王圓圓，李 寧，賈浩程，戶瑞剛，曹玲芝，肖 琎

（1.唐山市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北唐山 063000；2.遵化市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北遵化 064200；3.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北唐山 063000；4.唐山市動(dòng)物檢疫站，河北唐山 063000；5.衡水市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北衡水 053000）

我國(guó)是世界上最大的水禽生產(chǎn)國(guó)，其中鴨飼養(yǎng)量占我國(guó)水禽飼養(yǎng)總量的70%以上，鴨蛋消費(fèi)量占禽蛋總消費(fèi)量的30%以上[1]。在綠色發(fā)展理念的倡導(dǎo)下，蛋鴨養(yǎng)殖方式逐步從傳統(tǒng)水養(yǎng)轉(zhuǎn)為離水旱養(yǎng)[2]。為減少養(yǎng)殖過程中疾病的發(fā)生，養(yǎng)殖者通常使用抗生素進(jìn)行預(yù)防及治療。但是目前抗生素濫用、誤用以及不按休藥期使用等現(xiàn)象頻發(fā)，抗生素殘留超標(biāo)已成為鴨蛋中藥物殘留的主要指標(biāo)，嚴(yán)重影響著人們的飲食安全[3-5]。

硝基咪唑類藥物具有致突變性和潛在的致癌性，被許多國(guó)家列為違禁藥物[6]。在我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中，甲硝唑、地美硝唑被列為不得在動(dòng)物性食品中檢出的獸藥[7-8]。

甲硝唑、地美硝唑及其代謝標(biāo)志物殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前檢測(cè)甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留的首選方法[9-11]。本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量方式，通過校正基質(zhì)效應(yīng)，提高了分析準(zhǔn)確性，為鴨蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留測(cè)定提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀、三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜儀（5 500+），均為AB SCIEX公司產(chǎn)品；MEP固相萃取柱3 CC，為上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；Oasis MCX 固相萃取柱3 CC（60 mg），為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Syncore Plus多樣品平行蒸發(fā)定量濃縮儀，為瑞士步奇有限公司產(chǎn)品；多管渦旋振蕩器，為德國(guó)Heidoph公司產(chǎn)品；氮吹儀，為杭州聚同電子有限公司產(chǎn)品；高功率超聲波清洗器，為昆山市超聲波儀器有限公司產(chǎn)品；低溫冷凍離心機(jī)，為美國(guó)賽默飛科技有限公司產(chǎn)品。

甲硝唑、甲硝唑-D3、羥基甲硝唑、羥基甲硝唑-D2、地美硝唑、二甲硝咪唑-D3、羥基地美硝唑、羥甲基甲硝咪唑-D3等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、異丙醇（均為色譜純）以及0.45、0.22 μm濾膜，均購(gòu)自美國(guó)Dikma公司；五氟苯基色譜柱100A（2.6 μm，100 mm×2.1 mm），為美國(guó)Phenomenex公司產(chǎn)品。檸檬酸緩沖溶液配制：取21 g一水合檸檬酸和20 g六水合氯化鎂溶于900 mL水中，以氨水調(diào)節(jié)pH為2.5，最后用水定容至1 L。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別將甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑和對(duì)應(yīng)的4種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度均為100 μg/mL），用甲醇稀釋定容為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液（10 μg/mL），-20 ℃保存。

分別準(zhǔn)確移取甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液以及4種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液，用甲醇-水（v:v= 1:1）稀釋，配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液以及混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將8份鴨蛋空白樣品，經(jīng)過前處理制成空白基質(zhì)溶液。用鴨蛋空白基質(zhì)溶液將甲硝唑等4種混合物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的系列溶液，4種對(duì)應(yīng)混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為5.0 μg/L，將8種濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液分別上機(jī)后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5 g（精確至0.01 g）放入50 mL離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL；依次加入2.5 mL檸檬酸緩沖液、15 mL乙腈溶液，4 000 r/min渦旋混合提取5 min；5 000 r/min離心5 min，取上清液至平行蒸發(fā)蒸餾瓶中，按照上述步驟重復(fù)提取并附加超聲波提取10 min；合并提取液，加入3 mL異丙醇，（40 ± 1）℃蒸發(fā)濃縮至5 mL以下，將蒸發(fā)后的濃縮液轉(zhuǎn)移至新離心管；用檸檬酸緩沖液（10 mL）潤(rùn)洗蒸餾瓶，8 000 r/min低溫離心10 min，以0.45 μm濾膜過濾，待凈化。

將MEP柱和MCX固相萃取柱按照自上而下順序安裝好，依次用2.5 mL甲醇、2.5 mL水、2.5 mL檸檬酸緩沖液（pH 2.5）活化，將全部?jī)艋和ㄟ^凈化柱；依次用3 mL檸檬酸緩沖液（pH 2.5）、3 mL水、3 mL甲醇-水（v:v= 1:19）淋洗固相萃取柱；去掉MEP柱，依次用2 mL甲醇、4 mL氨水-甲醇（v:v= 1:19）洗脫MCX固相萃取柱的待分析成分；收集洗脫液，在45 ℃條件下以氮?dú)獯抵粮?；用甲?0.1%甲酸水（v:v=1:10）溶液溶解殘?jiān)?，?.22 μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：五氟苯基色譜柱；進(jìn)樣體積3 μL，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃；流動(dòng)相溶劑A為0.1%甲酸水，溶劑B為甲醇。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子掃描模式：以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描，電噴霧電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，氣簾氣壓力35 psi，輔助氣壓力50 psi。4種硝基咪唑類藥物定量、定性離子對(duì)信息見表2。

表2 4種硝基咪唑類藥物質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑選擇

本試驗(yàn)分別將乙酸乙酯、乙腈、甲醇等3種有機(jī)試劑與檸檬酸緩沖液（pH 2.5）進(jìn)行搭配組合提取，并分別比較了鴨蛋中加標(biāo)回收率。結(jié)果表明：乙腈+檸檬酸緩沖液（pH 2.5）混合提取的加標(biāo)回收率最高，4種待測(cè)物質(zhì)的加標(biāo)回收率均在90%～110%范圍內(nèi)。鴨蛋富含蛋白質(zhì)、磷脂等成分，在提取過程中，先加入檸檬酸緩沖液，利用鹽析作用使鴨蛋中蛋白質(zhì)緩慢沉淀，酸性條件下更有利于提高4種硝基咪唑類藥物的回收效率。加入異丙醇可以在平行蒸發(fā)過程中降低溶液中氣泡的產(chǎn)生，減少待測(cè)物損失。經(jīng)綜合考慮，采用檸檬酸緩沖液（pH 2.5）+乙腈作為提取溶劑，其效果最好。

2.2 提取方式優(yōu)化

本試驗(yàn)對(duì)使用提取液提取1次與2次的效果進(jìn)行了比較驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4種硝基咪唑類藥物的加標(biāo)回收率均為90%～110%，但是兩種提取方式的結(jié)果偏差分別為12.2%～15.3%和4.5%～8.7%，所以提取2次的方式結(jié)果更為穩(wěn)定，準(zhǔn)確性更好。本試驗(yàn)還比較了渦旋震蕩提取和超聲波助提對(duì)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波助提有利于提升回收結(jié)果的穩(wěn)定性，偏差相對(duì)較小，超聲波提取1次與2次對(duì)回收結(jié)果基本無影響。此外，分別比較了超聲5、10、15 min的回收效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲10 min的效果最好。提取方式采用渦旋+超聲的處理方式，簡(jiǎn)單方便且回收效果良好。因此，本試驗(yàn)采用混合溶劑提取2次，并在第2次采用超聲波助提10 min的方式。

2.3 固相萃取柱選擇

本試驗(yàn)比較了ProElut SCX（Dikma公司）、CNW Poly-Sery MCX SPE（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、Oasis MCX（Waters公司）3種混合陽(yáng)離子固相萃取柱（規(guī)格均為3CC，60 mg）對(duì)回收效果的影響。結(jié)果顯示，甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑在10 ng/kg添加水平下，ProElut SCX固相萃取柱的平均回收率分別為70.3%、67.4%、73.3%、71.2%；CNW Poly-Sery MCX SPE固相萃取柱的平均回收率分別為85.3%、83.8%、79.5%、80.4%，Oasis MCX固相萃取柱的平均回收率分別為98.2%、95.3%、94.9%、92.7%。綜上，本試驗(yàn)優(yōu)選Oasis MCX固相萃取柱。試驗(yàn)表明，不同廠家的固相萃取柱在回收效果上存在差異，這可能與固相萃取柱的填料、交換基團(tuán)等存在差異有關(guān)。固相萃取技術(shù)種類繁多，因此選擇合適的固相萃取柱顯得尤為重要。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

為驗(yàn)證本試驗(yàn)方法去除基質(zhì)干擾的效果，在空白鴨蛋樣品中添加10 ng/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，根據(jù)相同濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)強(qiáng)度與空白添加樣品提取后的響應(yīng)強(qiáng)度的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）。經(jīng)計(jì)算，鴨蛋中4種硝基咪唑類藥物的ME為0.88～1.09，提示ME不明顯。ME主要分為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)減弱效應(yīng)，均影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。為減少M(fèi)E的干擾，本研究?jī)?yōu)化前處理，提高凈化效果，引入內(nèi)標(biāo)校正，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 液相色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

本試驗(yàn)分別將甲醇、乙腈作為有機(jī)相，并與作為水相的純水和0.1%甲酸-水進(jìn)行混合搭配驗(yàn)證，比較等度洗脫與梯度洗脫時(shí)4種硝基咪唑類藥物的相應(yīng)度及分離度。結(jié)果顯示：梯度洗脫時(shí)，甲醇作為有機(jī)相，0.1%甲酸-水作為水相，4種硝基咪唑類藥物的響應(yīng)值及峰形較好。本試驗(yàn)還分別比較驗(yàn)證了BEH C18、HSS T3、Hypersil GOL、Kinetex F5等色譜柱的響應(yīng)值及色譜峰形，發(fā)現(xiàn)4種色譜柱在保留時(shí)間和響應(yīng)值上有差異。綜合考慮發(fā)現(xiàn)，五氟苯基色譜柱（Kinetex F5）100A（2.6 um，100 mm×2.1 mm）的響應(yīng)值及峰形最佳（圖1）。不同規(guī)格的色譜柱分離效果不同，尤其是保留時(shí)間、響應(yīng)值的差異明顯。因此在方法開發(fā)時(shí)，可以嘗試使用不同規(guī)格的色譜柱，選擇效果最佳的。

圖1 4種硝基咪唑類藥物（4 μg/L）及其內(nèi)標(biāo)物離子色譜圖

2.6 線性關(guān)系及檢出限、定量限

將4種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)工作液用鴨蛋空白基質(zhì)溶液，分別配制成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為5 μg/L，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，4種硝基咪唑類藥物在0.5～200.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.997。以3倍基線噪聲確定檢出限，10倍基線噪聲確定定量限，4種硝基咪唑類藥物檢出限為0.21～0.29 μg/kg，定量限為0.70～0.96 μg/kg（表3）。靈敏度的高低一般用檢出限和定量限表示，二者值越小，表明方法靈敏度越高。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法靈敏度高。

表3 4種硝基咪唑類藥物的線性方程、檢出限和定量限

2.7 精密度與加標(biāo)回收率

選取鴨蛋空白樣品，添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/kg），加入內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)（n= 6），以基質(zhì)內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果（表4）顯示，4種硝基咪唑類藥物的加標(biāo)回收率為90%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為4.76%～7.17%。精密度是指在同樣試驗(yàn)條件下，反復(fù)測(cè)量相同基質(zhì)樣品所得測(cè)量值之間的接近程度。一般來說，回收率越高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，表明此方法越可靠。本研究數(shù)據(jù)表明，所建立的方法可靠。

2.8 實(shí)際樣品分析

采用該方法對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)售賣鴨蛋中的4種硝基咪唑類藥物殘留情況進(jìn)行檢測(cè)，共計(jì)檢測(cè)56份樣品，結(jié)果檢出甲硝唑藥物殘留樣品1份，定量結(jié)果為1.05 μg/kg，其他3種藥物均未被檢出，表明硝基咪唑類藥物在動(dòng)物源性食品中添加的非法行為依然存在。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了鴨蛋中4種硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)方法，以內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果更為準(zhǔn)確，顯著提高了分析的靈敏度、精密度。該方法回收率高、準(zhǔn)確性好，完全滿足4種硝基咪唑類藥物殘留的定性、定量需求，可為食品中污染物監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)支撐。