燕晟++++++陽學(xué)風(fēng)

[摘要] 肝纖維化是各種致病因子致肝細(xì)胞損傷后的修復(fù)過度。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell， HSC）的激活被認(rèn)為是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路參與HSC的激活。RNA干擾 （RNA interference，RNAi） 能有效沉默目的基因，以HSC活化信號(hào)通路為切入點(diǎn)，設(shè)計(jì)小干擾RNA（small interfering RNA， siRNA）抑制相關(guān)信號(hào)通路的活化，從而達(dá)到抑制HSC，激活是目前研究肝纖維化機(jī)制的主要手段。該研究綜述了RNAi技術(shù)在研究HSC活化信號(hào)途徑中的作用，以求為治療肝纖維化提供一種新思路。

[關(guān)鍵詞] 肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；信號(hào)通路；RNA干擾技術(shù)

[中圖分類號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2015）01（a）-0074-02

The Application of RNA Interference Technique in the Signaling Pathways Involving HSCs Activation

YAN Sheng YANG Xuefeng

Affiliated Nanhua Hospital of University of South China，Hengyang ，Hunan Province，421001，China

[Abstract] Hepatic fibrosis is a over-healing response to multiple injuries. Activating hepatic stellate cells is considered to be the central event in liver fibrosis. Several signaling pathways involve HSCs activation. RNA interference technology is a efficient tool being applied in silencing targeted gene expression. Based on the molecular targets of the signaling pathways involving HSCs activation， individual siRNAs are be chosen to block the pathway. We review the effect of RNAi on the signaling pathways involving HSCs activation to come up with an idea treating hepatic fibrosis

[Key words] Hepatic fibrosis； Hepatic stellate cells； The signaling pathways； RNA interference

肝纖維化是各種致病因子致肝細(xì)胞損傷后的修復(fù)過度，表現(xiàn)為肝結(jié)締組織異常增生，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，降低生活質(zhì)量，出現(xiàn)并發(fā)癥，嚴(yán)重危及生命。HSC是形成肝纖維化的主要細(xì)胞，它的激活被認(rèn)為是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)。多種信號(hào)傳導(dǎo)通路與該激活過程的調(diào)控有關(guān)。RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）能特異性沉默目的基因，針對(duì)HSC活化信號(hào)途徑中的分子設(shè)計(jì)RNAi，能逆轉(zhuǎn)肝纖維化。該研究著重闡述了肝星狀細(xì)胞活化主要信號(hào)通路以及RNAi在這些信號(hào)通路的應(yīng)用。

1 RNA干擾技術(shù)

RNAi是通過沉默目標(biāo)基因以研究基因和蛋白質(zhì)功能的研究手段，被廣泛的用于臨床疾病研究。作用的起始階段正義鏈和反義鏈混合的雙鏈（double-stranded RNA， dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)與核酸內(nèi)切酶Ⅲ結(jié)合后，其被切割成siRNA。效應(yīng)階段siRNA則降解成正義鏈和反義鏈，后者與內(nèi)切核酸酶以及其他蛋白一起形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silengcing complex， RISC）。RISC的核酸部分與外源性基因所表達(dá)mRNA靶向結(jié)合后，在結(jié)合部位切割mRNA，隨即RISC的蛋白部分引起mRNA降解。進(jìn)入擴(kuò)增階段，siRNA與mRNA結(jié)合，并將結(jié)合體作為引物，從而再次形成dsRNA。靶向mRNA全部降解致使目的基因沉默。

2 RNAi對(duì)致肝星狀細(xì)胞活化主要信號(hào)通路的應(yīng)用

靜止?fàn)顟B(tài)的HSC，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（smooth muscle actin-α， α-SMA）較少。當(dāng)肝臟受損時(shí)，HSC增殖活躍，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）分泌增多，胞質(zhì)內(nèi)α-SMA產(chǎn)生增多[1]，此即HSC活化。實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor， CTGF）信號(hào)通路等均參與HSC的活化，進(jìn)而參與肝纖維化的形成。而應(yīng)用RNAi沉默信號(hào)通路中的各種信號(hào)分子，抑制HSC的活化，從而為治療肝纖維化提供新的途徑。

2.1 TGF-β/Smads信號(hào)通路

TGF-β是超家族TGF中的一員，其除了在ECM形成方面起著重要作用外還影響細(xì)胞的增殖、分化。不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)參與肝臟損傷修復(fù)的細(xì)胞如肝細(xì)胞，枯否細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量 TGFβ1，TGFβ1通過其受體（主要為TβRⅠ及 TβRⅡ）作用于HSC，分泌大量 ECM，其中TGFβ1被認(rèn)為是致肝纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子。TGFβ1先與 TβRⅡ結(jié)合，再與活化的TβRⅡ激酶結(jié)合使 TβRⅠ磷酸化，然后激活Smad2、3，Smad2、3與Smad4結(jié)合形成異源寡聚體，最后轉(zhuǎn)入胞核中發(fā)揮調(diào)控作用[2]。

有人用Smad3 siRNA 轉(zhuǎn)染活化的HSC后膠原Ⅰ，Ⅲ，ⅠⅤ mRNA表達(dá)受到了明顯抑制，說明阻斷TGF-β/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)途徑能對(duì)抗纖維化進(jìn)展。鄭素軍[3]等將Smad3-shRNA慢病毒感染HSC-T6 3后觀察細(xì)胞增殖，Smad3-shRNA組較對(duì)照組細(xì)胞增殖明顯下降（P=0.00），表明Smad3-shRNA可阻斷TGFβ1對(duì)HSC-T6細(xì)胞的促增殖作用。而其他學(xué)者利用siRNA靶向沉默TGF-β1后，HSC激活相關(guān)指標(biāo)均受到不同程度抑制，延緩肝纖維化進(jìn)程，并一定程度上逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

2.2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Wnt/β-catenin信號(hào)通路即經(jīng)典β-catenin依賴信號(hào)通路，該通路被證實(shí)與某些癌癥、纖維化疾病、炎癥性腸病有關(guān)。β-catenin是該信號(hào)通路的核心部分，因?yàn)槠溆坞x態(tài)水平受腫瘤抑制因子結(jié)腸息肉基因產(chǎn)物、支架蛋白Axin、糖原合成酶激酶-3β構(gòu)成的β-catenin降解復(fù)合體控制，在未活化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)幾乎檢測(cè)不到[4]，當(dāng)wnt蛋白與Frizzled 受體結(jié)合后經(jīng)一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)積累，當(dāng)積累到一定水平可發(fā)生核轉(zhuǎn)移，故β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，可作為該信號(hào)通路激活的標(biāo)志。

有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在活化HSC內(nèi)的表達(dá)水平較靜息狀態(tài)提高了5～7倍[5]，目前越來越多的研究結(jié)果證實(shí)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路通過激活HSC參與了肝纖維化的形成。葛文松等[6-7]將siRNA β-Catenin轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)HSCs增殖明顯被抑制，最大抑制率達(dá)到44.8±2.8%（P<0.01）；HSC細(xì)胞凋亡增加達(dá)28.6%（P<0.05），同時(shí)下調(diào)了Ⅰ、Ⅲ型膠原 mRNAs的表達(dá)。有研究證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過下調(diào)PPARγ的表達(dá)而促進(jìn)HSCs向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[8]。Tsai等[9]利用siRNA β-Catenin轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PPARγ表達(dá)上調(diào)，從而影響HSC的活化。

2.3 CTGF/整合素/FAK

CTGF（又稱CCN2）為一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等作用，還影響著細(xì)胞遷移、黏附等功能，并影響ECM的生成。CTGF在正常肝臟組織的CTGF表達(dá)很低，然而在肝纖維化患者體內(nèi)其表達(dá)顯著提高。整合素是跨膜蛋白家族成員之一，由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，亞基上的胞外區(qū)與ECM相連，同時(shí)還是CTGF的細(xì)胞表面受體。Huang等[10]證實(shí)CTGF 能與HSC表面整合素α5β1受體結(jié)合，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附的功能。粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是體內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶之一，與相應(yīng)配體結(jié)合后經(jīng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、周期調(diào)控及凋亡等過程。FAK的N端與整合素亞基上的胞質(zhì)區(qū)結(jié)合后能傳遞細(xì)胞外來的信號(hào)。已有研究證實(shí)HSC活化伴隨著CTGF/整合素α5β1/FAK信號(hào)通路的活化并以此通路促進(jìn)肝纖維化。郝春秋等[11]發(fā)現(xiàn)沉默CTGF后HCT-T6細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)分別下調(diào)了74.21%和70.79%，同時(shí)ECM的產(chǎn)生受到抑制[12]。An等[13]利用RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)AK基因能抑制HSC的增殖，并通過caspase-3和Bcl-2/Bax通路誘導(dǎo)HCS的凋亡。

2.4 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路包括Notch受體、轉(zhuǎn)錄因子、DSL配體和靶基因這4個(gè)核心組件，其中Notch受體包括Notch1、2、3、4，轉(zhuǎn)錄因子分別有CBF-1、Suppressor of hairless和Lag1，而Jagged1，Jagged2，Delta-like1，Delta-like3，Delta-like4構(gòu)成DSL配體，HES、Hey為靶基因。該信號(hào)通路通過Notch受體與配體結(jié)合，釋放出NICD（Notch intracellular domain，NICD），其核定位序列能被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)與CSL家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使靶基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡。陳毅雄[14]驗(yàn)證了Notch受體1-3、DSL配體Jagged1以及靶基因HES1在HSC-T6中均有表達(dá)，在用Notch3-siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)下降，而用Jagged1-siRNA轉(zhuǎn)染后也有類似的作用，表明沉默Jagged1能有效抑制HSC的活化和ECM的產(chǎn)生。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)Notch3在正常肝組織中檢測(cè)不到，而在慢性活動(dòng)性肝炎患者肝纖維化組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，且α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)增加；而沉默Notch3組中未發(fā)現(xiàn)上述表現(xiàn)[15]。

3 應(yīng)用前景

近年來國內(nèi)外許多研究探討了肝纖維化的可能機(jī)制，其中HSC的激活在肝纖維化中的作用得到廣泛證實(shí)。而利用RNAi抑制HSC的活化能有效減緩肝纖維化進(jìn)程。研究還發(fā)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間有交互作用，共沉默不同通路的信號(hào)分子有擴(kuò)大抗纖維化的作用，但目前此類研究尚少且多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。肝纖維化發(fā)展成肝硬化后將不可逆轉(zhuǎn)，若在肝硬化之前逆轉(zhuǎn)肝纖維化將極大程度地減輕患者痛苦。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉永剛，陳厚昌，蔣毅萍. 細(xì)胞因子與肝纖維化[J]. 醫(yī)學(xué)綜述， 2001，7（10）：620-622.

[2] Hill CS. Identification of a Smad phosphatase[J]. ACS Chem Biol，2006，1（6）：346-8.

[3] 鄭素軍，邢欣悅，武聚山，等. Smad3 shRNA抑制TGFβ1對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化的抗肝纖維化作用[J]. 臨床肝膽病雜志，2012，28（4）：289-295.

[4] Kennell J， Cadigan KM. APC and beta-catenin degradation[J]. Adv Exp Med Biol， 2009，656：1-12.

[5] Douglas IS， Diaz dVF， Winn RA， et al. Beta-catenin in the fibroproliferative response to acute lung injury[J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2006，34（3）：274-85.

[6] Ge WS， Wang YJ， Wu JX， et al. β-catenin is overexpressed in hepatic fibrosis and blockage of Wnt/beta-catenin signaling inhibits hepatic stellate cell activation[J]. Mol Med Rep， 2014，9（6）：2145-51.

[7] 葛文松，吳建新，陳穎偉，等. siRNA沉默β-Catenin對(duì)肝星狀細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響[J]. 肝臟，2011，16（4）：308-311.

[8] Yang MD， Chiang YM， Higashiyama R， et al. Rosmarinic acid and baicalin epigenetically derepress peroxisomal proliferator-activated receptor gamma in hepatic stellate cells for their antifibrotic effect[J]. Hepatology， 2012，55（4）：1271-81.

[9] Tsai TH， Shih SC， Ho TC， et al. Pigment epithelium-derived factor 34-mer peptide prevents liver fibrosis and hepatic stellate cell activation through down-regulation of the PDGF receptor[J]. PLoS One， 2014，9（4）：e95443.

[10] Huang G， Brigstock DR. Integrin expression and function in the response of primary culture hepatic stellate cells to connective tissue growth factor （CCN2）[J]. J Cell Mol Med， 2011，15（5）：1087-95.

[11] 郝春秋，彭梅娟，謝玉梅，等. 腺病毒載體RNA干擾抑制結(jié)締組織生長因子表達(dá)及其抗纖維化作用[J]. 肝臟，2012，17（12）：854-857.

[12] Hao C， Xie Y， Peng M， et al. Inhibition of connective tissue growth factor suppresses hepatic stellate cell activation in vitro and prevents liver fibrosis in vivo[J]. Clin Exp Med， 2014，14（2）：141-50.

[13] An J， Zheng L， Xie S， et al. Down-regulation of focal adhesion kinase by short hairpin RNA increased apoptosis of rat hepatic stellate cells[J]. APMIS， 2011，119（6）：319-29.

[14] 陳毅雄. 干預(yù)Notch信號(hào)通路治療大鼠肝纖維化[D]. 武漢：華中科技大學(xué)， 2012.

[15] Chen YX， Weng ZH， Zhang SL. Notch3 regulates the activation of hepatic stellate cells[J]. World J Gastroenterol， 2012，18（12）：1397-403.

（收稿日期：2014-10-16）