等。目前，Ghrelin 和NPY 已經(jīng)被證明存在于多種魚類中，并在魚類的攝食調(diào)控中起到了重要的調(diào)控作用，包括鱖魚（Siniperca chuatsi）［9］、金魚（Carassius auratus）［10］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［11］、草魚［12］、鱸魚（Lateolabrax japonicus）［13］、大西洋鮭魚（Salmo salar）［14］、北極紅點(diǎn)鮭（Salvelinus alpines）［15］。在哺乳動物中，已有研究表明ghrelinmRNA 和循環(huán)血漿Ghrelin 水平在進(jìn)食前顯著升高，進(jìn)食后顯著降低［16，17］。在金魚中也發(fā)現(xiàn)相似的試驗(yàn)結(jié)果，Unniappan 等［18］研究發(fā)現(xiàn)金魚下丘腦和腸道的ghrelinmRNA 表達(dá)在攝食后下降，并且攝食后短期內(nèi)血清中Ghrelin 水平也明顯下降。此外，對金魚進(jìn)行外源性注射Ghrelin 到腦腔和腹腔后都能促使其攝食量增加［17］。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)草魚腦和腸道中g(shù)hrelinmRNA 的表達(dá)豐度分別在攝食前2 h 和1 h 時達(dá)到峰值，表明投喂前機(jī)體的中樞和外周系統(tǒng)會上調(diào)相關(guān)組織中g(shù)hrelinmRNA 表達(dá)，有效提高機(jī)體攝食食欲。此外，Murashita 等［19］研究表明饑餓6 d 的鮭魚（Oncorhynchus keta）胃中g(shù)hrelin-1mRNA 水平明顯升高。同時，本研究發(fā)現(xiàn)草魚禁食處理后其腦中g(shù)hrelin和npymRNA 明顯高于投喂組。曹磊等［20］研究表明，隨著饑餓時間的延長黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）腦組織中npymRNA 表達(dá)量顯著上升，再投喂后其表達(dá)量迅速下降到正常水平，表明NPY 在魚類攝食活動中發(fā)揮著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，投喂前1～3 h 金魚大腦npy的表達(dá)量會增加，而飼喂后1～3 h 其表達(dá)量會下降［20］，從而調(diào)控金魚的攝食行為，本研究中草魚攝食前和攝食后腦組織中npymRNA 變化趨勢與之相似，推測腦腸肽Ghrelin 和NPY 在草魚的短期食欲調(diào)控中發(fā)揮著比較重要的作用，有必要進(jìn)一步深入探討其在草魚體內(nèi)具體的食欲調(diào)控作用和機(jī)制。

在魚類和哺乳動物的攝食和食欲調(diào)控中，已研究發(fā)現(xiàn)CCK、CART 和Leptin 等食欲調(diào)控因子作為飽腹信號發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［21，22］。已有研究表明，CCK 作為飽食因子其結(jié)構(gòu)和功能在斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［23］、大西洋鮭魚［24］等物種中被發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)草魚cckmRNA 表達(dá)量在草魚攝食前后出現(xiàn)了明顯變化，攝食后的急劇上升表明CCK 在草魚攝食調(diào)控中起抑制攝食的作用。Rubio 等［25］研究發(fā)現(xiàn)口服CCK 導(dǎo)致鱸魚食物攝入量減少，而口服CCK 拮抗劑可以增加鱒魚和鱸魚的食物量，相似的研究結(jié)果在金魚上得到驗(yàn)證［22］。CART是在小鼠中最早發(fā)現(xiàn)的，會抑制動物對食物的采食量［8］。到目前為止，CART 已經(jīng)在金魚［10］、大西洋鱈魚（Gadus morhua）［25］、斑點(diǎn)叉尾鮰［23］、美洲擬鰈（Pseudopleuronectes americanus）［26］等中被鑒定。本研究表明攝食后草魚的cart基因表達(dá)會顯著增加，在4 h 內(nèi)會繼續(xù)保持較高的表達(dá)水平。金魚和大西洋鮭魚的cartmRNA 轉(zhuǎn)錄水平分別在攝食后1.5 h 和2.0 h 會增加，而大西洋鱈魚的cartmRNA 轉(zhuǎn)錄豐度在攝食后2 h 開始降低［27］。鯰魚大腦內(nèi)cartmRNA的表達(dá)水平在30 d 的禁食處理后開始下降而重新投喂15 d 后cartmRNA 表達(dá)水平顯著回升。研究表明，CART 作為調(diào)節(jié)魚類攝食行為的飽食因子在機(jī)體的食欲調(diào)控過程起到重要作用［28］。已有研究發(fā)現(xiàn)，長期饑餓的虹鱒leptin表達(dá)水平顯著升高［29］。在鱸魚中，饑餓3 周后下調(diào)了肝中l(wèi)eptinmRNA 轉(zhuǎn)錄水平，再繼續(xù)投喂3 周后leptinmRNA 表達(dá)水平則得到迅速回升［30］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)草魚大腦和前腸leptinmRNA 水平在攝食后顯著提高，表明Leptin 在草魚攝食調(diào)節(jié)中起到抑制攝食的作用。

動物需要精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)能量的攝入和消耗，以平衡生長和其他生理過程。這種調(diào)節(jié)受到控制食欲、進(jìn)食行為和能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵途徑的影響。食欲調(diào)節(jié)對機(jī)體的正常生長和能量平衡至關(guān)重要。生長激素（GH）/胰島素樣生長因子（IGF）軸是控制代謝率、生長和食物攝入的主要途徑［31］。生長激素水平的長期增加會在不同程度上改變個體多肽的攝食調(diào)節(jié)途徑。在魚類中，注射生長激素可以增加攝食［32］；生長激素（GH）在轉(zhuǎn)基因魚中過表達(dá)可顯著提高魚的生長速度、飼料轉(zhuǎn)化率、攝食動機(jī)和攝食量［31，33］。研究表明，部分食欲因子［如蛙皮素（Bombesin，BBS）、NPY、Leptin、CCK、Ghrelin 等］能作為生長激素的促分泌劑［34］。在金魚體內(nèi)，BBS 增加了GH 分泌，降低了生長抑素基因表達(dá)［35］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，攝食后草魚血漿中GH 含量表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，可能是攝食前促食欲因子的高表達(dá)刺激機(jī)體生長激素的分泌，并延后到投喂后1 h 達(dá)到高峰，并且投喂后，草魚血漿中GH 含量與抑制食欲因子表達(dá)有著相似的變化趨勢，有必要開展促食欲因子和飽食因子與魚類GH 內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究。