談沖,艾梅,陳良強,,楊帆,徐巖,王莉,杜海*

1(江南大學,釀造微生物學與應用酶學實驗室,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)3(貴州茅臺酒股份有限公司,貴州 遵義,564501)

在中國白酒中,乳酸是代表白酒特征的一種有機酸類,在酒中起到調和酒味的緩沖作用,乳酸乙酯在酒體的呈味和呈香中發(fā)揮重要作用,其在中國白酒中較高的含量是區(qū)別于國外蒸餾酒的顯著特征[1]。醬香型白酒具有二次投料、多輪次循環(huán)發(fā)酵的工藝特點,上一輪次的發(fā)酵產物,尤其乳酸等不易揮發(fā)物質的不斷積累,必然影響到下一輪次的微生物結構以及產酒品質[2]。適量的乳酸能調節(jié)發(fā)酵進程,但乳酸含量過高,則會破壞微生物細胞內外質子平衡,破壞細胞膜,從而損傷細胞[3]。因此有必要對發(fā)酵過程中影響乳酸積累的因素進行研究。

乳酸菌是醬香型白酒發(fā)酵過程中普遍存在的一類微生物[4],它能夠產生乳酸、乙酸等代謝物質[5],隨著發(fā)酵的進行,窖內pH逐步降低,乳酸菌的含量不斷增加,到出窖時則會成為絕對優(yōu)勢細菌[6]。而不同香型白酒的優(yōu)勢乳酸菌種類和含量均有所不同[7]:刑敏鈺等[8]通過高通量測序發(fā)現Weissellaparamesenteroides和Lactobacillussp.分別是芝麻香型白酒釀造中后期優(yōu)勢微生物;羅青春等[9]從濃香型白酒酒醅中分離出2株產乳酸能力很強的Lactobacillusbuchneri和Lactobacillusacetotolerans;趙欣怡等[10]從清香型白酒酒醅中篩選得到Lactobacilluscoryniformis和Pediococcusacidilactici2株具有較強產酸、耐酸能力的乳酸菌?！岸瓮读?多輪次循環(huán)發(fā)酵”是醬香型白酒不同于其他香型白酒的工藝特點,復雜的工藝特征導致其每個輪次的乳酸菌群結構必然有所差異,楊帆[11]結合醬香型白酒乳酸顯著積累的造沙輪次中不同乳酸菌的產酸能力及其在微生物群落中所占比例,判定Lactobacilluspanis為造沙輪次窖內發(fā)酵過程中優(yōu)勢產乳酸微生物。張艷等[12]從四輪次酒醅中篩選出2株Lactobacillushomohiochii和Lactobacillusbuchneri,對維持釀造微生物區(qū)系平衡有重要意義。然而目前對醬香型白酒一輪次主要乳酸代謝菌群的研究尚不明確。

針對以上問題,本研究采用高通量擴增子測序技術解析了發(fā)酵過程中乳酸代謝菌群的演替規(guī)律及大曲、環(huán)境中的微生物群落結構;通過微生物溯源手段分析了堆積酒醅中乳酸菌的來源;將醬香型白酒一輪次發(fā)酵過程中關鍵理化因素同乳酸菌豐度和乳酸生成量聯系起來,最后通過實驗室模擬發(fā)酵驗證了關鍵理化因素對乳酸代謝的影響。本研究對分析醬香型白酒一輪次中乳酸的來源、演替及代謝規(guī)律具有重要的意義,同時對實現生產過程中乳酸的動態(tài)調控提供了具體的指導方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

紅纓子高粱,產自貴州;MRS培養(yǎng)基,Oxoid公司;氯化鈉、麥芽浸粉、乳酸(分析純)、乙酸(分析純)、乙醇(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;糖化酶、高溫α-淀粉酶,江蘇銳陽生物科技有限公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA提取液,Omega Bio-tek公司。

Avanti J-E冷凍離心機,Beckman Coulter公司;Beadbeater細胞破碎儀,Biospec公司;凝膠成像儀、PCR儀、電泳儀,Bio-Rad公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),Millipore公司;固相萃取頭,Supelco公司;Agilent 1200高效液相色譜儀,Agilent公司;MGC厭氧罐、厭氧袋,三菱公司;多管旋渦混勻儀,上海滬析實業(yè)有限公司。

1.2 樣品采集、核酸提取、測序及生物信息學分析

所用酒醅、大曲樣品均來自貴州省某醬香型酒廠;酒醅總DNA的提取參考SONG等[13]的方法;通過QIIME軟件分析處理樣品中細菌群落的擴增子基因序列,將相似度>97%的序列聚類為1個操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。利用NCBI BLAST軟件將OTU序列同數據庫中的序列進行比較,得到物種信息。

1.3 理化指標測定

酒醅的水分、酸度、還原糖、pH、乳酸、乙酸、乙醇均依據T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》測定。

1.4 酒醅浸提液富集培養(yǎng)

取酒醅10 g置于100 mL生理鹽水(0.9%氯化鈉)中,振蕩1 h,加入100 mL MRS培養(yǎng)基,置于厭氧箱中富集培養(yǎng)7 d。

1.5 不同理化參數對浸提液富集培養(yǎng)的影響

將富集培養(yǎng)液加入固態(tài)發(fā)酵高粱培養(yǎng)基中(制備方法具體參考WEI等[14]的方法),固態(tài)發(fā)酵,控制不同理化參數(乳酸、乙酸、乙醇、含水量、麥芽提取物和氧氣),培養(yǎng)7、14 d。

試驗操作過程:稱取蒸好的固態(tài)高粱30 g于50 mL離心管中,加入5%大曲及5%富集培養(yǎng)液,攪拌均勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱箱靜置培養(yǎng),以該培養(yǎng)組為對照組(含水量為50%,糖化酶添加量為300 μL/L),改變培養(yǎng)條件包括添加乙醇(30、15 g/L)、添加乙酸(30、15 g/L)、添加糖化酶(600 μL/L、900 μg/L)、添加麥芽提取物(200、100 g/L),調整含水量(45%、40%,含水量調整參考張溪桐等[15]的方法)以及控制氧氣含量(置于200 r/min搖床和厭氧箱培養(yǎng)),共13組不同的培養(yǎng)組別,發(fā)酵7、14 d,分別取樣檢測相應指標,一式三份。

1.6 固態(tài)發(fā)酵乳酸產量的分析

將發(fā)酵谷物(5 g)添加到20 mL無菌鹽水(0.85%氯化鈉)中,超聲處理30 min(0 ℃),然后以8 000×g離心5 min得到上層清液(4 ℃),發(fā)酵液中乳酸濃度的檢測參考DENG等[16]和宋哲煒[17]的方法,標準曲線為y=29 968x-15 471,R2=1。

1.7 統(tǒng)計學分析及繪圖

使用Microsoft Office Excel 2016(Microsoft,Redmond,WA)、OriginPro 2022b(OriginLab,Northampton,MA)進行統(tǒng)計學分析和數據繪圖。主成分分析(principal component analysis, PCA)通過CANOCO5進行。Source Tracker(0.9.8)[18]用于預測堆積酒醅中微生物群落的來源。采用Origin 2022進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒不同輪次乳酸變化規(guī)律

醬香型白酒造沙至第五輪次出窖酒醅的乳酸含量如圖1-a所示,可見從造沙至五輪次,乳酸含量逐輪次上升,由造沙輪次出窖3.43 g/kg酒醅上升至五輪次的29.47 g/kg酒醅。各輪次不同發(fā)酵階段的乳酸含量如圖1-b所示,可見各輪次堆積階段的乳酸含量變化不大,進入窖內發(fā)酵7 d后,由于窖內厭氧環(huán)境以及酸度的上升,乳酸菌大量繁殖,導致乳酸產量顯著上升,其中一輪次出窖時的乳酸含量為堆積起始時的1.91倍,而二、三、四輪次出窖酒醅乳酸含量分別為堆積起始的1.30、1.32、1.16倍,一輪次酒為醬香型白酒經過兩次投糧兩次發(fā)酵后取得的第一次酒,其乳酸含量的變化和微生物群落結構構成對后續(xù)輪次微生物的演替及代謝的影響至關重要,因此通過解析一輪次微生物群落結構及與生產過程中關鍵理化參數的內在聯系,探究影響乳酸含量變化的因素。

a-造沙到第五輪次出窖酒醅乳酸含量;b-造沙到第五輪次發(fā)酵過程酒醅乳酸含量圖1 造沙到第五輪次乳酸積累規(guī)律Fig.1 Lactic acid accumulation from ZaoSha to the 5th round

2.2 一輪次酒醅微生物群落演替規(guī)律

本研究采用高通量測序對醬香型白酒一輪次3個平行班組(C1班、C2班、C3班)的酒醅樣品進行分析,同細菌數據庫進行比對后得到發(fā)酵酒醅中原核微生物群落的OTU分類信息。在屬水平上,共檢測到224個屬,具體細菌群落變化如圖2-a所示。其中,乳桿菌屬(Lactobacillus)、慢生芽孢桿菌屬(Lentibacillus)、克羅彭斯特菌(Kroppenstedtia)、大洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)以及嗜熱細菌屬(Thermoactinomyces)在酒醅中的平均豐度>1%。乳桿菌為窖內發(fā)酵的優(yōu)勢微生物,其窖內平均相對豐度超過80%。乳酸菌是各類型白酒發(fā)酵過程中最主要的功能細菌種群[19],它們產生乳酸的同時,還會產生揮發(fā)性的醇、酮、氨基酸、有機酸、長鏈脂肪酸等其他風味代謝產物。

乳酸代謝相關菌群(包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬)種水平高通量測序數據表明(圖3-a),發(fā)酵過程中主要的乳酸菌種為金山乳桿菌(Lactobacillusjinshan)、耐酸乳桿菌(L.acetotolerans)、面包乳桿菌(Lactobacilluspanis)、食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructosus)、乳酸片球菌(P.acidilactici)等。其中L.jinshan在任意發(fā)酵時間點的相對豐度都占據優(yōu)勢地位,窖內發(fā)酵后期超過99%,L.jinshan屬于乳桿菌屬,是一株廣泛存在于中國傳統(tǒng)釀造體系中的重要釀造微生物[20],張艷[21]對醬香型白酒四、七輪次的乳酸菌群落結構研究發(fā)現Lactobacillussp.1作為優(yōu)勢乳酸菌種存在于整個發(fā)酵過程中,經NCBI數據庫比對其為L.jinshan。L.jinshan在中國白酒尤其是醬香型白酒各個輪次中均占據優(yōu)勢地位,DU等[22]根據其分布廣含量高的特點,將其作為內標,用特異性引物實時熒光定量PCR定量測定了其在各類白酒酒醅中的絕對量,用內標物歸一法對各類白酒中關鍵乳酸菌進行定量分析,發(fā)現該菌在發(fā)酵過程可分為生長期和穩(wěn)定期2個階段,并推測該菌在發(fā)酵0～15 d代謝較為旺盛,在發(fā)酵15 d之后可能開始積累次級代謝產物[20],然而目前在白酒酒醅中尚未分離得到其純培養(yǎng)物;2019年首次從鎮(zhèn)江香醋醋醅中分離得到一株具有較強乙酸耐受特性與異型乳酸發(fā)酵特征的革蘭氏陽性兼性厭氧菌株,并命名為LactobacillusjinshanHSLZ-75T[23],孫佳[24]通過比較其與其他釀醋細菌基因組差異發(fā)現,其基因組中有關能量代謝、氨基酸轉運相關基因數量較多,且其和耐酸特性相關的基因數占比最多,表明醋醅中L.jinshan高豐度的原因可能和耐酸特性有關。由于白酒釀造過程與釀醋過程原料、工藝等存在較大差異,因此酒醅/醋醅的理化性質(乳酸、乙酸、乙醇、溶氧等)和微生物生態(tài)位有所不同,可能導致不同釀造環(huán)境下的L.jinshan擁有不同的營養(yǎng)需求或生長特性,從而增加了分離篩選的難度。

PCA結果表明(圖2-b、圖3-b),堆積階段和入窖階段的酒醅細菌組成存在較大差異,主要是由乳酸菌在不同發(fā)酵階段的相對豐度變化引起。

2.3 微生物溯源分析

高通量測序顯示在所有樣品(大曲、環(huán)境、堆積酒醅)中,細菌屬水平共檢測出223個屬,其中過道中檢測出182個,工具中153個,堆積地面139個,大曲52個,堆積酒醅83個。有11個屬僅在大曲中檢測到,有112個屬僅從生產環(huán)境中能檢測到;有25個屬僅能從堆積酒醅中檢測出,可能來源于發(fā)酵原料或是空氣中的微生物富集。生產環(huán)境、大曲以及堆積酒醅中的細菌微生物屬水平群落結構如圖4所示,主要歸屬于15個屬,其中在過道中檢測到的,相對豐度較高的有考克氏菌屬(Kocuria,16.4%),乳桿菌屬其次(10.76%);而在生產工具、車間地面、大曲以及堆積酒醅中,慢生芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、克羅彭斯特菌以及海洋芽孢桿菌屬(OceanBacillus)為最主要的細菌屬,四者總共占據80%的相對豐度,不同屬的細菌在各個樣品中所占的比例不同。

圖4 環(huán)境、大曲屬水平細菌群落結構Fig.4 Genus level of bacterial community compositions of the environment and Daqu

a-堆積酒醅細菌不同來源分析;b-堆積酒醅微生物屬水平溯源分析圖5 堆積酒醅微生物溯源分析Fig.5 Source tracking analysis of fermented grains microorganisms

本研究使用貝葉斯概率工具SourceTracker[18],以大曲和生產環(huán)境的微生物為來源端,以堆積發(fā)酵酒醅的微生物為接受端,來預測堆積酒醅中的微生物來源,結果表明,生產環(huán)境為堆積酒醅提供了大多數細菌(93.8%),其中生產工具57.3%,地面26.5%,過道10%。大曲僅為1.8%。SourceTracker還預測了堆積發(fā)酵酒醅各種優(yōu)勢細菌微生物的來源。Lactobacillus最主要的來源為過道和生產工具。以上分析結果表明,堆積酒醅中的乳酸菌主要來源于生產環(huán)境,而大曲中乳桿菌的含量較少。

2.4 生產理化指標&微生物相關性分析

為了分析發(fā)酵過程中各類理化指標對乳酸積累的影響,基于Spearman等級相關性(|ρ|>0.2,P<0.05記為“*”,P<0.01記為“**”)繪制一輪次7類理化指標之間的相關性熱圖(圖6-a),對乳酸含量積累影響較大的主要有酸度、pH、還原糖、乙醇和水分。其中pH和還原糖對乳酸含量的影響是負面的,而還原糖由于測定的是剩余值而非消耗值因此顯示為負值,因此有必要進一步研究乙醇和水分對乳酸生成量的影響。

為了探究酒醅中優(yōu)勢乳酸菌富集的原因,我們基于Spearman等級相關性(|ρ|>0.2,P<0.05記為“*”,P<0.01記為“**”),將酒醅主要的7種理化指標(乙醇、水分、酸度、乳酸、乙酸、pH、還原糖)同主要的微生物屬進行相關性分析(圖6-b),根據相關性分析結果,發(fā)現同理化指標間相關性一樣,乙醇、水分、酸度、乳酸同乳酸桿菌屬呈顯著的正相關,pH和還原糖含量呈顯著負相關。因此我們將綜合理化指標,設立不同的參數,探究影響乳酸菌富集及產酸的原因。

2.5 不同培養(yǎng)條件對乳酸產量的影響

如圖7-a所示,好氧培養(yǎng)14 d乳酸含量為18.89 g/L,厭氧培養(yǎng)乳酸含量則為49.90 /L,顯著高于靜置時28.32 g/L的乳酸產量,因此氧氣是影響乳酸菌產酸的重要影響因素。通過將固態(tài)高粱培養(yǎng)基放入烘箱中控制其含水量在50%、45%、40%培養(yǎng)14 d(圖7-b),乳酸產量分別為28.32、20.71、17.39 g/L,可見培養(yǎng)基中水分的多少對乳酸菌屬產乳酸的影響較大,這和之前相關性分析結果一致,水分是窖內發(fā)酵的重要指標之一,水參與醬香型白酒發(fā)酵所有生化反應,是大多數微生物生長不可缺少的重要物質,微生物的生長和代謝與其存在的微環(huán)境的物質循環(huán)、能量流動和信息傳遞的“三流運轉”離不開水的直接或間接參與[11]。水分與發(fā)酵過程中其他指標相互影響,有研究表明水分與氧氣含量呈顯著負相關關系[25],因此,通過控制含水量導致的乳酸產量減少,可能和其引起的氧氣含量變化有關,即氧氣的增加抑制了偏好厭氧生長的乳酸菌的生長,從而導致乳酸產量降低。如圖7-c所示,通過往固態(tài)高粱培養(yǎng)基中添加100、200 g/L麥芽提取物,乳酸含量分別為43.87、51.89 g/L,麥芽提取物是一類含有豐富碳氮源的植物性營養(yǎng)物質,其可以顯著提升部分優(yōu)勢乳酸菌的生長富集速度以及產乳酸能力[26];添加600、900 μg/L的糖化酶,乳酸含量分別為19.26、29.26 g/L,可見添加更多的糖化酶,并不會明顯提升乳酸的生成(圖7-d);添加了30 g/L的乙酸(圖7-e),乳酸含量為17.08 g/L,可見高濃度的乙酸會抑制乳酸的產生,但是乳酸菌具有較強的酸耐受能力及抗脅迫能力,因此仍能代謝生成一定量的乳酸。先前的相關性分析發(fā)現,乙醇和乳酸菌呈顯著的正相關性,然而添加了30 g/L的乙醇(圖7-f),乳酸含量僅為15.67 g/L,可見直接添加乙醇不會促進乳酸菌的生長反而抑制了乳酸的產生,白酒發(fā)酵過程主要就是以酵母為主的微生物厭氧呼吸不斷積累乙醇的過程,部分異型乳酸發(fā)酵的乳酸菌同樣會代謝生成乙醇[27],因此隨著發(fā)酵的進行,乙醇、乳酸等代謝產物的不斷積累對乳酸菌的選擇馴化,導致其在群體中占據優(yōu)勢,呈現出高相關性,有研究表明乙醇對乳酸菌的抑制作用主要是通過破壞細胞膜功能[28],而在模擬發(fā)酵實驗中直接添加高濃度的乙醇,不可避免的對乳酸菌細胞膜的結構和功能產生了干擾,從而影響乳酸菌的生長代謝。

a-氧氣;b-含水量;c-麥芽提取物;d-糖化酶;e-乙酸;f-乙醇圖7 不同培養(yǎng)條件富集液的乳酸生成情況Fig.7 Lactic acid production in enriched solution under different culture conditions注:*表示P≤0.05。

3 結論

乳酸是醬香型白酒中最重要的一類有機酸,乳酸菌屬也是醬香型白酒酒醅中豐度最高的細菌。本研究通過研究乳酸含量增長速率最快的一輪次酒醅微生物群落構成,發(fā)現堆積階段和入窖階段的酒醅細菌組成存在較大差異,這主要是由乳酸菌在不同發(fā)酵階段的相對豐度變化引起。金山乳桿菌(L.jinshan)、耐酸乳桿菌(L.acetotolerans)、面包乳桿菌(L.panis)、食果糖乳桿菌(L.fructosus)、乳酸片球菌(P.acidilactici)等為一輪次酒醅中相對豐度最高的乳酸菌屬;對一輪次酒醅微生物的溯源分析發(fā)現,生產環(huán)境為堆積酒醅提供了大多數細菌(93.8%),乳酸菌主要來源于生產環(huán)境(包括車間過道及生產工具),而大曲中乳酸菌的含量較少。影響乳酸菌生長&乳酸積累的理化因素相關性分析和模擬固態(tài)發(fā)酵實驗表明,厭氧環(huán)境、高含水量以及豐富的底物會顯著促進乳酸菌的生長及產酸,高濃度乙醇和乙酸的添加會抑制乳酸的產生,然而乳酸菌對乙醇和乙酸仍具有較高的耐受性。后續(xù)的研究我們將會分離篩選出醬香型白酒中優(yōu)勢的乳酸菌種,通過比較基因組學結合可培養(yǎng)實驗,對其生長性狀包括營養(yǎng)底物利用、產酸、風味代謝的種間差異性進行具體分析研究,結合生產實際探究優(yōu)勢乳酸菌種在醬香型白酒發(fā)酵體系中快速富集的原因以及研究其與白酒發(fā)酵過程中其他關鍵微生物的相互作用,進一步解析醬香型白酒中乳酸積累的相關機制,實現對乳酸代謝的動態(tài)調控。