趙杰,曹文婷

皮膚光老化主要是指長期紫外線照射引起的皮膚衰老,是各種免疫性、炎癥性、腫瘤性皮膚疾病的重要誘因,但是關(guān)于皮膚光老化的發(fā)生發(fā)展機制,目前國內(nèi)外研究尚不完全清楚。近年來,越來越多的學(xué)者從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度來闡述皮膚光老化的發(fā)生發(fā)展及其上下游調(diào)控機制。本文將國內(nèi)外對轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于皮膚光老化的研究成果進(jìn)行綜述,旨在總結(jié)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于光老化研究的優(yōu)勢與新發(fā)現(xiàn),并且該技術(shù)正在不斷革新和發(fā)展,這將進(jìn)一步促進(jìn)光老化的發(fā)生發(fā)展機制及防治研究。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的概述

轉(zhuǎn)錄組囊括了所有RNA的轉(zhuǎn)錄本,各種生物體的轉(zhuǎn)錄組主要通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)來進(jìn)行研究。生物體通過轉(zhuǎn)錄表達(dá)其記錄在基因組DNA中的信息,mRNA作為中介分子在轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用。轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄前后水平的精確控制則通過非編碼RNA完成［1］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)始于20世紀(jì)90年代,至今該技術(shù)不斷發(fā)展革新,目前主要包括微陣列和RNA測序(RNA- seq)兩種技術(shù),前者可以對某一組預(yù)定的序列進(jìn)行定量分析;后者則通過高通量測序?qū)λ行蛄羞M(jìn)行捕獲,并且因其可以對未知序列進(jìn)行測序而被廣泛應(yīng)用。

RNA測序按照RNA類型分為:mRNA測序、LncRNA測序、microRNA(miRNA)測序和circRNA測序［2］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以在空間和時間上量化基因的表達(dá)差異,提供基因如何被調(diào)節(jié)的信息,并揭示其生物學(xué)功能。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)使研究不同生物之間、健康個體與患病個體之間的基因表達(dá)差異成為可能,而單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)使轉(zhuǎn)錄組分析具有前所未有的靈敏度和廣度,并發(fā)現(xiàn)了新的RNA種類,加深了對轉(zhuǎn)錄組動力學(xué)的理解［3］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的操作流程包括:1.總RNA的提取;2.構(gòu)建RNA測序文庫:①RNA的分離;②將RNA切割成小片段;③RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;④測序;⑤通過PCR擴增文庫;3.數(shù)據(jù)分析［4］。

2 轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ζつw老化發(fā)病機制的探索

皮膚老化按照其發(fā)生的機理不同,有內(nèi)源性與外源性之分。隨著年齡增長而自然發(fā)生的皮膚衰老現(xiàn)象稱為內(nèi)源性老化。而由于外部因素(如長時間受到紫外線照射、吸煙、接觸有毒有害化學(xué)物質(zhì)等)引起的皮膚老化稱為外源性老化。其中由于紫外線的影響最大,紫外線所導(dǎo)致的光老化被認(rèn)為是外源性老化中最重要的因素,也是目前研究最多的方向［5］,皮膚粗糙、深皺紋形成、色素沉著是主要表現(xiàn)。

有研究［6］表明,血管生成在光損傷皮膚中起重要作用,Cho等［7］對紫外線暴露和非暴露兩組皮膚組織樣本的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),在紫外線暴露組,基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因:MMP2、MMP3、MMP8、MMP10和MMP13,參與血管發(fā)育的基因:TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、KDR、FGF2和VEGFC的表達(dá)水平均上調(diào);參與脂質(zhì)代謝,尤其是在表皮屏障功能中起作用的基因:LIPN、LIPK和SMPD3,其表達(dá)水平隨著光老化發(fā)展顯著下調(diào)。提示血管發(fā)育和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因可能參與皮膚光老化的發(fā)生與發(fā)展。還有研究［8-11］表明,紫外線照射可刺激血管生成因子分泌增加,從而促進(jìn)黑素細(xì)胞形成黑色素,這與皮膚光老化色素沉著有關(guān)。Kim等［12］通過RNA序列分析發(fā)現(xiàn),紫外線照射后內(nèi)皮細(xì)胞比未照射組分泌更多的干細(xì)胞因子(SCF),抑制SCF/c-KIT信號通路后,皮膚色素沉著增加被消除,表明內(nèi)皮細(xì)胞來源的SCF在紫外線誘導(dǎo)相關(guān)的色素沉著疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用,進(jìn)一步提示了血管發(fā)育基因可能是皮膚光老化中參與色素沉著進(jìn)程的基因之一。綜上,脈管系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)變化將可能是探索皮膚光老化發(fā)生機制的一個新方向。

紫外線是皮膚光老化的主要誘導(dǎo)因素［5］,轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可用于深入分析紫外線導(dǎo)致皮膚光老化過程中RNA分子如何發(fā)揮作用。為了研究UVA誘導(dǎo)的基因改變對皮膚光老化的影響,Zheng等［13］通過對反復(fù)UVA照射和未照射的人類真皮成纖維細(xì)胞(HDF)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序,通過生物信息學(xué)分析及q-PCR對差異性表達(dá)基因進(jìn)行驗證:238個基因在UVA照射組表達(dá)上調(diào),369個基因表達(dá)下調(diào),這些差異基因主要通過編碼彈性蛋白、芽蛋白、組織蛋白酶K、組織蛋白酶D、組織蛋白酶B、磷酸二磷酸激酶、磷酸葡萄糖醛酸酶等蛋白質(zhì),影響皮膚光老化的發(fā)生與發(fā)展。這些研究結(jié)果為皮膚光老化的分子機制提供了新見解。Alafiatayo等［14］應(yīng)用RNA-Seq檢測闡述了HDF暴露于紫外線輻射下會產(chǎn)生基因級聯(lián)和通路間相互作用,導(dǎo)致MAPK/TNF-α通路激活,而抗氧化基因表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激和過早死亡。

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)參與研究非編碼RNA在皮膚光老化中的作用

轉(zhuǎn)錄組分析可識別皮膚老化的分子生物標(biāo)志物,非編碼RNA被認(rèn)為具有促進(jìn)皮膚衰老的作用［15-16］,應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序研究非編碼RNA在皮膚老化中的調(diào)控取得了突破性進(jìn)展［17］。

Li等［18］通過RNA-Seq鑒定出UVB輻照和未輻照HDFs的lncRNA差異表達(dá)譜,對差異基因進(jìn)行q-PCR驗證及生物信息學(xué)分析,其中l(wèi)ncRNA RP11-670E13.6在UVB-HDF組細(xì)胞中表達(dá)顯著增加,敲除lncRNA RP11-670E13.6加速了細(xì)胞衰老,細(xì)胞周期阻滯,并且RP11-670E13.6的表達(dá)可能通過激活p16-pRB衰老通路來延緩HDFs衰老,因此lncRNA RP11-670E13.6可能作為氧化應(yīng)激原件對皮膚光老化進(jìn)行調(diào)控,這為皮膚光老化的研究提供了新思路。Shen 等［19］通過RNA-Seq分析UVA反復(fù)照射后HDFs中l(wèi)ncRNA的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)1 730個差異表達(dá)的lncRNA,其中1 494個表達(dá)上調(diào),236個表達(dá)下調(diào),預(yù)測的lncRNA靶點與UVA損傷機制下的組織蛋白酶D、絲裂原活化蛋白激酶、TGF-β信號通路以及膠原纖維代謝有關(guān),這些異常表達(dá)的lncRNA可能在皮膚光老化中起重要作用。為了進(jìn)一步研究lncRNA在光老化中的作用機制,該課題組又進(jìn)行了miRNA測序及q-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)了34個差異表達(dá)的miRNA,并構(gòu)建了miRNA-lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)TNF信號通路、甲狀腺激素信號通路和溶酶體信號通路的改變,從ceRNA(competing endogenous RNAs)的角度探索皮膚光老化的發(fā)生機制［20］。

4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于探索藥物改善光老化的藥理機制

雪絨花愈傷組織培養(yǎng)提取物(LACCE)被認(rèn)為對人類永生化表皮(HaCaT)細(xì)胞具有抗衰作用,可以改善紫外線誘導(dǎo)形成的皮膚皺紋等老化現(xiàn)象。Cho等［21］使用RNA-Seq來檢測HaCaT細(xì)胞對LACCE反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組變化,發(fā)現(xiàn)LACCE通過上調(diào)參與角化和角化的基因,保護皮膚屏障,并能下調(diào)各種應(yīng)激誘導(dǎo)基因表達(dá)。雖然LACCE的這些效應(yīng)在抗光老化中的具體作用未得到進(jìn)一步證實,但是該研究發(fā)現(xiàn),LACCE抑制了HaCaT細(xì)胞中COX-2的表達(dá),而該基因編碼誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的蛋白質(zhì),因此LACCE的抗應(yīng)激、抗炎作用可能是其抗光老化的機制之一,這有待進(jìn)一步研究。

皮膚光損傷引起炎癥反應(yīng)是光老化的發(fā)病機制之一,鑒于二甲雙胍具有抗炎和細(xì)胞保護作用,Xiao［22］等采用轉(zhuǎn)錄組測序和多重細(xì)胞因子分析、評價體外UVB誘導(dǎo)的急性損傷HaCaT模型及C57小鼠光損傷模型的有效性和二甲雙胍的抗炎作用,發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能顯著抑制IL-1β、TNF-α和成纖維細(xì)胞生長因子2的轉(zhuǎn)錄和分泌以及轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)的表達(dá)和核易位。該研究提示二甲雙胍在光損傷治療中具有潛在價值。Kim等［23］通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)口服可可粉(CP)可上調(diào)絲氨酸蛋白酶 B6c,從而使組織蛋白酶G失活,調(diào)節(jié)基質(zhì)生成,故能一定程度地緩解UVB導(dǎo)致的皮膚皺紋形成。

雞骨膠原肽(CPs)具有典型的膠原特性,Cao等［24］發(fā)現(xiàn),口服CPs對紫外線聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的皮膚衰老具有劑量依賴性緩解作用,通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)口服CPs后激活的溶酶體可能是CPs抗皮膚衰老的重要途徑,但具體的分子機制有待進(jìn)一步探究。

以上研究不止揭示了某種物質(zhì)抗皮膚光老化的部分通路機制,其發(fā)現(xiàn)的作用通路/基因更是對皮膚光老化復(fù)雜分子機制的重要補充,并有望為研發(fā)新的抗光老化藥物提供靶點。

5 多組學(xué)聯(lián)合分析探索皮膚光老化的發(fā)生機制

轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合代謝組學(xué):多項研究［25-26］表明,氧化應(yīng)激反應(yīng)是紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷的重要原因,Narzt等［27］通過比較暴露于UVA或暴露于氧化的多不飽和模型磷脂(UVPAPC)的HaCaT細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、蛋白組學(xué)差異,發(fā)現(xiàn)兩組中有81個共同誘導(dǎo)基因,其中47個為共同下調(diào),通路分析發(fā)現(xiàn),UVA和UVPAPC均顯著誘導(dǎo)了NRF2控制的氧化應(yīng)激反應(yīng),并且核蛋白1 (NUPR1/p8/COM1)作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著NRF2通路。Cho等［7］發(fā)現(xiàn),表皮分化復(fù)合物成分(SPRR和LCE家族),脈管系統(tǒng)發(fā)育(TGFBR1,TGFBR2,TGFBR3和VEGFC等)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2,MMP3和MMP13等)被紫外線照射上調(diào),而脂質(zhì)代謝下調(diào),再次提示脂質(zhì)代謝相關(guān)基因可能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)破壞皮膚屏障并加速皮膚光老化反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合表觀遺傳學(xué): Shen等［28］通過分析UVA照射后基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組之間的相互作用,闡明紫外線輻射影響皮膚穩(wěn)態(tài)的復(fù)雜分子機制。應(yīng)用RNA-seq、外顯子組-seq和H3K27ac(組蛋白3賴氨酸27乙?；? ChIP-seq 對紫外線照射后的人角質(zhì)形成細(xì)胞分析,發(fā)現(xiàn):UVA誘導(dǎo)下,H3K27ac基因突變或再分布導(dǎo)致了其基因子集的轉(zhuǎn)錄失調(diào),導(dǎo)致UVA照射細(xì)胞中形成超級增強子,還發(fā)現(xiàn)了CYP24A1、GJA5、SLAMF7和ETV1等新的紫外線靶基因,可用于靶向預(yù)防和治療紫外線誘導(dǎo)的皮膚癌。Holzscheck等［29］從轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳水平深入研究了健康人體皮膚重復(fù)紫外線照射后的早期分子改變,發(fā)現(xiàn)明顯的基因表達(dá)差異和甲基化差異,再次表明了在皮膚應(yīng)激反應(yīng)時表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組的變化密切相關(guān)。

6 結(jié)語

綜上,氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫抑制、DNA損傷、MMP表達(dá)增加等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是皮膚光老化形成的重要機制,對于新通路和基因的發(fā)掘以及現(xiàn)有通路和基因功能的進(jìn)一步闡釋離不開轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新技術(shù)的不斷發(fā)展,這些通路和基因的發(fā)現(xiàn)可以為皮膚光老化的預(yù)防和治療提供新的靶點和思路。但是由于細(xì)胞異質(zhì)性的存在,每個細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組均存在差異,然而這種差異無法通過傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),進(jìn)而催生出新的測序技術(shù)—單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序［30］。目前該技術(shù)已廣泛用于對正常皮膚組織和多種皮膚疾病的研究［31-33］,Sole-Boldo等［34］已通過單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同亞群的HDFs的數(shù)量減少、生理功能喪失與年齡相關(guān)的皮膚衰老密切相關(guān),未來該技術(shù)勢必也將更廣泛地應(yīng)用于皮膚光老化的研究中,并為皮膚光老化的防治帶來更多新靶點。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)在皮膚光老化的分子治療靶點中的不斷應(yīng)用,其也有望成為評估分子治療效應(yīng)的重要手段。另外,轉(zhuǎn)錄組學(xué)與其他組學(xué)的聯(lián)合分析將能更全面、更準(zhǔn)確地闡明皮膚光老化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。