王麗,王薇薇,李愛科,陳麗仙,方俊,喬琳*

1(國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院,北京,100037)2(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙,410125)

益生菌作為一種活性微生態(tài)制劑,對人類和動物的健康有著舉足輕重的作用。益生菌不僅可以促進宿主腸道發(fā)育,提高消化能力和免疫力,還可以抑制有害菌生長,減少疾病的發(fā)生,在抗生素替代方面發(fā)揮著重要作用。

近年來,益生菌不僅被用于人類藥品和保健品,還廣泛用于動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中。但是在益生菌生產(chǎn)及使用過程中,不可避免的要受到高溫、脫水、氧化等不良環(huán)境的影響,導(dǎo)致細胞發(fā)生結(jié)構(gòu)或生理性損傷,從而降低益生菌的活力,嚴重制約了益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為使益生菌更好的發(fā)揮益生作用,必須保證產(chǎn)品在一定期限內(nèi)含有足夠含量的活菌數(shù),因此如何提高益生菌制劑穩(wěn)定性和耐受性成為國內(nèi)外研究的熱點。在生產(chǎn)工藝方面包括開發(fā)新型包被技術(shù)、篩選適宜的保護劑配方、優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)等后處理加工方式;在提升菌株耐熱能力方面,常用的方法有熱脅迫、酸脅迫、緩沖鹽脅迫、基因改造等。大量研究表明,微生物脅迫耐受性是受多種代謝途徑調(diào)控的復(fù)雜的生理過程。本文綜述了細胞膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、熱應(yīng)激蛋白、DNA/RNA穩(wěn)定性、滲透保護劑和群體感應(yīng)系統(tǒng)對菌體耐熱能力的影響,旨在為益生菌耐熱菌株的選育和應(yīng)用提供參考。

1 益生菌的熱損傷

細菌細胞天生就有多種防御機制,如輔助折疊錯誤蛋白質(zhì)的伴侶蛋白、降解不可逆損傷蛋白質(zhì)的蛋白酶、維持正確滲透壓的轉(zhuǎn)運系統(tǒng),處理活性氧的催化酶和超氧化物歧化酶,以及對抗細胞內(nèi)pH值下降的質(zhì)子泵、脫羧酶和轉(zhuǎn)運蛋白[1]。MOAYYEDI[2]在噴霧干燥鼠李糖桿菌ATCC 7469的過程中,關(guān)鍵細胞成分包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細胞膜和核糖體等,均受到了不同程度的熱損傷。ANANTA等[3]以鼠李糖桿菌GG為對象,用流式細胞術(shù)得出熱損傷的主要部位是細胞膜,因此細胞膜損傷是造成細胞死亡的主要因素之一。升溫過快導(dǎo)致膜蛋白熱變性、膜脂氧化等一系列損傷,是造成細胞膜通透性增加、生理功能喪失的主要原因。TEIXEIRA等[4]對保加利亞乳桿菌NCFB 1489的研究也表明隨著溫度升高,細胞膜脂肪酸先受熱損傷,隨后蛋白質(zhì)聚集,細胞膜逐漸瓦解,核糖體和RNA也接連發(fā)生損傷。由于DNA合成過程的起始和延續(xù)需要DNA復(fù)合物附著在細胞膜上完成,因此細胞膜及其表面相關(guān)蛋白的變化也在一定程度上影響了DNA的調(diào)控過程[5]。大于80 ℃的高溫環(huán)境足以使DNA雙螺旋解鏈,穩(wěn)定性下降,導(dǎo)致復(fù)制-轉(zhuǎn)錄-翻譯過程出現(xiàn)紊亂,導(dǎo)致一系列生理活動出現(xiàn)異常。

2 益生菌的耐熱機制研究進展

益生菌在脅迫條件下的適應(yīng)行為與細胞的組成結(jié)構(gòu)、生理代謝和調(diào)控過程都密切相關(guān),主要包括細胞膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、熱應(yīng)激蛋白、遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性、有機滲透劑以及細胞的群體感應(yīng)系統(tǒng)等[6]。

2.1 細胞膜結(jié)構(gòu)對益生菌菌株耐熱性能的影響

細胞膜是外界環(huán)境作用的首要靶點,細胞膜的主要成分包括磷脂(占20%～30%)和蛋白質(zhì)(占50%～70%),不僅具有屏障和運輸?shù)淖饔?還是合成細胞壁、糖被和能量的重要基地。嗜熱菌細胞膜上飽和脂肪酸占比很高,主要成分為甘油脂肪酰二酯形成的穩(wěn)定的疏水基團[7]。長鏈不飽和脂肪酸[8]和飽和脂肪酸[9]相對含量的提高有助于減少細胞膜的高溫損傷,因為較長的鏈可以進一步滲透到雙分子層中,增加層與層之間的?；溝嗷プ饔?降低膜流動性,促進結(jié)構(gòu)更加堅固。而脂肪酸飽和度對雙層結(jié)構(gòu)的影響大于鏈長,在細菌中,飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例是控制膜流動性的主要機制[10]。能夠增加細胞膜中飽和脂肪酸的含量被認為是在各種脅迫環(huán)境下成功生長的最重要因素之一,這些都已經(jīng)在嗜熱鏈球菌[11]、乳酸乳球菌、屎腸球菌[12]、片球菌屬[13]中得到驗證。屎腸球菌HL17細胞暴露于52 ℃ 15 min,不飽和脂肪酸的比例略有下降,熱適應(yīng)后的HL17存活率比非適應(yīng)菌耐H2O2(0.01%)、乙醇(20%)、酸(pH 3)、堿(pH 12)的存活率高103～105倍,耐60 ℃水浴的能力也顯著提高。

近年來,隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,大量通過影響細胞膜合成和代謝來影響菌體耐熱性的基因被發(fā)現(xiàn)。如通過提高乳酸乳球菌TOMSC161中環(huán)丙烷脂肪酸合成酶含量,可以提高環(huán)丙烷脂肪酸及其前體物質(zhì)油酸的含量,進而降低細胞膜流動性,增強了菌體冷凍和干燥脅迫耐受性[14]。磷脂酰絲氨酸合酶可以提高菌株的辛酸和總脂肪酸產(chǎn)量,進而導(dǎo)致細胞膜完整性增加、細胞膜和疏水核心區(qū)厚度增加,進而增加了菌株的耐高溫能力。同理,脂肪酸合成過程中關(guān)鍵基因[15](fabA、fabB、fabD、fabF)、關(guān)鍵酶(乙酰輔酶A羧化酶[16])的過表達均會增加菌體對外界脅迫的耐受性。

2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對益生菌耐熱性能的影響

蛋白質(zhì)是最不穩(wěn)定和最豐富的生物大分子物質(zhì),也有人提出細胞的熱敏感度取決于蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)組功能的喪失[17]。JARZAB等[18]對原核生物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究表明,蛋白質(zhì)組成、序列和大小影響熱穩(wěn)定性,并且蛋白質(zhì)的長度與其熱穩(wěn)定性存在負相關(guān)。嗜熱菌蛋白質(zhì)中的脯氨酸(Pro)、異亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)的含量高于常溫菌蛋白質(zhì),而半胱氨酸(Cys)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)的含量顯著低于常溫菌蛋白[19]。LEUENBERGER等[20]研究也表明,蛋白質(zhì)長度是蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的決定因素,并且穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)通常富含賴氨酸和β-sheet結(jié)構(gòu)。因此,影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不僅僅是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),還有他們之間的相互作用。例如,嗜熱微生物中的二硫鍵[21]、蛋白質(zhì)鹽橋數(shù)量[22]均對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性起著關(guān)鍵的作用。同時,關(guān)鍵區(qū)域某個氨基酸改變也許會造成高級結(jié)構(gòu)的改變,增加酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水鍵、氫鍵或離子鍵,改變其熱穩(wěn)定性[23]。

2.3 熱應(yīng)激蛋白對益生菌菌株耐熱性能的影響

熱激蛋白又稱熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs),是細胞在應(yīng)激狀態(tài)下重新合成或合成量增加的一類高度保守性蛋白[24]。熱應(yīng)激蛋白主要負責初期蛋白和受損蛋白的折疊、寡聚蛋白的合成或分解、跨膜運輸、促進不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的降解、減少其聚集。氯霉素(100 mg/mL)具有抑菌作用,可阻斷蛋白質(zhì)合成,可用于檢查蛋白質(zhì)合成是否是熱應(yīng)激所必須的,在應(yīng)激過程中添加氯霉素,屎腸球菌沒有表現(xiàn)出熱適應(yīng)反應(yīng),說明屎腸球菌的熱適應(yīng)是依賴于蛋白質(zhì)合成的誘導(dǎo)[25]。嗜熱菌富含熱應(yīng)激蛋白,如HSP70、HSP60、小分子熱休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)、前折疊素(prefoldin,PFD)、泛素等。

多種益生菌在經(jīng)歷亞致死脅迫處理后會產(chǎn)生數(shù)十種熱應(yīng)激蛋白(如DnaJ、DnaK、GroES、GrpE、GroEL等),糖酵解相關(guān)蛋白、ATP酶亞基等蛋白[26]和小的熱休克蛋白(Hsp1和3)均呈上調(diào)趨勢[27]。熱激蛋白中分子伴侶體系GroES-GroEL和DnaK-GrpE-DnaJ對于修復(fù)高溫損壞的蛋白質(zhì),并維持細胞在高溫中的存活率起著至關(guān)重要的作用[28-29]。熱應(yīng)激蛋白GroESL由GroEL和輔因子GroES組成。將耐溶劑惡臭假單胞桿菌的GroESL基因?qū)氪竽c桿菌后會增強大腸桿菌的耐溫能力[30]。DanK需要與輔分子伴侶DnaJ和核苷酸交換因子GropE共同完成菌體蛋白的折疊。研究表明,過表達或?qū)胪庠吹腄naK(大腸桿菌)基因后,乳酸乳球菌NZ9000的耐高溫能力均顯著提高。同樣的,將外源的DnaK導(dǎo)入大腸桿菌JM109、短小芽孢桿菌B3[31]、中鏈球菌NCDO2227[32]和枯草芽孢桿菌446[33]中,均顯著的提高了菌株的耐熱能力。熱誘導(dǎo)的100 kDa蛋白可能與熱休克蛋白100/Clp家族有關(guān),該家族參與耐熱性[34],染色體編碼的CLpC、ClpP、ClpE類熱休克蛋白參與單核細胞增生李斯特菌的毒性和應(yīng)激耐受性[35],將ATP依賴蛋白酶(ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit,ClpL)基因?qū)胩烊粺崦舾械睦钏固鼐?可顯著提高耐熱性。

生物體中含有很多小分子熱應(yīng)激蛋白,他們也能夠阻止蛋白質(zhì)的聚集,幫助折疊變性的蛋白。將長雙歧桿菌 NCC2705中熱應(yīng)激蛋白Hsp20過表達可以提高菌株的耐鹽和耐高溫性能[36]。小分子熱激蛋白(CEHSP7)能夠維持高溫下細胞外膜的穩(wěn)定性,將其導(dǎo)入大腸桿菌BW25113中后菌株可在50 ℃下生長[37]。熱激蛋白TTE2469(編碼泛素)、IbpA(Hsp20家族)和GroS2(Hsp10家族)在維持細胞壁完整性、海藻糖的積累和產(chǎn)生能量上起到一定的作用,將其導(dǎo)入釀酒酵母后可以提高菌株對發(fā)酵溫度的耐受范圍(28～35 ℃)[38]。

2.4 DNA/RNA穩(wěn)定性對益生菌菌株耐熱性能的影響

高溫會引起核苷酸鏈斷裂或阻礙DNA、RNA修復(fù),破壞基因組的完整性。DNA的重組和修復(fù)蛋白RecA可與單鏈DNA結(jié)合,誘導(dǎo)包括自身在內(nèi)的多個DNA修復(fù)基因的表達,被認為是與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。大多數(shù)嗜熱微生物耐溫能力與(G+C)%之間存在正相關(guān)關(guān)系,棲熱嗜熱菌(G+C)%含量高達55.2%,有利于在高溫下存活[39]。在高溫的刺激下,菌體內(nèi)會產(chǎn)生反解旋酶結(jié)合在DNA鏈上,防止超螺旋結(jié)構(gòu)解鏈,維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性[40]。在熱激蛋白mRNA的非編碼區(qū),形成一個頸環(huán)結(jié)構(gòu),將核糖體結(jié)合位點(ribosomal binding site,RBS)和起始密碼子“保護起來”,我們稱之為RNA溫度計[41]。當環(huán)境溫度較高時,RNA溫度計中氫鍵結(jié)構(gòu)被破壞,頸環(huán)結(jié)構(gòu)被打開,暴露出RBS和起始密碼子,熱激蛋白大量表達,發(fā)揮特殊的耐熱生理功能。“DNA/RNA解旋酶”的基因與一個死盒RNA解旋酶相關(guān),屬于SNF2亞家族。死亡盒蛋白是與核糖核酸代謝和細胞過程相關(guān)的保守核糖核酸解旋酶[42]。最近的研究表明,死盒RNA解旋酶與多重脅迫抗性有關(guān),包括單核細胞增生李斯特菌F2365對低溫的抗性[43],以及蠟狀芽孢桿菌 ATCC 14579對堿和熱脅迫的抗性[44]。

2.5 有機滲透保護劑對益生菌菌株耐熱性能的影響

有機滲透保護劑在真核生物和細菌中廣泛存在,屬于一種非離子、高水溶性分子,包括糖、多元醇、氨基酸及其衍生物。他們可以從頭合成或者從周圍環(huán)境中吸收并累計,不會干擾代謝。他們的主要作用包括:a)穩(wěn)定膜和DNA完整性;b)提高細菌的耐熱、酸堿脅迫和滲透脅迫能力;c)提高抗氧化應(yīng)激能力。

極端環(huán)境微生物含有的一種極端環(huán)境滲透調(diào)節(jié)物—四氫嘧啶,具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)、核酸和生物膜的功能,滲透調(diào)節(jié)能力要更強于其他滲透調(diào)節(jié)物,如海藻糖、蔗糖和甘氨酸甜菜堿。當細胞需要調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓力時,優(yōu)先選擇積累甘氨酸甜菜堿及它的供體脯氨酸、甜菜堿或者膽堿,其次才會積累谷氨酸和海藻糖調(diào)節(jié)滲透壓。而海藻糖相較于其他糖類更能保護生物分子和膜的穩(wěn)定性和滲透調(diào)節(jié)性[45],而且在細胞層面,海藻糖在耐熱方面的研究最多。

在高溫脅迫下,酵母菌體內(nèi)累積海藻糖比產(chǎn)生熱休克蛋白更加重要[46]。海藻糖合成基因otsB、otsA和treS過表達,均能提高簡單節(jié)桿菌 CPCC 140451的耐受性,并且otsB的效果最好[47]。敲除李斯特氏菌中的海藻糖降解基因TreA以后,菌體對熱的耐受性也會得到提高。研究表明,將編碼甘氨酸甜菜堿合成的兩種酶膽堿單加氧酶和甜菜堿醛脫氫酶的基因?qū)氘叧嘟湍妇?提高了該菌株耐甲醇和高溫脅迫能力[48]。

2.6 群體感應(yīng)系統(tǒng)對益生菌菌株耐熱性能的影響

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)指細菌在增殖過程中,隨著菌體密度的增加,不斷向周圍環(huán)境分泌特定的信號分子,即自誘導(dǎo)肽(autoinducer peptide,AIP)。群體感應(yīng)系統(tǒng)可以增加生物膜的形成,促進細菌素的分泌,提升菌體抗脅迫能力。生物膜是由細菌胞體、胞外基質(zhì)和其他顆粒物的混合物所組成的膜系統(tǒng),生物膜含量的提高有助于乳酸菌耐熱性的提高[49]。胞外多糖被證明是高度熱敏感物質(zhì),在經(jīng)歷較高溫度后將很大程度被破壞,因此其提供的物理性保護作用非常微弱[50]。脂磷壁酸與細菌細胞壁上的耐熱蛋白互相黏連,并且延伸于胞壁之外,說明脂磷壁酸可以在一定程度上穩(wěn)定耐熱蛋白,有利于保持菌株耐熱性[51]。

在革蘭氏陽性細菌中存在2種群體感應(yīng)系統(tǒng),一種是依賴于寡肽信號分子AgrD的群體感應(yīng)系統(tǒng),另一種是LuxS/AI-2(autoinducer 2,AI-2)系統(tǒng)。當AIP在胞外達到一定的閾值時,胞體通過群體感應(yīng)系統(tǒng)感受到自身的細胞密度,啟動相應(yīng)基因的表達。AIP分子在胞內(nèi)以前體肽形式合成,經(jīng)過翻譯加工修飾成成熟的AgrD,這類分子需要位于細胞外膜上特定的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(ATP binding cassette)或其他外膜通道蛋白才能運輸?shù)桨?。當胞外AIP分子達到濃度閾值時,閾值A(chǔ)IP激活A(yù)grC(受體蛋白)結(jié)合成熟AIP,通過組氨酸激酶和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成的雙組份傳導(dǎo),實現(xiàn)對下游基因的調(diào)控(圖1)。當外部條件,如溫度、氧氣和營養(yǎng)條件發(fā)生變化時,群體感應(yīng)基因luxS和信號分子AI-2的合成被上調(diào),導(dǎo)致顯著的生物膜積累。LEBEER等[52]添加了生物膜抑制劑D-半乳糖到植物乳桿菌GG的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn),luxs和cysE(絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶)的表達被抑制,并減少了細胞外基質(zhì)中的脂蛋白合成,導(dǎo)致生物膜基質(zhì)的淀粉樣變性、生物膜形成的減少和菌株對不利環(huán)境的抗性減弱。

圖1 革蘭氏陽性菌QS系統(tǒng)模式圖Fig.1 QS system pattern of Gram-positive bacteria

革蘭氏陰性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要是由[N-3-(oxohexanoyl)homoserinelacton, AHL]類信號分子及其受體蛋白組成,所有以?；呓z氨酸內(nèi)脂類化合物AHL為信號分子的細菌均利用Luxl/LuxR的蛋白系統(tǒng)進行調(diào)控。AHL類信號分子包含一個高絲氨酸內(nèi)脂環(huán)和一個酰胺鏈(圖2)。在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)5個質(zhì)粒的存在可以增加生物膜的產(chǎn)生,包括一個含有幾個抗微生物耐藥性基因(anti-microbial resistance, AMR),一個重金屬抗性操縱子,一個消毒劑抗性基因、一個β-內(nèi)酰胺酶基因(TEM-1)和mrkABCDF操縱子;含mrk的質(zhì)粒和K-12MG1655的結(jié)合導(dǎo)致更多生物膜的產(chǎn)生。另有研究表明,CysE基因的上調(diào)主要促進小分子的代謝、有機化合物的生物合成、α-氨基酸的生物合成、細胞的生物合成和細胞組成的變化,從而有利于生物膜的形成[53]。

圖2 革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)模式圖Fig.2 Gram negative bacteria QS system pattern diagram

3 提高益生菌菌株耐熱性常用的手段

強健的耐熱菌株在高溫下具有維持其細胞大小的能力[54]。為了提高菌株耐熱性能,常用的方法有熱脅迫、酸脅迫、緩沖鹽脅迫、輻照誘變及基因改造等。適宜的熱應(yīng)激處理促使菌株產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),提高菌株在高溫中的耐受性,應(yīng)激溫度一般高于最適生長溫度5～10 ℃[55]。研究發(fā)現(xiàn),將副干酪乳桿菌在52 ℃中保持15 min后,菌體細胞在60 ℃中耐熱存活率可以提升300～700倍,噴霧干燥存活率提升了18倍。Min用連續(xù)熱馴化的方式馴化屎腸球菌和嗜熱鏈球菌,菌株的耐熱能力提高了20%。熱脅迫允許細胞表達應(yīng)激反應(yīng)蛋白,這樣細胞就可以準備其系統(tǒng)來管理更嚴重的應(yīng)激。酸處理可提高乳酸乳桿菌NCDO 712的耐熱、耐乙醇、耐H2O2(1.15 mmol/L)、耐NaCl(200 g/L)性能,而只有熱應(yīng)激能提高其耐酸性[56]。然而,也有一些報道表明,除熱脅迫外,其他脅迫處理也可以提升益生菌的耐熱性能。ARDANARESWARI等[57]的研究表明,熱適應(yīng)和酸堿度聯(lián)合預(yù)處理副干酪乳桿菌 SNP2后,觸發(fā)了該菌株應(yīng)激反應(yīng)蛋白DnaK、DnaJ、GroES、GroEL和GrpE的更高轉(zhuǎn)錄水平,與單獨應(yīng)激相比聯(lián)合脅迫處理表現(xiàn)出最佳的抗熱能力。HUANG等[58]研究表明,弗羅伊德雷契丙酸桿菌ITG P20在高濃度高滲培養(yǎng)基中通過滲透脅迫使得相容性溶質(zhì)在細胞內(nèi)積累,從而提高了菌株的多種抗性,包括耐熱性。劉珊珊[59]對酵母菌株AY12進行等離子誘變后再進行41 ℃及42 ℃高溫連續(xù)馴化,使其56 ℃處理3 min存活率提升了84.68%。魯明波等[60]用紫外線誘變鼠李糖乳桿菌獲得了9株耐高溫菌株,產(chǎn)酸能力也提高了18.1 g/L。脅迫應(yīng)激和輻照誘變的方法雖然對菌株耐高溫能力具有提升作用,但是存在工作量大、周期長、定向性差等缺點。而利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),通過對菌株進行基因改造獲得優(yōu)良特性的手段更為直接和高效。如通過構(gòu)建磷脂酰絲氨酸合酶和順反異構(gòu)酶(cis/trans isomerase,Cti)過表達工程菌株,可以提高大腸桿菌的耐高溫能力[61]。通過構(gòu)建DnaK過表達的乳酸乳球菌NZ9000,耐高溫能力顯著提升[62]。

4 展望

近年來隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,人們對益生菌的耐熱性能的研究越來越深入。雖然已經(jīng)有了大量文獻證明基因改造手段可以提高菌體耐熱性能,但是在非模式菌株中研究較少,在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中也鮮有報道。其主要原因可能為目前缺乏針對包括益生菌在內(nèi)的非模式微生物菌種的基因操作系統(tǒng),而且利用分子生物學(xué)手段對益生菌改造后可能會涉及到轉(zhuǎn)基因菌株安全性的評估,發(fā)酵特性和益生特性的變化,這些因素勢必影響到轉(zhuǎn)基因益生菌的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用,需要相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者進行更加系統(tǒng)和深入的研究。