鄧隨楓，廖雨夢，章昊，祖艷群

（云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明 650201）

鎘脅迫可使植物發(fā)生一系列的生理生化變化。長期的鎘脅迫會使細胞中的活性氧累積，進而誘導氧化，降低植株的根系活力，抑制植株生長，促使葉綠素降解，導致植株枯萎[10-11]。而抗氧化體系則能通過調(diào)整活性氧在細胞中的含量來緩解植物受到的傷害[12-13]。本文針對鎘脅迫條件下施磷對紫花苜蓿生物量、植株鎘含量、植株亞細胞鎘分布、抗氧化酶活性等進行分析，探究不同施磷水平對鎘脅迫下紫花苜蓿的生長發(fā)育和對鎘累積的特點，以期闡明磷素對紫花苜蓿緩解鎘毒的影響，為鎘污染土壤的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗地位于云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場（25°14′30″ N，102°56′27″ E），海拔約1 891 m，平均溫度14.9 ℃，年降雨量1 000.5 mm，降水以5—9 月為主，年日照2 327.5 h，年蒸發(fā)量1 856.4 mm，相對濕度76%。試驗土壤為山原紅壤，基本物理化學性質(zhì)為：pH 值6.81，全氮含量0.75 g·kg-1、全磷含量0.67 g·kg-1、全鉀含量16.01 g·kg-1，速效磷含量82.81 mg·kg-1、速效鉀含量188.96 mg·kg-1，堿解氮含量56.75 mg·kg-1、有機質(zhì)含量30.12 g·kg-1、總鎘含量0.38 mg·kg-1。

試驗作物：紫花苜蓿（Medicago sativaL.），品種名為中苜一號。

1.2 試驗設計

設置6 個磷（P2O5）處理水平，分別為0、40、80、160、240、300 mg·kg-1，采用鈣鎂磷肥（P2O5≥12%）配制；3個鎘處理含量，分別為0、2、20 mg·kg-1，以CdCl2·2H2O 配制。共18 個處理，每個處理5 個重復，共90盆，隨機排列。

供試土壤風干后過2 mm 篩。鈣鎂磷肥和CdCl2·2H2O 根據(jù)設計水平混合加入土壤，與土壤充分混拌均勻。尿素（100 mg·kg-1）和K2SO4（100 mg·kg-1）作為基肥一次性施入土壤，混拌均勻。將混勻后的土壤裝入塑料花盆中，每盆5 kg，用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量為最大田間持水量（60%左右），平衡14 d。選擇籽粒大小均勻、飽滿的紫花苜蓿種子，用10%H2O2溶液消毒30 min，然后用少量的蒸餾水反復沖刷，每盆播種10粒，當紫花苜蓿的幼苗長到10 cm時，每盆留苗5株，在生長期定時澆水。生長45 d（初花期）后采樣。

1.3 指標測定方法

生物量測定：參照王洪斌等[14]的方法，將作物分成地上、地下兩個部分，分別先用自來水清洗，再用蒸餾水清洗，洗凈后的樣品裝進牛皮紙袋，置于105 ℃烤箱中，0.5 h 后，75 ℃干燥72 h，待質(zhì)量恒定后稱取質(zhì)量，以測定生物量。

植株鎘含量測定：稱取0.5 g過0.25 mm 篩的干燥植物樣品，用HNO3-HClO4（4∶1）的混合酸濕法消解（石墨消解器Hanon220s）處理，采用25 mL 容量瓶定容，用原子吸收分光光度計（Varian SpectrumAA220）測定鎘的含量[15]。

三是政府應引導國產(chǎn)鉀肥與境外開發(fā)資源由競爭走向競合，構建協(xié)調(diào)統(tǒng)一的境外預警機制。國內(nèi)外統(tǒng)籌規(guī)劃已經(jīng)成為重新布局中國鉀鹽戰(zhàn)略的切入點，在國內(nèi)產(chǎn)能提升、境外資源即將釋放之時，國內(nèi)外的統(tǒng)籌規(guī)劃、協(xié)調(diào)發(fā)展并制訂合理的“游戲規(guī)則”顯得尤為重要。隨著境外開發(fā)企業(yè)取得的共識，境外鉀鹽企業(yè)與國內(nèi)企業(yè)應當“從競爭走向競合”，實現(xiàn)資源開發(fā)與市場渠道的合作共享。此外，“走出去”的企業(yè)應建立彼此的互信關系，協(xié)調(diào)統(tǒng)一地構建境外輿情監(jiān)測機制，提升危機公關意識和應對能力，化解政治、環(huán)保、人文、地域矛盾。

鎘的亞細胞分布：取嫩葉1 g，將其放入10 mL 預冷勻漿料中，勻漿料成分為250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol·L-1二硫赤蘚糖醇（C4H10O2S2），嫩葉研磨成漿后，采用差速離心法，依次在600 r·min-1下離心10 min 得到細胞壁沉淀，1 000 r·min-1下離心15 min 得到葉綠體沉淀，10 000 r·min-1下離心20 min 得到線粒體沉淀，上層的溶液是細胞質(zhì)組分（含液泡、核糖等），每次離心重復進行3次[16]。

粗酶液的制備：稱取植物組織0.5 g，先加入2.5 mL PBS（磷酸緩沖液）研磨成漿后，再加入2.5 mL PBS混勻，4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。粗酶液用于酶活性測定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光抑制法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定[17]。丙二醛含量（MDA）采用硫酸巴比妥酸法測定[18]。

式中：CMDA為MDA 含量，μmol·g-1，以鮮質(zhì)量計；A450、A532、A600分別為450、532、600 nm 波長下測得的吸光度值；V1為反應液體積，mL；VT為提取液總體積，mL；V2為測定液體積，mL；W為植物組織鮮質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

采用Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進行初步的分析。利用SPSS 20 軟件，采用新復極差法（New complex range method）對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。

植株地上部鎘累積量(μg·盆-1)為植株地上部鎘含量與植株地上部生物量的乘積，植株地下部鎘累積量(μg·盆-1)為植株地下部鎘含量與植株地下部生物量的乘積。轉(zhuǎn)運系數(shù)為植株地上部鎘含量與植株地下部鎘含量的比值。

2 結果與分析

2.1 磷素對鎘脅迫下紫花苜蓿生物量的影響

在相同鎘處理含量下，隨施磷水平的增加，生物量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。在240 mg·kg-1磷水平下，生物量開始減少（圖1）。在相同施磷水平下，隨鎘處理含量的增加，生物量先增加后減少。其中，2 mg·kg-1鎘+160 mg·kg-1磷處理下，紫花苜蓿生物量達到最大值13.54 g·盆-1。雙因素方差分析表明，磷鎘交互作用對紫花苜蓿生物量存在極顯著的影響。

圖1 磷素對不同含量鎘脅迫下紫花苜蓿生物量的影響Figure 1 Effects of phosphorus on alfalfa biomass under different contents of cadmium

2.2 磷素對鎘脅迫下紫花苜蓿葉片亞細胞鎘含量的影響

在相同鎘處理含量下，隨施磷水平的增加，各亞細胞鎘含量呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢；在相同的施磷水平下，隨鎘處理含量的增加，各亞細胞鎘含量顯著增加（表1）。紫花苜蓿葉片亞細胞鎘含量存在差異，表現(xiàn)為細胞壁＞細胞質(zhì)＞線粒體＞葉綠體，其中細胞壁鎘含量最高，占總量的50%～64%，其次為細胞質(zhì)，占總量的18%～29%，最少的是葉綠體，其鎘含量僅占總量的1%～8%。

表1 磷素對不同含量鎘脅迫下紫花苜蓿葉片亞細胞鎘含量及分配率的影響Table 1 Effects of phosphorus on subcellular cadmium content and distribution percentage in alfalfa leaves under different contents of cadmium

2.3 磷素對鎘脅迫下紫花苜蓿鎘含量和累積量的影響

在相同鎘處理含量下，隨施磷水平的增加，地上部和地下部鎘含量顯著降低，鎘累積量先增加后減少；在相同施磷水平下，隨鎘處理含量的增加，地上部和地下部鎘含量及鎘累積量均顯著增加，且地下部鎘含量、鎘累積量均大于地上部（表2）。在20 mg·kg-1鎘處理下未施磷時，轉(zhuǎn)運系數(shù)和地上部鎘累積量達到最大值，分別為0.35和65.06μg·pot-1。

表2 磷素對不同含量鎘脅迫下紫花苜蓿鎘含量和累積量的影響Table 2 Effects of phosphorus on Cd content and accumulation of alfalfa under different contents of cadmium

2.4 磷素對鎘脅迫下紫花苜蓿MDA 含量和抗氧化酶活性的影響

在相同鎘處理含量下，隨施磷水平的增加，MDA含量表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢（圖2）。在未受到鎘脅迫時，與未施磷處理相比較，40、80、160 mg·kg-1磷處理下MDA含量分別下降了40.7%、48.7%、75.9%，240、300 mg·kg-1磷處理下MDA 含量分別上升了59.3%、102.5%；在2 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160 mg·kg-1磷處理下MDA 含量分別下降了35.7%、54.8%、72.7%，240、300 mg·kg-1磷處理下MDA含量分別上升了27.3%、48.0%；在20 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160 mg·kg-1磷處理下MDA 含量分別下降了15.5%、42.3%、60.2%，240、300 mg·kg-1磷處理下MDA 含量分別上升了4.8%、18.8%。在相同施磷水平下，隨鎘處理含量的增加，MDA 含量顯著增加。雙因素方差分析表明，磷鎘交互作用對紫花苜蓿MDA含量存在極顯著的影響。

圖2 磷素對不同含量鎘脅迫下紫花苜蓿丙二醛含量的影響Figure 2 Effects of phosphorus on MDA content of alfalfa under different contents of cadmium

在相同鎘含量下，隨施磷水平的增加，POD 酶活性表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢（圖3）。在未受到鎘脅迫時，與未施磷處理相比較，40、80、160、240、300 mg·kg-1磷處理下POD 酶活性分別增加了22.2%、58.3%、121.7%、55.5%、22.2%；在2 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160、240 mg·kg-1磷處理下POD 酶活性分別增加了23.9%、64.5%、134.2%、37.4%，300 mg·kg-1磷處理下POD 酶活性降低了14.5%；在20 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160、240 mg·kg-1磷處理下POD 酶活性分別增加了23.4%、69.0%、124.2%、49.5%，300 mg·kg-1磷處理下POD 酶活性降低了32.2%。在0～240 mg·kg-1磷水平下，隨鎘含量的增加，POD 酶活性先增加后降低；300 mg·kg-1磷水平下，隨鎘含量的增加，POD酶活性顯著降低。2 mg·kg-1鎘處理下，施160 mg·kg-1磷時，POD 酶活性達到最大值17.33μmol·g-1。雙因素方差分析表明，磷鎘交互作用對紫花苜蓿POD酶活性存在極顯著的影響。

圖3 磷素對不同含量鎘脅迫下紫花苜蓿過氧化物酶活性的影響Figure 3 Effects of phosphorus on POD activity of alfalfa under different contents of cadmium

在相同鎘含量下，隨施磷水平的增加，SOD 酶活性表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢（圖4）。在未受到鎘脅迫時，與未施磷處理相比較，40、80、160、240、300 mg·kg-1磷處理下SOD 酶活性分別增加了22.7%、52.2%、73.6%、47.2%、6.9%；在2 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160、240、300 mg·kg-1磷處理下SOD 酶活性分別增加了64.6%、70.0%、106.6%、57.4%、9.2%；在20 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160、240 mg·kg-1磷處理下SOD酶活性分別增加了38.3%、44.5%、62.5%、35.7%，300 mg·kg-1磷處理下SOD酶活性降低了3.3%。在相同施磷水平下，隨鎘含量的增加，SOD 酶活性先增加后降低。2 mg·kg-1鎘處理下，施160 mg·kg-1磷時，SOD 酶活性達到最大值231.84 μmol·g-1。雙因素方差分析表明，磷鎘交互作用對紫花苜蓿SOD 酶活性存在極顯著的影響。

圖4 磷素對不同含量鎘脅迫下紫花苜蓿超氧化物歧化酶活性的影響Figure 4 Effects of phosphorus on SOD activity of alfalfa under different contents of cadmium

在相同鎘含量下，隨施磷水平的增加，CAT 酶活性呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢（圖5）。在未受到鎘脅迫時，與未施磷處理相比較，40、80、160、240 mg·kg-1磷處理下CAT 酶活性分別增加了17.4%、30.0%、64.7%、22.2%，300 mg·kg-1磷處理下CAT 酶活性降低了7.7%；在2 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160、240、300 mg·kg-1磷處理下CAT 酶活性分別增加了13.1%、18.4%、44.6%、35.4%、10.5%；在20 mg·kg-1鎘處理下，與未施磷處理相比較，40、80、160 mg·kg-1磷處理下CAT 酶活性分別增加了6.2%、11.6%、24.5%，240、300 mg·kg-1磷處理下CAT 酶活性降低了4.9%、10.2%。在相同施磷水平下，隨鎘含量的增加，CAT酶活性顯著增加。20 mg·kg-1鎘處理下，施160 mg·kg-1磷時，CAT酶活性達到最大值89.07μmol·g-1。雙因素方差分析表明，磷鎘交互作用對紫花苜蓿CAT酶活性存在極顯著的影響。

圖5 磷素對不同含量鎘脅迫下紫花苜蓿過氧化氫酶活性的影響Figure 5 Effects of phosphorus on CAT activity of alfalfa under different contents of cadmium

3 討論

本研究中，在相同施磷水平下，隨鎘含量的增加，紫花苜蓿生物量先增加后減少。這與張楊楊等[19]的研究結果一致，即低含量鎘脅迫對百脈根、變異小冠草等植物的生長有一定的促進作用，但隨著鎘含量的增加，植物生物量降低。鎘對生物量的“低促高抑”作用比較普遍[20]。賈月慧等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度（50～100 mg·L-1）鎘的脅迫對生菜（Lactuca sativa）生物量、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量仍有顯著的促進作用，這可能是因為不同植物對鎘的吸收及耐受性不同，但總的趨勢是高鎘對植株的生長有一定的抑制作用[22-23]。在相同鎘含量下，隨施磷水平的增加，生物量也表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。這是由于在低磷處理下，植株吸收大量的磷素，從而促進植物的生長[24]。生物量是衡量紫花苜蓿生產(chǎn)性能的重要指標，施磷過高或過低均會影響其干物質(zhì)累積量和產(chǎn)量形成，即紫花苜蓿生物量的形成對磷素的吸收存在閾值，在一定范圍內(nèi)施加磷素對紫花苜蓿具有增產(chǎn)作用[25-26]。綜上，磷素對鎘脅迫下紫花苜蓿生長發(fā)育的影響是有一定限度的，施磷量過高反而會對紫花苜蓿產(chǎn)生毒害作用，只有在一定范圍內(nèi)施加磷素才對紫花苜蓿有增產(chǎn)作用。

植物可以調(diào)節(jié)亞細胞中鎘的分布，從而對鎘脅迫產(chǎn)生耐性[16]。在本試驗中，亞細胞中鎘的含量為細胞壁＞細胞質(zhì)＞線粒體＞葉綠體，這與Wang等[27]的研究結果一致。鎘主要分布在細胞壁上，以阻止鎘進入細胞質(zhì)，減少鎘對細胞的毒害[28]。在相同施磷水平下，隨鎘處理含量的增加，葉綠體及細胞質(zhì)中鎘含量增加，而細胞壁及線粒體中鎘含量則減少，表明細胞壁對鎘的固定能力有限，過多的鎘會進入細胞質(zhì)。在相同施磷水平下，隨鎘處理含量的增加，各亞細胞器中鎘含量均顯著增加。在植物細胞中，葉綠體和線粒體是具有重要作用的細胞器，鎘含量的增加可能使類囊體發(fā)生損傷，導致雙膜結構破裂[29]，大量的鎘進入到葉綠體后，將會嚴重破壞葉綠體的結構與功能[30]。研究表明，細胞壁中的鎘儲存量達到一定程度后，鎘就會進入細胞質(zhì)，細胞質(zhì)中一些小分子物質(zhì)可以與鎘結合并沉淀下來，形成鎘耐性[31]。

在相同鎘處理含量下，隨施磷水平的增加，地上部、地下部鎘含量均顯著降低。這與鄒茸等[32]的研究類似，即施用磷肥可使莧菜地上部鎘含量下降15.7%。王朋超等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，在施用鈣鎂磷肥和普鈣后，油菜地上部分的鎘含量分別下降74.4%～79.6%和54.3%～86.7%。這是因為施加鈣鎂磷肥能有效減少鎘在油菜地上部分的遷移，從而使鎘在油菜植株根部累積[34]。其作用機制包括：（1）施磷增加土壤pH值，使根系的磷素與鎘形成不溶性磷酸鹽沉淀，減少根系對鎘的吸收和植物體內(nèi)鎘的長距離運輸[35]；（2）磷素能以CdHPO4和Cd3（PO4）2的形式沉淀鎘，降低植株體內(nèi)鎘的遷移能力，從而降低鎘對植物的毒害[36]；（3）施磷提高了鎘脅迫下植物體內(nèi)抗氧化物酶的活性，減少植株對鎘的吸收從而緩解氧化應激，防止膜損傷[37-38]。在相同鎘含量下，隨施磷水平的增加，地上部、地下部鎘累積量先增加后減少，其主要原因是在低磷水平下紫花苜蓿的生物量顯著增加，導致鎘累積量增加。

在相同施磷水平下，隨鎘含量的增加，紫花苜蓿葉片中MDA 含量、CAT活性顯著增加，POD 和SOD 活性總體上表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。在較低含量的鎘脅迫下，紫花苜蓿POD、SOD 和CAT 能被活化，從而有效地消除活性氧。在20 mg·kg-1鎘處理下，POD 和SOD 活性顯著下降，CAT 活性則顯著被激活，協(xié)同清除植株體內(nèi)的活性氧，降低高含量鎘對膜脂過氧化的影響，說明高含量鎘在一定程度上會抑制POD、SOD 的活性。在高含量鎘脅迫條件下，植株葉片MDA 的含量高，葉片中SOD 和POD 活力下降，尤其是POD 酶的活性，這說明MDA 的高累積對SOD、POD 活性的影響有一定抑制作用[39]，表明不同的鎘脅迫含量下，抗氧化酶活化的速率和程度存在差異，這可能與植物的器官和酶的類型有關[11]。

4 結論

（1）在相同磷水平下，鎘處理對紫花苜蓿生物量存在“低促高抑”作用。

（2）在相同鎘處理含量下，隨施磷水平的增加，紫花苜蓿生物量增加，抗氧化酶活性增強，鎘主要存在于紫花苜蓿的細胞壁中，植株地上部和地下部中的鎘含量顯著降低，最多降低了41.7%和39.2%。

（3）在一定范圍內(nèi)施磷能提高紫花苜蓿對鎘的耐受能力，緩解鎘脅迫對紫花苜蓿的毒害作用，降低紫花苜蓿中鎘含量。