孫曉慧，呂洪巖，孫 超，于曉明，宋 黎，徐 濤，董愛新，陳甘牛*

（1.煙臺市森林資源監(jiān)測保護服務中心，山東 煙臺 264001；2.東阿縣林業(yè)發(fā)展中心，山東 聊城252299;3.山東省林業(yè)科學研究院，山東濟南 250014）

宜昌莢蒾（Viburnum erosum Thunb.）是忍冬科莢蒾屬植物，落葉灌木，在我國華東、華中、西南及陜西、廣東、廣西均有分布。多生于海拔600—700 m 的山坡林下或灌叢中，枝葉稠密，樹冠球形，葉色果色獨特。不僅具有較高的觀賞價值，還具有很高的藥用價值，在園藝觀賞及藥用等方面都具有很高的開發(fā)利用價值[1]。

目前，莢蒾屬的繁育方式主要有播種、扦插等[2]。宜昌莢蒾種子小，打破種子休眠所需外部條件苛刻。扦插極不易生根成活，且野生種質資源有限。宜昌莢蒾的繁育極困難，現(xiàn)有的繁育方式難以滿足市場的需要，極大阻礙了宜昌莢蒾野生種質資源的保護和開發(fā)利用[3-4]。植物組織培養(yǎng)技術具有繁殖系數(shù)高、不受季節(jié)限制、保持無性系優(yōu)良特性等優(yōu)點，是在短期內解決宜昌莢蒾規(guī)模化繁育技術難題的有效手段[5]。近年來，莢蒾屬植物的組培研究倍受關注，其中雞樹條莢蒾、歐洲莢蒾、地中海莢蒾、香莢蒾等均已進行組培研究獲得了再生植株[6-10]，但宜昌莢蒾組織培養(yǎng)方面的研究報道比較少。宜昌莢蒾組培快繁主要存在脫分化難以發(fā)生、增殖擴繁難以突破、無根苗難以生根的難題。本研究以宜昌莢蒾葉片為外植體，從培養(yǎng)基種類、植物生長調節(jié)劑配方等方面，對宜昌莢蒾愈傷組織的誘導、再分化、增殖、生根進行探討，建立了宜昌莢蒾植株再生體系，為種質資源保護和工廠化育苗提供技術支撐[11]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗時間為2022 年4 月26 日，試驗材料采自山東省煙臺市萊山區(qū)曲村試驗基地多年生宜昌莢蒾植株，剪取當年生顏色淡綠、無病蟲害嫩葉為外植體，帶回實驗室備用。

1.2 方法

1.2.1 無菌體系的建立

選取宜昌莢蒾幼葉，用水沖洗后，再用洗衣粉浸泡15 min，浸泡期間用軟毛刷輕柔刷洗，再用流水沖洗4 h，無菌水沖洗1～2 次，移入超凈工作臺進行外植體消毒處理。采用75%乙醇和0.1%升汞(HgCl2)溶液組合進行消毒處理。用75%的酒精浸泡30 s 后，無菌水沖洗2～3 次，用0.1%的升汞處理5～6 min，用無菌水沖洗4～5次。在培養(yǎng)皿中將葉片剪為0.5 cm×0.5 cm 大小的方塊作為外植體，葉背面朝下，接種在誘導培養(yǎng)基上。

1.2.2 宜昌莢蒾愈傷組織的誘導

以MS、1/2MS、N6 為基本培養(yǎng)基，添加6-BA 和NAA 兩種植物生長調節(jié)劑，6-BA 的質量濃度為0.05、0.07、0.09 mg·L-1，NAA 質量濃度分別為0.5、0.75、1.0 mg·L-1。按照正交設計L9(34)，采用3 因素3 水平，共9個處理。每個處理接種15 瓶，每瓶3 塊葉片，重復3 次。培養(yǎng)基中均添加30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，pH 值為5.8。培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，濕度75%，光照強度為1800lx，光處理時長為8 h/d，暗處理時長為16 h/d。恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 天，統(tǒng)計愈傷組織誘導率，并記錄愈傷組織的生長狀態(tài)。

1.2.3 宜昌莢蒾愈傷組織的再分化

切取質地較好、顏色淡黃的胚性愈傷組織，以1.2.2 中得到的最適宜培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加6-BA、TDZ、IBA、IAA4 種植物生長調節(jié)劑，6-BA 的質量濃度為0.5、0.75、1.0 mg·L-1，TDZ 質量濃度分別為0.1、0.3、0.7 mg·L-1，IBA 質量濃度分別為0.1、0.25、0.5 mg·L-1，IAA 質量濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg·L-1。按照正交設計L9(34)，采用4 因素3 水平，共9 個處理。每個處理接種20 瓶，每瓶接種4 塊愈傷組織。每個試驗處理重復3 次。培養(yǎng)基中均添加20 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，pH 值為5.8。培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，濕度75%，光照強度為1800 lx，光暗處理時長各為12 h/d。置于恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密切觀察并記錄愈傷組織的分化狀態(tài)，15 天后統(tǒng)計再分化率。

1.2.4 不定芽增殖擴繁

從愈傷組織上剪取不定芽進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境與1.2.3 相同。觀察并記錄不定芽增殖擴繁情況，10 天后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.5 生根培養(yǎng)

當不定芽高度生長至3～4 cm、葉片4～5 片時，轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。以添加6-BA、NAA、IBA 植物生長調節(jié)劑，6-BA 的質量濃度為0、0.05、0.1 mg·L-1，NAA 質量濃度分別為0、0.3、0.5 mg·L-1，IBA質量濃度分別為0、0.3、0.5 mg·L-1。按照正交設計L9(34)，采用3 因素3 水平，共9 個處理。每個處理接種10瓶，每組試驗重復3 次。培養(yǎng)基中均添加15 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂、1 g·L-1活性炭，pH 值為5.8。培養(yǎng)條件為溫度25±2 ℃，濕度75%，光照強度為1800 lx，光暗處理時長各為12 h/d。恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 天后統(tǒng)計生根數(shù)及生根率，觀察生根情況并做好記錄。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗數(shù)據(jù)用WPS Office 2019 專業(yè)版統(tǒng)計匯總后，利用SPSS23.0 統(tǒng)計分析軟件進行多重比較分析。

愈傷組織誘導率(%)=（誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%

再分化率(%)=（產(chǎn)生芽點分化出芽苗的愈傷組織數(shù)量/接種的愈傷組織總數(shù)）×100%

生根率(%)=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基和不同植物生長調節(jié)劑配方對宜昌莢蒾愈傷組織誘導的影響

多重比較分析可知，基本培養(yǎng)基的種類、植物生長調節(jié)劑的濃度對愈傷組織誘導的影響顯著（P＜0.05）。使用N6 培養(yǎng)基時，誘導的愈傷組織質量差、誘導率較低，不是最佳的基本培養(yǎng)基，使用MS 和1/2MS 的愈傷組織誘導率較理想。添加不同濃度植物生長調節(jié)劑對愈傷組織的形成作用明顯，當6-BA 濃度升高時，愈傷組織誘導率下降，說明低濃度的6-BA 適合愈傷組織的誘導。當6-BA 添加濃度相同時，NAA 濃度高時，誘導率高，說明適當提高NAA 的濃度，有利于愈傷組織誘導。當6-BA 濃度為0.05mg·L-1、NAA 濃度為1.0mg·L-1、誘導率最高，為100%。該處理3 天左右葉片邊緣反向卷曲、膨大變厚，6 天左右形成黃綠色愈傷組織顆粒，顆粒較為密實，緊實度較高，15 天最終形成淡綠色愈傷組織（圖1），體積增大明顯，顆粒較為密實，緊實度較高，說明該處理為最佳處理。

圖1 為葉片脫分化后產(chǎn)生的愈傷組織圖

2.2 不同植物生長調節(jié)劑種類、濃度對愈傷組織再分化的影響

無菌條件下，將誘導出的愈傷組織嵌入到再分化培養(yǎng)基進行再分化培養(yǎng)。多重比較分析可知，植物生長調節(jié)劑的種類、濃度對愈傷組織再分化影響顯著（P＜0.05）。6-BA和TDZ 是不定芽分化時常用的2 種植物生長調節(jié)物質，6-BA 與TDZ 組合時濃度適宜有利于分化。當分化培養(yǎng)基中添加6-BA和TDZ 的濃度之和較低時，宜昌莢蒾愈傷組織再分化率低。提高TDZ 的濃度，愈傷組織分化率也隨之升高。培養(yǎng)基中同時添加IAA 的濃度是IBA 濃度的2 倍或接近2 倍時，有利于愈傷組織的再分化。由表2 可知，再分化的最佳培養(yǎng)基為N6+6-BA0.5 mg·L-1+TDZ0.7 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1。該處理14 天生成不定芽（圖2），高度為0.5 cm，葉片3～5 片，完成了再分化過程，分化率100%。從愈傷組織上剪取不定芽進行增殖培養(yǎng)（圖3），10 天產(chǎn)生大量愈傷組織的同時生成多個叢生芽（圖4），高度均超過3cm，葉片5～8 片，完成了組織培養(yǎng)擴繁過程，增殖系數(shù)為6.5。

圖2 為愈傷組織再分化產(chǎn)生不定芽的圖

圖3 為不定芽經(jīng)增殖培養(yǎng)后莖的有效伸長的圖

圖4 為不定芽增殖擴繁的生長形態(tài)圖

圖5 為不定芽生成無根苗的圖

表1 不同基本培養(yǎng)基、不同植物生長調節(jié)劑配方對愈傷組織誘導的影響

表2 不同種類、濃度植物生長調節(jié)劑對愈傷組織再分化的影響

2.3 不同植物生長調節(jié)劑配方對宜昌莢蒾生根的影響

挑選宜昌莢蒾愈傷組織分化出的高度2～3 cm、葉片4～5 片的不定芽轉接到含有不同濃度植物生長調節(jié)劑的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。由表3 的多重比較可知，在添加不同濃度植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中不定芽都能生根，但植物生長調節(jié)劑的種類、濃度對不定芽的生根影響顯著（P＜0.05）。在NAA 濃度小于0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基中，根較細弱，植株矮小，長勢差。當NAA 濃度逐漸升高時，生根率也隨之增高。當NAA 的濃度為0.5 mg·L-1時，不定芽根較粗壯，植株生長速度較快。IBA 的濃度升高時，生根率也隨之提高。當生長素總濃度相同，添加相同濃度的NAA 和IBA時，添加NAA 的生根率高于添加IBA 的生根率，說明NAA 的生根效果優(yōu)于IBA。添加6-BA 濃度為范圍為0～0.05 mg·L-1時，生根率逐漸提高，當濃度提高到0.1 mg·L-1時，生根率下降，說明添加微量6-BA 有助于生根。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.05 mg·L-1+NAA0.50 mg·L-1+活性炭1g·L-1，15 天生根（圖6），生根2～3 條，根長2～3 cm，根粗0.2～0.3 mm，植株高度增長15%，完成了生根過程，生根率為100%，形成完整植株。

圖6 為生根的完整宜昌莢蒾植株

表3 不同種類、濃度植物生長調節(jié)劑對宜昌莢蒾生根的影響

3 討論與結論

建立宜昌莢蒾無菌體系，外植體的消毒處理，選擇消毒劑的種類、不同的消毒時間是無菌化處理的關鍵。宜昌莢蒾葉片表面不平整有凹陷，單一消毒劑的效果效果不佳，本研究采用75%乙醇和0.1%HgCl2組合消毒明顯提高消毒效果[12]，降低污染率，迅速建立宜昌莢蒾無菌體系。關于不同滅菌時間對外植體存活率和污染率的效果有待進一步研究，以期探究最佳消毒處理時間。本試驗能實現(xiàn)葉片快速脫分 化形成有效愈傷組織，愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.05 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1，脫分化僅15 d 就能獲得色澤透明淺綠、結構致密的愈傷組織，其誘導率為100%.；對愈傷組織進行再分化培養(yǎng)14 d 后，就有不定芽形成，再分化的最佳培養(yǎng)基為N6+6-BA0.5 mg·L-1+TDZ0.7 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1，愈傷組織再分化率為100%。將不定芽進行生根培養(yǎng)，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.05 mg·L-1+NAA0.50 mg·L-1+活性炭1g·L-1，培養(yǎng)15 天后生根率為100%。通過本試驗從建立無菌體系到植株生根，在組培室經(jīng)展葉培養(yǎng)（10 d）、愈傷組織誘導（脫分化15 d）、不定芽發(fā)生（再分化14 d）、增殖培養(yǎng)（一個增殖周期是10 d）、生根培養(yǎng)（15 d），總計64 d 即可獲得大量完整的宜昌莢蒾植株，解決了宜昌莢蒾繁育困難的問題，并顯著提高了宜昌莢蒾的育苗效率，節(jié)約了生產(chǎn)成本，有利于宜昌莢蒾的種質資源的保存，為宜昌莢蒾工廠化育苗提供技術支持。