胡 慧,王 娜,牛洪濤,張志春,趙冬曉,郭慧芳

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,南京 210014)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda是一種新入侵我國(guó)的重大害蟲(chóng),自2019年1月首次在云南發(fā)現(xiàn)以來(lái),迅速擴(kuò)散至全國(guó)大部分地區(qū),給玉米安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。遷飛能力強(qiáng)、繁殖力高是草地貪夜蛾快速擴(kuò)散的重要原因(郭井菲等,2019;齊國(guó)君等,2020)。

昆蟲(chóng)中普遍存在內(nèi)共生菌,它們?cè)谡{(diào)節(jié)宿主生殖和抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用,是其進(jìn)化的重要?jiǎng)恿?Himleretal., 2011; van den Bosch and Welte, 2016; Lietal., 2020)。蚜蟲(chóng)、煙粉虱Bemisiatabaci等重要刺吸類(lèi)害蟲(chóng)中的內(nèi)共生菌已受到廣泛關(guān)注,除原生共生菌外,發(fā)現(xiàn)它們還含有Regiella、Hamiltonella、Arsenophonus、Rickettsia、Serratia和Wolbachia等多種次生共生菌,共生菌的功能各不相同,主要包括提高宿主生殖能力以及抗殺蟲(chóng)微生物和寄生蜂能力等抗逆功能(Oliveretal., 2005; Himleretal., 2011;ukasiketal., 2013; Liu and Guo, 2019; Lietal., 2020)。此外,還發(fā)現(xiàn)共生菌也可削弱宿主的抗逆能力,如非洲粘蟲(chóng)中Wolbachia能降低宿主對(duì)昆蟲(chóng)核型多角體病毒的抵抗力(Grahametal., 2012),褐飛虱Nilaparvatalugens中共生菌Arsenophonus則降低了宿主對(duì)化學(xué)藥劑的抵抗力(Pangetal., 2018)。較刺吸類(lèi)害蟲(chóng)而言,鱗翅目害蟲(chóng)體內(nèi)共生菌研究相對(duì)較少。在非洲粘蟲(chóng)和幻紫斑蛺蝶Hypolimnasbolina等中,發(fā)現(xiàn)了Wolbachia的感染(Dysonetal., 2002;Grahametal., 2012)。關(guān)于草地貪夜蛾體內(nèi)微生物,僅有關(guān)于腸道微生物的研究,從幼蟲(chóng)中篩選分離出14種腸道細(xì)菌菌株,包括2種纖維素降解細(xì)菌(李宏偉等,2020)。該害蟲(chóng)中內(nèi)共生菌感染情況如何?國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖有著適宜的溫度,溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響其正常的生命周期,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡(Broufasetal.,2009)。昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為適應(yīng)惡劣的生境條件,表現(xiàn)耐寒和耐熱能力多樣性,如二化螟Chilosuppressalis不同地理種群耐寒能力有差異,在相同的低溫下,北京種群的半致死時(shí)間較福州種群更長(zhǎng)(張珺等,2005)。在15℃～30℃范圍內(nèi),草地貪夜蛾在15℃下的死亡率最高,不能完成整個(gè)世代發(fā)育(劉小宇等,2022)。不同地區(qū)草地貪夜蛾耐寒能力是否存在差異?其是否與害蟲(chóng)休內(nèi)生菌感染存在相關(guān)性,均未見(jiàn)研究報(bào)道。本文將比較不同地區(qū)采集草地貪夜蛾共生菌感染的差異以及耐寒能力差異,以為進(jìn)一步分析共生菌功能奠定基礎(chǔ),也為我國(guó)草地貪夜蛾遷飛路線(xiàn)分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

2019年5-7月分別在我國(guó)不同地區(qū)玉米田采集草地貪夜蛾幼蟲(chóng),每個(gè)地區(qū)采集35～128頭(采集具體信息見(jiàn)表1)。草地貪夜蛾采回后在室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng),按地區(qū)分別進(jìn)行群體飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:溫度27±1℃,相對(duì)濕度70%±5%,光周期L∶D=14∶10。飼養(yǎng)1～3代后,在各種群中隨機(jī)選用3齡以上幼蟲(chóng)進(jìn)行共生菌檢測(cè),待檢測(cè)幼蟲(chóng)單頭分裝到離心管中,保存于-80℃冰箱。

表1 草地貪夜蛾的采集信息

1.2 草地貪夜蛾基因組DNA提取

草地貪夜蛾單頭幼蟲(chóng)放置于1.5 mL離心管中,先用75%酒精清洗一次,再用無(wú)菌水清洗一次,液氮中速凍后研磨至粉狀后,立即加入350 μL PBS溫和研磨30 s,用DNA提取試劑盒(Promega A1125)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取,-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 草地貪夜蛾夜蛾體內(nèi)共生菌檢測(cè)

除廣西南寧種群收集84頭試蟲(chóng)外,其余各種群均收集60頭試蟲(chóng)用于檢測(cè),共檢測(cè)Portiera、Hamiltonella、Wolbachia、Cardinium、Arsenophonus、Rickettsia、Fritschea、Serratia和Acinetobacter9種共生菌,引物詳細(xì)信息見(jiàn)表2(上海生工生物工程公司合成);PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL,包括 2×Master Mix 13 μL,上游引物和下游引物各1 μL,滅菌超純水8 μL,DNA模板2 μL。擴(kuò)增程序因共生菌不同而異,共9個(gè)程序,分別為:

表2 草地貪夜蛾不同地理種群共生菌感染率

表2 共生菌檢測(cè)用引物序列

(A)95℃ 5 min;94℃ 30 s,56℃ 1 min ,72℃ 1 min,循環(huán)35次;72℃ 20 min。

(B) 95℃ 3 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 45 s,循環(huán)35次;72℃ 10 min。

(C) 94℃ 2 min;94℃ 1 min,65℃→55℃,1 min,72℃ 2 min,循環(huán)10次;94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 2 min,循環(huán)25次;72℃ 6 min 。

(D) 95℃ 3 min;94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 90 s,循環(huán)35次;72℃ 5 min。

(E) 95℃ 5 min;95℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,循環(huán)30次;72℃ 20 min。

(F) 95℃ 5 min;94℃ 1 min,64℃ 1 min,72℃ 90 s,循環(huán)35次;72℃ 5 min。

(G) 95℃ 3 min;94℃ 1 min,56℃ 1 min,72℃ 1 min,循環(huán)5次;95℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,循環(huán)30次;72℃ 20 min。

(H) 95℃ 3 min;94℃ 1 min,56℃ 1 min,72℃ 90 s,循環(huán)35次;72℃ 10 min。

(I)95℃ 3 min;94℃ 1 min,56℃ 1 min,72℃ 90 s,循環(huán)35次;72℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物的純化、連接轉(zhuǎn)化與序列測(cè)定:使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物(TIANgel Midi Purification Kit),具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)按照pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。挑斑、搖菌后,將陽(yáng)性克隆用于測(cè)序,所有測(cè)序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成,測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.4 草地貪夜蛾夜蛾耐寒能力測(cè)定

通過(guò)測(cè)定-6℃低溫下草地貪夜蛾的死亡率來(lái)比較害蟲(chóng)的耐寒能力。將經(jīng)過(guò)室內(nèi)連續(xù)20代人工飼養(yǎng)的各地區(qū)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)放入裝有人工飼料的培養(yǎng)皿中(直徑35 mm),每個(gè)培養(yǎng)皿20頭作為一個(gè)重復(fù),每個(gè)種群5個(gè)重復(fù),放置于人工氣候培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)箱溫度從27℃以0.25℃/min速度降至0℃,在0℃保持3 h后,再以0.25℃/min的速度降至-6℃,在-6℃保持5 h后,以0.25℃/min的速度升溫至27℃,在27℃下保持48 h。每隔24 h加入新鮮人工飼料,觀(guān)察記錄各培養(yǎng)皿中死亡蟲(chóng)數(shù),計(jì)算死亡率。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用MEGA 6軟件對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)內(nèi)共生菌進(jìn)行同源性分析,鄰接法(Neighbor-Joining(NJ))構(gòu)建基于16S rDNA序列或23S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)不同地區(qū)草地貪夜蛾共生菌感染率差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析,對(duì)低溫下害蟲(chóng)死亡率采用單因素方差分析和Tukey多重比較法進(jìn)行不同地區(qū)間的差異顯著性分析,對(duì)共生菌感染率與低溫死亡率進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 我國(guó)草地貪夜蛾攜帶共生菌種類(lèi)

對(duì)來(lái)自廣西、廣東、湖北、云南、貴州和江蘇等8個(gè)地區(qū)草地貪夜蛾進(jìn)行共生菌檢測(cè),共檢測(cè)包括Portiera、Cardinium、Arsenophonus、Hamiltonella、Wolbachia、Rickettsia、Fritschea、Acinetobacter、Serratia等9種共生菌。發(fā)現(xiàn)各地草地貪夜蛾中只檢測(cè)到Cardinium和Arsenophonus這兩種共生菌,Cardinium16S rDNA序列號(hào)為MN864662.1,Arsenophonus23S rDNA序列號(hào)為MW282126.1。

圖1 草地貪夜蛾體內(nèi)共生細(xì)菌擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 草地貪夜蛾體內(nèi)Arsenophonus和Cardinium的同源性分析

比較分析了草地貪夜蛾與其它昆蟲(chóng)體內(nèi)共生菌Arsenophonus的同源性,基于23S rDNA序列通過(guò)NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示(圖2),草地貪夜蛾體內(nèi)Arsenophonus與同屬鱗翅目的二化螟中Arsenophonus親緣關(guān)系最近,在同一分支上,與煙粉虱、麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis、大豆蚜Aphisglycines中Arsenophonus的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),在另一分支上,而與白蠟蚧Ericeruspela和褐飛虱的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),后兩者在另一獨(dú)立分支上。

圖2 基于23S rDNA序列構(gòu)建的草地貪夜蛾共生菌Arsenophonus系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

對(duì)草地貪夜蛾與其它昆蟲(chóng)體內(nèi)共生菌Cardinium的同源性進(jìn)行了分析,基于16S rDNA序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明(圖3),草地貪夜蛾體內(nèi)共生菌Cardinium與果蠅Drosophilabifurca、螫斑鼓翅蠅Sepsispunctum、恩蚜小蜂Encarsiainaron最近,在同一分支上;與煙粉虱體內(nèi)Cardinium較為接近,而與Hamaliasirokata和白背飛虱Sogatellafurcifera中Cardinium親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),與螨Microzetorchestesemeryi中Cardinium的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的草地貪夜蛾共生菌Cardinium系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 不同地區(qū)草地貪夜蛾共生菌感染率差異

對(duì)采自江蘇、廣東、廣西、貴州、云南和湖北等6個(gè)省份8個(gè)地區(qū)草地貪夜蛾共生菌感染率進(jìn)行了比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Arsenophonus和Cardinium這兩種共生菌感染率在不同地區(qū)間均存在顯著差異(表2)。從Arsenophonus的感染來(lái)看,各地理種群中總體較低,以云南保山地區(qū)草地貪夜蛾Arsenophonus的感染率最高,為20.0%,其次是廣西南寧地區(qū),感染率為15.5%,貴州貴陽(yáng)和江蘇鹽城的感染率均為1.7%,而廣東廣州、江蘇無(wú)錫以及湖北宜昌和孝感這4個(gè)地理種群中均未發(fā)現(xiàn)Arsenophonus的感染(χ2=78.658, df=7,P<0.001)。共生菌Cardinium的感染總體較高,感染率最高的為江蘇無(wú)錫種群,高達(dá)96.7%,其次為云南保山種群,感染率為93.3%,廣東廣州種群感染率為86.7%,貴州貴陽(yáng)種群為53.3%,湖北孝感和宜昌種群感染率則分別為30.0%和18.3%,江蘇鹽城種群感染率也為18.3%,而廣西南寧種群中未發(fā)現(xiàn)有Cardinium感染(χ2=296.727, df=7,P<0.001)。

2.4 不同地區(qū)草地貪夜蛾耐寒能力比較

為明確不同地區(qū)草地貪夜蛾耐寒能力差異,比較了廣西南寧等8個(gè)地區(qū)草地貪夜蛾在-6℃低溫脅迫下的死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)草地貪夜蛾耐寒能力存在顯著性差異,湖北宜昌地區(qū)草地貪夜蛾耐寒能力最強(qiáng),低溫脅迫后死亡率最低,為35%,顯著低于江蘇鹽城和湖北孝感地區(qū)死亡率(76%和69%),其它6個(gè)地區(qū)害蟲(chóng)低溫下死亡率也較低,在46%～49%之間,同樣顯著低于鹽城和孝感地區(qū),但6個(gè)地區(qū)間無(wú)顯著差異(F7, 39=4.653,P=0.0011;圖4)。

圖4 不同地區(qū)草地貪夜蛾-6℃脅迫下的死亡率比較

2.5 草地貪夜蛾共生菌感染與耐寒能力相關(guān)性分析

對(duì)各地區(qū)草地貪夜蛾共生菌感染率和低溫下害蟲(chóng)死亡率相關(guān)性分析表明,Cardinium感染率與-6℃低溫脅迫下的死亡率沒(méi)有顯著相關(guān)性(線(xiàn)性回歸相關(guān)系數(shù)=0.3971,P>0.05),Arsenophonus感染率與-6℃低溫脅迫下的死亡率也沒(méi)有顯著相關(guān)性(線(xiàn)性回歸相關(guān)系數(shù)=0.5023,P>0.05),說(shuō)明草地貪夜蛾中Cardinium和Arsenophonus感染與宿主耐寒能力均無(wú)直接相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)了草地貪夜蛾體內(nèi)有內(nèi)共生細(xì)菌Cardinium和Arsenophonus的感染,兩種共生菌的感染在我國(guó)2019年采集的不同地理種群中存在差異。Cardinium在我國(guó)江蘇、云南以及廣東各地草地貪夜蛾中感染率較高,而在廣西南寧種群中未被發(fā)現(xiàn),而Arsenophonus在被檢測(cè)種群中有一半未被發(fā)現(xiàn),已發(fā)現(xiàn)地區(qū)感染率也不高。作為一種新入侵我國(guó)的害蟲(chóng),草地貪夜蛾一入侵后就表現(xiàn)出了共生菌感染在不同地區(qū)間的差異,說(shuō)明草地貪夜蛾在入侵我國(guó)的初期尚未受到本地其它害蟲(chóng)共生菌的顯著影響,可能與遷入蟲(chóng)源相關(guān)。

關(guān)于草地貪夜蛾在我國(guó)的遷飛路徑,Li等(2020)利用軌跡分析方法預(yù)測(cè)了草地貪夜蛾在我國(guó)有東線(xiàn)和西線(xiàn)兩條由南向北的遷飛路線(xiàn),其中東線(xiàn)源于泰國(guó)、老撾、越南,進(jìn)入我國(guó)華南地區(qū)后,逐步向北遷入長(zhǎng)江流域、黃淮以及黃河以北地區(qū);西線(xiàn)則源于緬甸,進(jìn)入我國(guó)云南省后,經(jīng)貴州、四川后,遷入山西、陜西、甘肅等地。從我國(guó)各地草地貪夜蛾中共生菌Cardinium感染情況比較來(lái)看,我國(guó)廣東廣州、云南保山和江蘇無(wú)錫地區(qū)害蟲(chóng)體內(nèi)Cardinium感染率均很高,而廣西南寧地區(qū)未見(jiàn)Cardinium感染,說(shuō)明江蘇地區(qū)草地貪夜蛾來(lái)源于廣東的可能性很大,廣西和廣東的境外蟲(chóng)源可能存在一定的差異。在草地貪夜蛾中發(fā)現(xiàn)的另一種共生菌Arsenophonus在云南種群中有一定的感染率,而在廣東以及長(zhǎng)江中下游的湖北和江蘇地區(qū)均接近零感染。草地貪夜蛾在各地共生菌的差異為用軌跡分析方法預(yù)測(cè)出來(lái)的害蟲(chóng)東西線(xiàn)兩條遷飛路徑初步提供了一定的現(xiàn)實(shí)依據(jù),但同一地區(qū)或者模擬同一路徑上害蟲(chóng)共生菌感染的差異性,也反映出遷飛性害蟲(chóng)遷飛路徑的復(fù)雜性,要進(jìn)一步通過(guò)不同地區(qū)草地貪夜蛾共生菌的差異分析來(lái)明確害蟲(chóng)的詳細(xì)遷飛路徑,今后還需要對(duì)更多地區(qū)害蟲(chóng)共生菌進(jìn)行具體分析。再?gòu)母鞯貐^(qū)草地貪夜蛾抗寒能力差異來(lái)看,尚未表現(xiàn)出與害蟲(chóng)東西遷飛路線(xiàn)的相關(guān)性。

關(guān)于共生菌Cardinium在昆蟲(chóng)中的功能,已報(bào)道它主要與宿主生殖調(diào)控相關(guān)。Cardinium和Wolbachia共感染能誘導(dǎo)煙粉虱雄性后代減少和細(xì)胞質(zhì)不親和,在寄生蜂Encarsiasuzannee中Cardinium也引起宿主昆蟲(chóng)的細(xì)胞質(zhì)不親和(Lvetal.,2020;Pilgrimetal., 2021)。而就Arsenophnus的功能,已發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)控生殖和影響化學(xué)藥劑和殺蟲(chóng)微生物敏感性等多種功能。已報(bào)道Arsenophnus在麗蠅蛹集金小蜂中可殺死雄性胚胎,導(dǎo)致其雌性化(Hugeretal., 1985),在褐飛虱中幫助宿主抗殺蟲(chóng)真菌綠僵菌(朱歡歡等,2017),還降低了褐飛虱對(duì)吡蟲(chóng)啉的敏感性(Pangetal., 2018)。為發(fā)掘共生菌新功能,本研究在比較發(fā)現(xiàn)我國(guó)不同地區(qū)草地貪夜蛾耐寒能力存在顯著差異基礎(chǔ)上,初步分析了Arsenophnus和Cardinium與宿主耐寒能力的相關(guān)性,但未發(fā)現(xiàn)其存在關(guān)聯(lián)。Arsenophnus和Cardinium這兩種共生菌在草地貪夜蛾中是否具有抗殺蟲(chóng)微生物以及調(diào)控生殖的功能?除此外,有無(wú)其它功能?均有待進(jìn)一步的研究。