范程程,李明俊,許力山,齊 琪,孫麗麗,曹傳旺*

(1. 東北林業(yè)大學森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點實驗室,哈爾濱 15004;2. 內(nèi)蒙古赤峰市寧城縣坤頭河林場,寧城 024228)

昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)在異源化合物的解毒中起重要作用,并與殺蟲劑抗性有關(guān)(Huangetal., 2011)。GSTs主要催化親電化合物與還原性谷胱甘肽(GSH)的巰基結(jié)合,對底物進行親核代謝,使合成產(chǎn)物更易溶于水和排泄(Habigetal., 1974)。植物通過產(chǎn)生對昆蟲有害或有毒的次生物質(zhì)來抵御植食性昆蟲,同時對昆蟲體內(nèi)的解毒酶具有誘導作用(Howe and Herde, 2015),昆蟲為了降低植物次生物質(zhì)帶來的不利影響,也進化出多種適應性機制,例如體內(nèi)作用靶標發(fā)生變化,各種代謝酶誘導表達等(陳澄宇等, 2015)。綠盲蝽Apolyguslucorum、斜紋夜蛾Spodopteralitura、麥紅吸漿蟲Sitodiplosismosellena等昆蟲取食不同的植物次生物質(zhì)后,能夠誘導GST基因表達上調(diào)(黃敏燕等, 2018;朱香鎮(zhèn)等, 2018;陳銳等, 2020)。

溴氰蟲酰胺(Cyantraniliprole)是新型鄰二苯甲酰胺類殺蟲劑,具有高效低毒、殺蟲范圍廣、安全、不易產(chǎn)生交互抗性等特性(胡譯文等, 2016;李增鑫, 2021)。亞致死劑量溴氰蟲酰胺處理甜菜夜蛾Spodopteraexigua、灰飛虱Laodelphaxstriatellus、小地老虎Agrotisypsilon,昆蟲體內(nèi)GST活力表現(xiàn)為明顯的誘導作用,表明GST參與昆蟲解毒并起到關(guān)鍵作用(余慧靈, 2018;何發(fā)林等, 2019;張凱倫等, 2020)。

昆蟲響應次生物質(zhì)與化學殺蟲劑的共脅迫毒理研究已有相關(guān)報道。董向麗等(1998)研究表明蕓香苷與甲基對硫磷聯(lián)合處理可以大幅度提高棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraGST的活性。蕓香苷、槲皮素和2-十三烷酮可誘導棉鈴蟲體內(nèi)GST活性升高,槲皮素處理組對甲基對硫磷的敏感性降低近50%,蕓香苷和2-十三烷酮處理組對甲基對硫磷的敏感性略有降低(高希武, 1997)。植物化感物質(zhì)可以誘導棉鈴蟲體內(nèi)GST活性,可以利用其寄主的植物化感物質(zhì)來闡述其對滅多威和毒死蜱的防御(Zhuetal., 2017)。韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga在大蒜和腐殖質(zhì)飼養(yǎng)的幼蟲GST活性高于在韭菜和平菇上飼養(yǎng)的幼蟲,所以在大蒜和腐殖質(zhì)上飼養(yǎng)的幼蟲抗脅迫能力增強(Chenetal., 2018)。目前,國內(nèi)外對于楊樹次生物質(zhì)參與舞毒蛾響應殺蟲劑代謝機制研究甚少,因此,本文通過在飼料中分別添加寄主楊樹次生物質(zhì)(黃酮、槲皮素、蘆丁)以及溴氰蟲酰胺,測定舞毒蛾幼蟲存活率、GST活性及其基因的表達量,從基因和蛋白水平評價楊樹次生物質(zhì)對舞毒蛾響應溴氰蟲酰胺敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

舞毒蛾卵塊采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣坤頭河林場,人工飼料購買于中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護研究所。將舞毒蛾卵塊包裹于紗布中后浸泡于10%～15%甲醛溶液40 min,自來水沖洗10 min并晾干水分,幼蟲孵化后置于人工氣候箱內(nèi)(25℃、光周期14 L∶10 D、相對濕度70%)進行飼養(yǎng),挑取健康、大小一致的舞毒蛾2齡幼蟲作為供試昆蟲。

1.2 主要試劑

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性檢測試劑盒購自Solarbio公司。SYBR Green Real-time PCR Master mix熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo公司;RNeasy Mini購自Qiagen公司;Taq聚合酶及PCR相關(guān)試劑、Prime ScriptTMRT reagent Kit cDNA合成試劑盒均購自TaKaRa公司。黃酮(Flavone)原藥(99.0%)購自Amresco公司,槲皮素(Quercetin)原藥(97.0%)購自Scientific Instrument公司,蘆丁(Rutin)原藥(95.0%)購自上海九鼎化學科技有限公司,溴氰蟲酰胺原藥(97.0%)購自DuPont公司。

1.3 舞毒蛾致毒處理

黃酮、槲皮素和蘆丁含量的選擇參考楊樹葉片次生物質(zhì)含量及相關(guān)脅迫濃度,3種次生物質(zhì)的含量分別為黃酮0.8%(w/w)、槲皮素0.02%(w/w)和蘆丁0.5%(w/w)。根據(jù)毒力測定結(jié)果(表1),將溴氰蟲酰胺處理舞毒蛾2齡幼蟲48 h亞致死濃度LC30(4.06 mg/L)作為處理濃度。黃酮(8.8 g/L)、槲皮素(0.22 g/L)、蘆丁(5.5 g/L)經(jīng)換算后分別與溴氰蟲酰胺(4.06 mg/L)混合作為聯(lián)合處理1、聯(lián)合處理2和聯(lián)合處理3。將不同藥劑溶于二甲基亞砜(DMSO)后混入人工飼料作為處理組,對照組為加入等量DMSO的人工飼料。

表1 溴氰蟲酰胺對舞毒蛾2齡幼蟲48 h毒力

選擇健康、活潑、大小一致舞毒蛾2齡幼蟲饑餓24 h后,分別接入含溶劑DMSO、黃酮、槲皮素、蘆丁、溴氰蟲酰胺、聯(lián)合處理1、聯(lián)合處理2、聯(lián)合處理3的飼料中,每個處理20頭幼蟲,重復4次,處理后于6 h、12 h、24 h、48 h隨機挑取活潑的舞毒蛾2齡幼蟲,經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱,用于后續(xù)檢測GST活性及其基因表達量。

1.4 舞毒蛾GST活性測定

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測定按照GST活性檢測試劑盒(Solarbio)說明書的步驟進行,活性單位為μmol/min/mg protein。蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford(1976)的考馬斯亮藍G-250法。

1.5 實時熒光定量RT-PCR

采用RNeasy Mini動物組織總RNA提取試劑盒提取對照和不同處理的舞毒蛾樣品總RNA。采用Prime ScriptTMRT reagent Kit cDNA合成試劑盒將各處理組0.5 μg Total RNA分別合成cDNA,作為實時熒光定量RT-PCR模板。選擇課題組前期從舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得的經(jīng)次生物質(zhì)處理后可引起基因誘導表達上調(diào)的GST基因(LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1)作為候選基因(王振越, 2020),檢測GST基因表達量。

實時熒光定量RT-PCR使用SYBR Green Real-time PCR Master mix試劑盒,內(nèi)參為Actin和EF1α基因,引物序列見表2。實時熒光定量RT-PCR反應體系為2×SYBR premix Ex Taq酶10 μL、Primer mix (10 μmol/L) 1 μL、cDNA 2 μL,使用DEPC水補足至20 μL。反應條件為:94℃預變性30 s,94℃變性12 s,60℃退火45 s,72℃延伸45 s,81℃讀板1 s,45個循環(huán),每個樣品重復3次。

表2 目的基因RT-qPCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結(jié)果以平均值±標準差表示,運用SPSS 17.0軟件,采用Duncan方法進行差異顯著性分析(P<0.05),用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行繪圖。實時熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)儀器自帶的Opticon Monitor 3軟件處理。舞毒蛾GST基因表達量用2-△△Ct方法進行相對表達量分析(Pfaffl, 2001)。

Abott公式用于評估聯(lián)合藥劑對受試對象的聯(lián)合毒性(Gisi, 1996;Gatidou and Thomaidis, 2007),期望抑制率Cexp及復合脅迫表征值RI分別用下式表示:

Cexp= A+B-AB /100%;RI=OI / Cexp

式中A、B分別表示單一組分脅迫抑制率;OI為聯(lián)合脅迫抑制率;RI用于判斷兩種組分對受試對象的聯(lián)合毒性;RI<1表現(xiàn)為毒性拮抗,RI=1表現(xiàn)為毒性簡單相加,RI>1表現(xiàn)為毒性協(xié)同(Chesworthetal., 2004)。

2 結(jié)果與分析

2.1 次生物質(zhì)與溴氰蟲酰胺聯(lián)合作用對舞毒蛾存活率的影響

舞毒蛾2齡幼蟲在不同脅迫處理下48 h存活率不同(表3)。處理48 h后,對照組(DMSO)、槲皮素、蘆丁處理組幼蟲存活率為100%,黃酮處理組存活率為93.33%。溴氰蟲酰胺處理組幼蟲存活率為66.67%,顯著低于對照(DMSO)和次生物質(zhì)單劑處理組(P<0.05)。在48 h,3個聯(lián)合處理組幼蟲存活率與溴氰蟲酰胺處理組差異不顯著。存活率依次為53.33%、60.00%和53.33%。聯(lián)合處理1、聯(lián)合處理2和聯(lián)合處理3聯(lián)合脅迫表征值分別為1.24、1.20和1.40,聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表3 次生物質(zhì)和溴氰蟲酰胺對舞毒蛾幼蟲存活率的影響

2.2 次生物質(zhì)與溴氰蟲酰胺聯(lián)合作用對GST活性的影響

除了6 h之外,不同植物次生物質(zhì)單獨處理后的酶活性均有誘導增加作用。與黃酮和蘆丁處理組相比,槲皮素處理組在24 h和48 h對GST酶的誘導作用更強,分別為2.65 μmol/min/mg protein和2.43 μmol/min/mg protein。溴氰蟲酰胺對GST活性誘導效果顯著高于單一次生物質(zhì)作用,24 h誘導效果最大,為2.79 μmol/min/mg protein,為對照組的2.36倍。除聯(lián)合處理1在6 h、12 h的GST誘導活性分別低于溴氰蟲酰胺處理6 h、12 h活性外,各聯(lián)合處理組的GST誘導活性均高于溴氰蟲酰胺處理組。聯(lián)合處理2在24 h和48 h誘導活性分別為3.65 μmol/min/mg protein和 3.24 μmol/min/mg protein,分別為對照組的3.09倍和3.12倍,顯著高于聯(lián)合處理組1和聯(lián)合處理3。溴氰蟲酰胺和聯(lián)合處理脅迫對GST的誘導趨勢均表現(xiàn)為先升高后降低,且在24 h達到峰值(圖1)。

圖1 次生物質(zhì)和溴氰蟲酰胺對舞毒蛾2齡幼蟲GST活性影響

2.3 次生物質(zhì)與溴氰蟲酰胺聯(lián)合作用對GST基因表達的影響

不同脅迫處理對舞毒蛾2齡幼蟲GST基因LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1表達的影響如圖2所示。不同脅迫處理均使LdGSTe2基因表達水平上調(diào)。蘆丁處理6～24 h,LdGSTe2表達量顯著高于其它次生物質(zhì)處理組,且在6 h基因表達量上升至最大值,是對照組的24.08倍。3組聯(lián)合處理6 hLdGSTe2基因表達水平均顯著高于對照組,分別為對照組的3.15倍、37.98倍和6.48倍,高于溴氰蟲酰胺單劑的基因表達量,其中聯(lián)合處理2的誘導作用顯著高于其它處理組。

圖2 次生物質(zhì)和溴氰蟲酰胺對舞毒蛾幼蟲GST基因表達量影響

圖2 次生物質(zhì)和溴氰蟲酰胺對舞毒蛾幼蟲GST基因表達量影響

次生物質(zhì)和溴氰蟲酰胺脅迫均使LdGSTs1基因表達水平顯著上調(diào)。黃酮組處理48 h后,LdGSTs1基因表達量顯著高于槲皮素處理組和蘆丁組的基因表達量,為對照的10.88倍。溴氰蟲酰胺處理組LdGSTs1表達量為對照組基因表達量的1.02～3.71倍,且除6 h和24 h外,溴氰蟲酰胺在12 h和48 h基因表達量顯著低于蘆丁和槲皮素處理組基因表達量。3種聯(lián)合處理6 h、12 h和48 hLdGSTs1表達水平顯著上調(diào),聯(lián)合處理1處理48 hLdGSTs1基因表達水平顯著升高,為對照組基因表達量的11.21倍。聯(lián)合處理2處理12 h,LdGSTs1表達量為對照組的5.22倍。聯(lián)合處理3處理6 h,LdGSTs1表達量上升至最大值,為對照組基因表達量的10.88倍。

黃酮處理48 hLdGSTs2基因表達量顯著升高,為對照組基因表達量的33.02倍,但在其它時間點LdGSTs2的相對表達量則較對照組顯著降低。槲皮素處理24 h,LdGSTs2的表達水平顯著降低,為對照的27.09%。溴氰蟲酰胺處理6 h,LdGSTs2的相對表達量顯著高于對照,為對照的24.06倍,同時6～24 h的基因相對表達量均高于次生物質(zhì)處理組。3種聯(lián)合處理6 h,LdGSTs2相對表達量顯著上調(diào),聯(lián)合處理3的基因表達量最大,為對照的33.02倍,但12～48 h聯(lián)合處理1和聯(lián)合處理2LdGSTs2相對表達量低于對照組。

次生物質(zhì)脅迫下LdGSTz1相對表達量上調(diào),其中槲皮素處理組LdGSTz1基因表達量高于其它次生物質(zhì)處理組,且在48 h基因相對表達量達到最高值,為對照的11.20倍。溴氰蟲酰胺處理24 h后,LdGSTz1的基因表達量為對照的2.96倍,但在12 h 和48 h的基因表達量均低于次生物質(zhì)處理組。3種聯(lián)合處理組LdGSTz1基因表達量顯著高于對照組。聯(lián)合處理1處理12 h基因表達量達到峰值,為對照的3.77倍,但在12～48 h的基因表達水平逐漸降低。聯(lián)合處理2在12 h的基因表達量最低,為對照的1.62倍,但隨時間延長基因表達逐漸升高。聯(lián)合處理3組的基因表達水平表現(xiàn)為先升高后降低。在6～24 h的基因表達量由對照的1.64倍上升至對照的4.44倍,但在48 h降低至對照的1.83倍。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的升高可以加快對外源有毒物質(zhì)的代謝過程,增強昆蟲對逆境的適應性(李時榮等, 2018;樊艷平等, 2020)。氯氟氰菊酯、氟蟲腈和硫丹3種殺蟲劑處理馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata后,LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTo5和LdGSTt1均顯著過量表達(Hanetal., 2016)。甲氧蟲酰肼處理棉鈴蟲48 h后GSTs1相對表達量顯著升高,而GSTe2表達量先降低后升高,表明GSTs1和GSTe2通過表達量的變化影響GST酶活力進而形成對殺蟲劑的抗性(徐希寶等, 2014);水楊酸和蘆丁飼喂舞毒蛾后,可使LdGSTe4和LdGSTo1顯著誘導表達,將該基因沉默后會導致幼蟲對水楊酸和蘆丁的適應性降低(Maetal., 2021)。舞毒蛾LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因在對次生物質(zhì)的脅迫響應中表達量顯著升高,將舞毒蛾相關(guān)GST基因沉默后,導致幼蟲對不良環(huán)境的適應能力減弱,證實昆蟲對不良環(huán)境的應答機制與GST基因的表達密切相關(guān)(王振越,2020)。次生物質(zhì)和溴氰蟲酰胺對舞毒蛾GST主要表現(xiàn)為顯著誘導效應,其中聯(lián)合處理脅迫下的GST酶活性主要表現(xiàn)為高于溴氰蟲酰胺處理,但與各聯(lián)合處理所對應的次生物質(zhì)單劑相比顯著上升,且呈現(xiàn)不同的時間-活力趨勢變化。

害蟲取食不同寄主植物后,對殺蟲劑的敏感性可分為3類:敏感性下降、無明顯變化以及升高(姚洪渭等, 2002)。本研究綜合評價3種楊樹次生物質(zhì)黃酮、槲皮素、蘆丁影響舞毒蛾對溴氰蟲酰胺敏感性,次生物質(zhì)與溴氰蟲酰胺聯(lián)合毒性效果均為協(xié)同作用。舞毒蛾在次生物質(zhì)的誘導下,GST解毒活性升高,基因表達水平增加,證明GST相關(guān)基因參與了舞毒蛾對植物次生物質(zhì)的解毒代謝過程(Maetal., 2021),舞毒蛾抗藥性增強,敏感性下降,受到化學藥劑脅迫后,舞毒蛾死亡率上升,這是因為寄主植物中的次生物質(zhì)誘導激活或抑制昆蟲體內(nèi)與殺蟲劑代謝相關(guān)的解毒酶系,導致昆蟲對藥劑敏感性發(fā)生變化(Nenaetal., 2018)。次生物質(zhì)飼喂水稻、小麥、狗尾巴草誘導的中華稻蝗Oxyachinensis體內(nèi)GST活性的變化是導致其對馬拉硫磷敏感性差異的原因之一(張睿, 2008)。飼喂蕓香苷后,提高了棉鈴蟲對甲基對硫磷和滅多威的耐藥性,棉鈴蟲取食槲皮素提高了其F2代對滅多威的毒力;取食2-十三烷酮后,提高了棉鈴蟲對溴氰菊酯的耐藥性(董向麗等, 1998)。斜紋夜蛾幼蟲飼喂大豆和菜花后對丙烯磷有較高的GST誘導活性(Karuppaiahetal., 2016)。因此,在制定舞毒蛾的防治策略時,應考慮不同寄主植物對舞毒蛾解毒酶的誘導和毒性改變的重要性,這為植物與昆蟲互作提供更加豐富的理論依據(jù),并指導生產(chǎn)實踐中殺蟲劑的合理使用。