劉志杰　鄭啟鵬　徐曉丹　王瓊　李夢(mèng)迪　張聰　王智茹　詹江華

摘要：目的 探討CD163在膽道閉鎖（BA）患兒中的表達(dá)及其與肝纖維化的關(guān)系。方法 收集30例BA患兒（BA組，肝纖維化Ⅰ～Ⅱ級(jí)14例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)16例）、10例膽總管囊腫患兒（CC組），獲取2組肝組織樣本和血液標(biāo)本。通過(guò)免疫組化染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2組肝組織和血液中CD163表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)可溶性CD163（sCD163）表達(dá)，受試者工作特征（ROC）曲線分析sCD163評(píng)估BA肝纖維化中的價(jià)值。結(jié)果 免疫組化染色和流式細(xì)胞術(shù)提示，BA組肝組織和血液中CD163表達(dá)水平高于CC組（P＜0.01），且隨著肝纖維化程度增加而升高（P＜0.01），sCD163表達(dá)亦呈相同變化。sCD163預(yù)測(cè)BA的ROC曲線下面積為0.927，最佳臨界值為8.323 ?g/L，敏感度為86.67%，特異度為100%。結(jié)論 BA患兒CD163表達(dá)上調(diào)，加速肝纖維化進(jìn)程；sCD163能夠較準(zhǔn)確反映BA患兒肝纖維化嚴(yán)重程度。

關(guān)鍵詞：膽道閉鎖；肝纖維化；CD163

中圖分類(lèi)號(hào)：R726文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221539

Expression and clinical significance of CD163 in hepatic fibrosis with biliary atresia

LIU Zhijie ZHENG Qipeng XU Xiaodan WANG Qiong LI Mengdi

ZHANG Cong WANG Zhiru ZHAN Jianghua

1 Graduate School of Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China; 2 Department of General Surgery，

Tianjin Children's Hospital

Corresponding Author E-mail： zhanjianghuatj@163.com

Abstract： Objective To investigate the expression of CD163 in children with biliary atresia （BA） and its relationship with liver fibrosis. Methods A total of 30 children with BA （the BA group， 14 patients with liver fibrosis grade Ⅰ-Ⅱ， 16 patients with liver fibrosis grade Ⅲ-Ⅳ） and 10 children with choledochal cyst （the CC group） were collected. Samples of? liver tissue and blood were obtained from the 2 groups. The expression levels of CD163 in liver tissue and blood of the two groups were detected by immunohistochemistry and flow cytometry. The expression of sCD163 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and the value of sCD163 in evaluating BA liver fibrosis was analyzed by receiver operating characteristic curve （ROC）. Results Immunohistochemical staining and flow cytometry indicated that CD163 expression levels in liver tissue and blood were significantly higher in the BA group than those in the CC group （P＜0.01）， and which increased with the increased severity of liver fibrosis （P＜0.01）. The expression of sCD163 also showed the same change. sCD163 predicted BA with an area under the ROC curve of 0.927， a best threshold value of 8.323 ?g/L， a sensitivity of 86.67% and a specificity of 100%. Conclusion The expression of CD163 is up-regulated in children with BA， which accelerates the process of liver fibrosis. sCD163 can accurately reflect the severity of liver fibrosis in children with BA.

Key words： biliary atresia; hepatic fibrosis; CD163

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是一種嬰兒期閉塞性纖維炎癥性膽管疾病，以肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥及肝纖維化為主要病理特征［1］。雖然肝門(mén)空腸吻合術(shù)（Kasai術(shù)）大大改善了BA患兒預(yù)后，但膽管增生和肝纖維化持續(xù)存在［2］。肝纖維化是BA重要的病理過(guò)程，因此評(píng)估和監(jiān)測(cè)肝纖維化進(jìn)程至關(guān)重要［3］。肝巨噬細(xì)胞參與炎癥、組織修復(fù)和自身免疫期間的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，并釋放多種促炎和趨化因子，通過(guò)降解基質(zhì)膠原和調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞來(lái)促進(jìn)肝纖維化。肝巨噬細(xì)胞通常分為經(jīng)典活化促炎M1型和選擇性活化抗炎M2型，其中M2型是促纖維化的主要表型。CD163主要表達(dá)于M2型巨噬細(xì)胞，是血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物的受體，也是巨噬細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物，該受體以可溶性形式存在于血液中，通常表示為血清可溶性CD163（soluble CD163，sCD163）。sCD163激活后從巨噬細(xì)胞中釋放出來(lái)，血液循環(huán)中sCD163表達(dá)水平可反映巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)［4］。Gr?nb?k等［5］研究認(rèn)為sCD163與肝病患者的疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并可預(yù)測(cè)肝纖維化。本研究旨在探討通過(guò)檢測(cè)CD163、sCD163在BA肝纖維化中肝組織和血液中表達(dá)情況來(lái)評(píng)價(jià)其與BA肝纖維化的關(guān)系，分析sCD163在評(píng)估BA肝纖維化中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2019年3月—2021年12月因黃疸在天津市兒童醫(yī)院就診的患兒40例。其中BA 30例，膽總管囊腫（choledochus cyst，CC）10例。2組日齡分別為64（48，76）d、80（41，126） d（Z=0.750，P＞0.05），男女比例分別為16/14、4/6（χ2=0.533，P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）BA組。術(shù)中膽道造影和病理檢查明確為BA，未合并其他系統(tǒng)畸形。（2）CC組。明確診斷為膽總管囊腫且行肝管空腸吻合術(shù)，未合并其他系統(tǒng)畸形。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他嚴(yán)重疾病或嚴(yán)重感染性疾病。（2）病歷資料不完整。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)（倫理批號(hào)：2021-YKY-01）。納入研究的所有患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 CD163工作液，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記通用型二抗、PE抗人CD163抗體、封閉用羊血清、過(guò)氧化酶封閉液、DAB染色試劑均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)置于北京天根生化科技有限公司；人sCD163酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海凡科維生物科技公司。

1.3 研究方法

1.3.1 肝組織纖維化程度評(píng)價(jià)和肝功能生化指標(biāo)檢測(cè) 分別調(diào)取BA組和CC組肝臟組織標(biāo)本的HE病理切片，由專(zhuān)業(yè)病理科醫(yī)生根據(jù)Ohkumas分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［6］評(píng)估肝組織纖維化程度。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)纖維化；Ⅰ級(jí)，肝門(mén)管區(qū)輕度纖維化；Ⅱ級(jí)，鄰近門(mén)管區(qū)輕度橋接纖維化；Ⅲ級(jí)，橋接纖維化擴(kuò)大；Ⅳ級(jí)，肝硬化、假小葉形成。30例BA組患者中，Ⅰ～Ⅱ級(jí)14例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)16例；10例CC組的肝組織中未見(jiàn)纖維化，為0級(jí)。收集BA組術(shù)前血液標(biāo)本經(jīng)全自動(dòng)生化儀檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TB）、直接膽紅素（DB）水平，分析上述指標(biāo)與肝纖維化分級(jí)的關(guān)系。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝組織CD163表達(dá) 2組肝組織病理切片經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)、封閉等過(guò)程后，滴加CD163一抗，置于冰箱4 ℃過(guò)夜。次日取出切片，置于室溫30 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）震蕩沖洗3次，每次5 min。滴加HRP標(biāo)記通用型二抗孵育30 min，PBS沖洗3次后，滴加DAB試劑，顯微鏡下觀察顯色后，充分水洗，蘇木精染核，梯度乙醇脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)束后，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。利用Image-pro plus軟件進(jìn)行半定量分析，并計(jì)算平均光密度值（AOD），即每個(gè)視野的肝臟組織陽(yáng)性細(xì)胞光密度總和/陽(yáng)性面積。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血液中CD163表達(dá) 將所收集的BA組和CC組血液樣本，于使用前1 d置于4 ℃過(guò)夜，取0.5～1 mL全血，加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫下裂解10 min；離心10 min去上清液，收集細(xì)胞沉淀；細(xì)胞沉淀加入1 mL PBS洗1～2次；加入1 mL多聚甲醛固定細(xì)胞，4 ℃保存；將固定的細(xì)胞離心10 min收集，用PBS洗2～3次，100 ?L PBS重懸細(xì)胞，加入PE抗人CD163抗體1 μg，避光孵育15 min。再用PBS洗滌細(xì)胞2次，之后500 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)CD163表達(dá)。

1.3.4 ELISA檢測(cè)sCD163表達(dá) 所收集BA組和CC組血清樣本，使用前1 d置于4 ℃過(guò)夜，檢測(cè)前1 h將血清樣本置于室溫待用。采用人sCD163 ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出直線回歸方程，計(jì)算出每孔樣本濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別采用GraphPad Prism8和SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以［M（P₂₅，P₇₅）］表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，根據(jù)曲線下面積評(píng)估sCD163的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患兒肝組織中CD163表達(dá)水平 免疫組化染色結(jié)果顯示，CD163陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，BA組肝組織中CD163定位于門(mén)靜脈區(qū)，并隨著肝纖維化增加而加重，從門(mén)靜脈區(qū)周?chē)饾u擴(kuò)散至整個(gè)肝小葉。而CC組可見(jiàn)少許CD163陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖1。與CC組相比，BA組CD163表達(dá)明顯增加［AOD：0.098（0.046，0.120）vs. 0.012（0.006，0.016），Z=4.670，P＜0.01］。BA組內(nèi)肝纖維化Ⅲ～Ⅳ級(jí)CD163表述水平高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)［AOD：0.117（0.108，0.131）vs. 0.046（0.045，0.048），Z=4.635，P＜0.01］，隨著肝纖維化程度的加重，肝組織中CD163表達(dá)增加。

2.2 2組患兒血液中CD163表達(dá)水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，BA組血液中CD163表達(dá)水平高于CC組［22.82%（12.17%，25.54%）vs. 3.87%（2.14%，4.84%），Z=4.585，P＜0.01］。BA組內(nèi)肝纖維化Ⅲ～Ⅳ級(jí)血液中CD163表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)［25.15%（23.22%，30.69%）vs. 12.10%（11.46%，13.68%），Z=4.599，P＜0.01］，見(jiàn)圖2。

2.3 2組患兒sCD163表達(dá)水平 ELISA結(jié)果顯示，BA組sCD163表達(dá)水平明顯高于CC組［（0.97±0.12）μg/L vs. （0.78±0.05）μg/L，t=6.962，P＜0.01］。BA組內(nèi)肝纖維化Ⅲ～Ⅳ級(jí)sCD163表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)［（1.04±0.11）μg/L vs. （0.81±0.08）μg/L，t=4.692，P＜0.01］。sCD163表達(dá)與CD163在肝臟組織中的表達(dá)結(jié)果一致。

2.4 sCD163是潛在的評(píng)估BA肝纖維化無(wú)創(chuàng)性指標(biāo) sCD163評(píng)估BA肝纖維化的ROC曲線下面積為0.927，最佳臨界值為8.323 ?g/L，敏感度為86.67%，特異度為100%，見(jiàn)圖3。

2.5 BA組內(nèi)不同肝纖維化分級(jí)患者肝功能相關(guān)生化指標(biāo)的比較 BA肝纖維化Ⅰ～Ⅱ級(jí)與Ⅲ～Ⅳ級(jí)患兒血清ALT、AST、TB、DB比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

BA肝纖維化進(jìn)展迅速，比其他任何肝膽疾病出現(xiàn)肝硬化都快［7］。目前研究認(rèn)為BA及肝纖維化與病毒感染引發(fā)的自身免疫損傷密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有免疫調(diào)節(jié)的能力。CD163是巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物，sCD163反映巨噬細(xì)胞激活。巨噬細(xì)胞在肝臟疾病進(jìn)展和肝纖維化中至關(guān)重要［8］。筆者前期分別研究了磷脂酰肌醇蛋白多糖3、基質(zhì)金屬蛋白酶7、白細(xì)胞衍生趨化因子2在BA肝纖維化中的臨床意義［9-11］。肝活檢被認(rèn)為是評(píng)估BA肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但它是一種具有風(fēng)險(xiǎn)的有創(chuàng)性檢查，不便反復(fù)操作。因此，目前需要一種創(chuàng)傷小、易于操作的檢查技術(shù)來(lái)評(píng)估肝纖維化。

CD163是清道夫受體，富含半胱氨酸家族的成員，主要在M2型巨噬細(xì)胞上表達(dá)，具有抗炎和促進(jìn)纖維化的作用［12］。Zhao等［13］研究認(rèn)為CD163在丙型肝炎患者肝組織中的表達(dá)顯著高于健康人，與肝纖維化的程度呈正相關(guān)。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA檢測(cè)CD163，發(fā)現(xiàn)BA組均高于CC組，且隨著肝纖維化程度加重，表達(dá)增加，提示CD163可能參與了BA肝纖維化進(jìn)程。

巨噬細(xì)胞的激活是炎癥、臟器纖維化發(fā)展的重要組成部分［14］。sCD163可用于評(píng)估肝纖維化程度［15］。Gantzel等［16］研究認(rèn)為sCD163與肝臟炎癥和肝纖維化程度間存在明顯的相關(guān)性，可作為預(yù)測(cè)肝纖維化的指標(biāo)。目前，一些無(wú)創(chuàng)性檢查如磁共振膽胰管成像、超聲彈性成像等用于診斷BA肝纖維化具有一定優(yōu)勢(shì)，但也存在局限性，如會(huì)受到患兒體位影響、存在測(cè)量誤差，同時(shí)還有費(fèi)用較高、檢查時(shí)間長(zhǎng)、需要患兒鎮(zhèn)靜或全身麻醉等弊端，需結(jié)合其他常規(guī)檢查提高診斷價(jià)值［17］。一些生物標(biāo)志物已被提出，BA患兒谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）升高，但GGT必須考慮年齡因素［18］。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅰ～Ⅱ級(jí)與Ⅲ～Ⅳ級(jí)肝纖維化患兒肝功能指標(biāo)無(wú)明顯差異。此外，MMP-7作為BA生物標(biāo)志物之一，可靠性較高［19］。但其在檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題上尚未完全統(tǒng)一，而且成本較高［20］。因此，需要更普遍適用的評(píng)估和診斷方法。

在本研究中，BA組血清sCD163表達(dá)與CD163在肝臟組織中表達(dá)結(jié)果相一致，sCD163表達(dá)在一定程度上反映了肝組織中CD163變化。ROC曲線分析，當(dāng)臨界值為8.323 ?g/L，sCD163在評(píng)估BA肝纖維化ROC曲線下面積為0.927，敏感度為86.67%，特異度為100%，提示sCD163在評(píng)估BA肝纖維化方面具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。后期會(huì)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證sCD163在BA患兒肝纖維化中的臨床意義。

綜上所述，CD163巨噬細(xì)胞在BA患兒中高表達(dá)，參與了BA肝纖維化的過(guò)程；BA患兒sCD163水平升高，反映了肝巨噬細(xì)胞的活化，且與肝纖維化程度相關(guān)，在評(píng)估BA患兒肝纖維化進(jìn)展方面有一定價(jià)值，為BA患兒肝纖維化的無(wú)創(chuàng)性診斷提供了一個(gè)有意義的指標(biāo)。

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（2022-09-22收稿 2022-11-28修回）

（本文編輯 胡小寧）