謝俊宇 ，茅穎惠 ，曹 瑩

（南京工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211167）

1 微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的發(fā)展背景

2022 年10 月，黨的二十大報告提出全面推進鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略，堅持農(nóng)業(yè)農(nóng)村優(yōu)先發(fā)展，鞏固和完善農(nóng)村基本經(jīng)營制度，發(fā)展新型農(nóng)村集體經(jīng)濟，發(fā)展新型農(nóng)業(yè)經(jīng)營主體和社會化服務(wù)，發(fā)展農(nóng)業(yè)適度規(guī)模經(jīng)營。水產(chǎn)業(yè)作為農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個重要部分，在經(jīng)濟增長方面的貢獻越來越大。《2021 年全國漁業(yè)經(jīng)濟統(tǒng)計公報》[1]和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）發(fā)布的《2022 年世界漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖狀況》[2]顯示，我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量占世界生產(chǎn)總量的31.26%，水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量占世界總量的61.65%。過去由于個體水產(chǎn)養(yǎng)殖缺乏監(jiān)管，個別養(yǎng)殖戶亂用或濫用漁藥、微生物菌劑，隨意排放養(yǎng)殖污水。不僅造成了水體污染導(dǎo)致病害頻發(fā)，還大大損害了漁業(yè)質(zhì)量與產(chǎn)量。而目前，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)正在逐步由區(qū)到片進行高密度集約化發(fā)展。

以往我國對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)治理的關(guān)注度普遍不高，而水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)近年來的加速發(fā)展，導(dǎo)致越來越多的病害問題、污染問題困擾著行業(yè)內(nèi)部。不科學(xué)的養(yǎng)殖管理模式，水體的富營養(yǎng)化，抗生素的濫用引起的水質(zhì)污染、養(yǎng)殖廢水的亂排亂放等問題遲遲得不到解決。2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等十部委發(fā)布了《關(guān)于加快推進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見》[3]，關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的治理也逐漸得到重視，如何尋找一種可持續(xù)、可推廣、綠色環(huán)保的生態(tài)治理方案是水產(chǎn)行業(yè)目前發(fā)展的難題。微生物生態(tài)治理以往大多應(yīng)用在湖泊、水庫等水體整治中，鮮有應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的研究，本文對微生物法在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中的幾種常見應(yīng)用研究原理和其目前的發(fā)展現(xiàn)況進行介紹，并分別闡述其未來的應(yīng)用前景。

2 微生物與養(yǎng)殖對象的聯(lián)系

微生物和養(yǎng)殖對象之間存在著直接和間接影響，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，魚蝦類的排泄污染物在極大程度上影響了水質(zhì)，會不可避免地造成附近水域水體富營養(yǎng)化[4]。隨之而來的是病毒微生物帶來的毒害，附帶上化學(xué)藥劑的濫用，導(dǎo)致病毒性疾病在魚蝦中擴散。水體中的微生物直接影響著養(yǎng)殖對象的存活率以及產(chǎn)量，而養(yǎng)殖對象又會間接影響微生物在水體中的富集化程度。例如同一片水域中鰱鳙混養(yǎng)，在水中適當(dāng)增加鰱的數(shù)量，降低鳙的數(shù)量，實驗顯示當(dāng)鰱鳙數(shù)量呈現(xiàn)不同比例時，水體的富營養(yǎng)程度不同，通過減少浮游植物，增加浮游動物，可以非常有效地控制水體水質(zhì)進一步惡化[5]。

因此，如何進行微生物防治成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的首要問題。微生物法是指利用不同微生物的特性，在飼料中投放、水體中培養(yǎng)或?qū)⒅付ňN用物理化學(xué)方式進行聯(lián)合處理后再投入使用，達到以菌治菌的效果，維持水體水質(zhì)穩(wěn)定。越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)并推薦通過培養(yǎng)水體微生物以及使用微生物菌劑來更安全有效地平衡水質(zhì)，起到降低水質(zhì)污染、提高水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的作用。

3 益生菌類飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

益生菌泛指可以在生物體內(nèi)保持活性的有益微生物，包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等等，其作用原理是許多益生菌可以有效調(diào)節(jié)免疫細胞產(chǎn)生細胞因子，如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）。諸多實驗證明其對于不同種類的養(yǎng)殖對象均有著提高存活率以及擴大產(chǎn)量的作用。例如在馬來西亞對蝦養(yǎng)殖研究中，Aditya 等[6]證明通過添加南美白乳桿菌，同期的對蝦產(chǎn)量在多個季度穩(wěn)定增長；在尼羅羅非魚飼料中添加Rummeliibacillus stabekisii（魯梅利桿菌），Tan 等[7]進行了8 周的對比實驗，數(shù)據(jù)顯示喂食Rummeliibacillus stabekisii 的羅非魚無論是增重量、飼料轉(zhuǎn)化率、飼料效率，還是在用嗜水氣單胞菌和伊氏鏈球菌攻擊后的存活率上都大于對照組。通過在飼料中添加益生菌，可以減少養(yǎng)成階段的機會性細菌負荷并提高魚類的存活率[8]。針對單種生物益生菌，其主要作用菌種集中在一組乳酸菌中，作用原理為益生菌給藥基于宿主對活益生菌食品補充劑的消費，通過增強腸道微生物群內(nèi)的微生物平衡，為宿主提供健康益處[9]。

研究表明：益生菌作為混合或單一培養(yǎng)物的生物活性成分能夠發(fā)揮作用，增加了抗病性，可以大大減少病毒對魚類的傷害[10]。由于益生菌種的不同特性，對于不同的養(yǎng)殖對象可以通過利用不同菌種配比以達到最好的針對性效果[11]。綜上所述，益生菌類飼料添加劑作為抗生素添加劑的一種綠色無害化替代品，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面具有廣闊的發(fā)展前景。

4 微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

4.1 單種微藻培養(yǎng)法

目前，國外熱門的微生物法之一是在養(yǎng)殖池中適量培養(yǎng)微藻，利用其特性保持水體穩(wěn)態(tài)，修復(fù)水質(zhì)，從而起到提高水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的作用。以往，通過培養(yǎng)微藻的微生物修復(fù)法在水產(chǎn)養(yǎng)殖中一直是被低估的；但現(xiàn)在，添加微生物的培養(yǎng)法尤其是使用單個微藻物種的方法已經(jīng)被證實為一種有廣闊前景的生態(tài)修復(fù)法，能夠高效降解水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的有毒化合物[12]。

在關(guān)于微藻在白腿蝦養(yǎng)殖中的作用研究中，Huang 等[13]通過對照組實驗，每天分別測量實驗組和對照組的水溫、鹽度、pH 值、溶解氧、氨氮濃度、硝酸鹽濃度、亞硝酸鹽濃度、正磷酸鹽濃度、亞硫酸鹽濃度、弧菌濃度來監(jiān)測兩組水質(zhì)狀況，并對一定培養(yǎng)期后的白腿蝦質(zhì)量以及飼料轉(zhuǎn)化率等進行監(jiān)測。結(jié)果顯示：對于水質(zhì)狀況，對照組BSW（基底沉積物和水）（15.44 g/L）約是微藻添加處理實驗組（7.59 g/L 和7.14 g/L）的2 倍；對照組弧菌濃度增加較快，而微藻添加處理實驗組在培養(yǎng)期更趨于穩(wěn)定增加，在培養(yǎng)結(jié)束時，對照組和實驗組弧菌濃度分別為3 174 CFU/mL、811 CFU/mL 和603 CFU/mL，加入微藻的實驗組生產(chǎn)率為3.65±0.10 kg/m3，比對照組（2.92±0.07 kg/m3）高25%。得出結(jié)論：添加微藻可以很好地控制水體中各項數(shù)值穩(wěn)定，減少弧菌滋生和水底沉積物堆積，增加白腿蝦的產(chǎn)量。之后，Kurniawan 等[14]利用微藻去除污染物的功能對已經(jīng)受污染的水體環(huán)境進行了生物修復(fù)，驗證了其作用。

在利用微生物修復(fù)水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水過程中，包括小球藻、趾藻、蛾藻和納米綠藻在內(nèi)的微藻物種均被研究證實有著較強的性能[15]。其他研究中，將微藻引入培養(yǎng)水中證實了其可提高魚蝦的存活率和體重。例如，最近的一項研究表明，微藻物種Nannochloropsis oculata 和Thalassiosira pseudonana有利于水質(zhì)修復(fù)和蝦的發(fā)育。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，在整個農(nóng)場周期中，將Thalassiosira pseudonana 添加到培養(yǎng)水中可顯著降低氨、懸浮顆粒、正磷酸鹽、亞硝酸鹽和硝酸鹽的水平[13]。

此外，微藻可以提高日光下的溶解氧水平并調(diào)節(jié)pH 值。這對于修復(fù)水質(zhì)、保持水質(zhì)狀況平衡有卓越的作用。Mohd 等[16]進一步評估了添加微藻、小球藻UMT LF2 對改善南美白乳桿菌的養(yǎng)殖環(huán)境、育苗性能以及對白腿蝦生物修復(fù)功能和生長性能的影響。采用響應(yīng)面法（RSM）進一步研究確定了利用絲狀真菌黑曲霉生物絮凝物收獲過量微藻生物質(zhì)的最佳條件。但微藻的大面積培養(yǎng)仍處于試驗?zāi)Ｐ碗A段，且不同的微藻針對不同的養(yǎng)殖對象存在特異性效果，大多數(shù)微藻的凈化水質(zhì)效果只存在于對氮磷的凈化，而對于更多的污染物如抗生素等則難以起到客觀作用，且對微藻進行培養(yǎng)與采收的相關(guān)產(chǎn)業(yè)仍不完善，故難以大面積推廣。但目前的研究已經(jīng)證實了其有效性，因此做出如下展望：篩選優(yōu)質(zhì)藻種、尋找微藻去除污染物的關(guān)鍵分子機制、開發(fā)微藻處理工藝。解決了以上問題，才能構(gòu)建綠色環(huán)保的微藻培養(yǎng)去污體系。

4.2 微藻固定化以及菌-藻共生體

微藻固定化一般使用海藻酸鈉進行包埋，用氯化鈣和殼聚糖進行固定，運用固定化技術(shù)對微藻進行固化形成絮凝膠，從而避免藻類分散影響吸附效率，同時，為了保證其短時間內(nèi)的去污效率，可對其進行饑餓處理，提高去污效果[17]，相較于單一微藻培養(yǎng)效率更高。同一條件下分別使用固定化小球藻與懸浮態(tài)小球藻對相同的人工污染進行凈化，相同時間內(nèi)固定化小球藻可去除污水中99.99%的氨氮和95.71%的總磷，高于懸浮態(tài)小球藻（去除98.92%的氨氮和91.56%的總磷）[18]。因此，對于小面積水質(zhì)凈化選擇固定化微藻技術(shù)效率更高，但對于大面積水體凈化，其成本過高，不利于大面積投放。

與此同時，為了進一步提升微藻凈化效率，可以選用小球藻等微藻分別構(gòu)建菌-藻共生系統(tǒng)，原理是選用養(yǎng)殖用水去污能力強的微藻品種以及菌種，通過物理或化學(xué)法進行固定化[19]，一方面彌補了微藻處理無法很好地分解污染物的劣勢，另一方面可以用微藻對微生物分解產(chǎn)生的有機酸、無機鹽等[20-21]進行吸收，避免二次污染[22-23]。尤其是可以選取特定菌藻品種進行固定化處理，以達到互利共生、強化去除污染效率的效果[24]。使用菌-藻共生體可以表現(xiàn)出比純藻更高的生物廢物吸附量，并且對于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的氮磷有著更高的去除率[25]。Praveen等[26]建立小球藻與異養(yǎng)細菌的共生處理體系，并利用海藻酸鈉對其進行包埋固定，對比單一小球藻固定，發(fā)現(xiàn)在曝氣條件下，其對葡萄糖的去除效率從未曝氣時的50%（耗時12 h）提高到了100%（耗時6 h），葉綠素含量增加了30%。同時，在微藻-真菌共生系統(tǒng)中，真菌能有效地輔助微藻進行生物絮凝，并通過胞外多糖黏附、靜電中和作用，使得微藻與真菌菌絲表面蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)成藻菌球，解決了單一微藻處理廢水過程中微藻無法回收和分離的問題[27]。最新研究表明：在菌-藻共生體系中加入適當(dāng)濃度的獨腳金內(nèi)酯（GR24），通過促進微藻的光合作用效率以及真菌菌絲的生長，來提高培養(yǎng)效率并顯著增強吸附污水中氮磷的效果[28]。固定化菌-藻共生體在污水凈化處理中展現(xiàn)了強大的優(yōu)越性，但關(guān)于如何保證長期使用后載體材料不被細菌腐蝕分解、后續(xù)處理如何回收菌藻球、如何依據(jù)藻類豐富的營養(yǎng)成分實現(xiàn)資源的再回收利用、如何構(gòu)建更好的菌-藻共生體系等問題，相信在我國“雙碳”綠色背景下終將被一一解決，未來，固定化菌-藻共生體高效、綠色、環(huán)保地凈化養(yǎng)殖用水的愿景終將實現(xiàn)。

5 生物絮凝體技術(shù)（BFT）

近年來，生物絮凝體技術(shù)也逐漸走進大眾視野，BFT 系統(tǒng)是水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的最新發(fā)展[29]。原理是：適當(dāng)?shù)腃/N 可提高水體中異養(yǎng)微生物的數(shù)量，通過人為調(diào)節(jié)C/N，將水體中含氮化合物轉(zhuǎn)化為可被攝食的生物絮凝體，既避免了水體中腐絮以及飼料的殘留，又生態(tài)友好地維持了水體水質(zhì)，不僅從源頭上避免了病原菌在水體中擴散，還對養(yǎng)殖對象有免疫促進作用，大大提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖微生物治理的效率[30]，并為養(yǎng)殖對象提供了一部分營養(yǎng)來源，提高了其產(chǎn)量以及存活率[31]。

如何通過調(diào)整C/N 來提高生物絮凝技術(shù)效果是目前研究的關(guān)鍵，在中華草龜養(yǎng)殖實驗中，通過設(shè)置10∶1（CN-10）、15∶1（CN-15）、20∶1（CN-20）的實驗組和對照組（CG）進行為期40 天的養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)在前期，生物絮團體積指數(shù)（FVI）隨C/N 的增加而增大，并在28 天后數(shù)值趨于穩(wěn)定。其中，C/N 大于10 的組對于氨氮和亞硝酸鹽的處置效果更為明顯，C/N 為15的實驗組對氨氮和亞硝酸鹽的去除率分別為76.7%和64.4%。同時，通過運用高通量測序?qū)Ω鲗嶒灲M中的水體菌群進行檢測，發(fā)現(xiàn)三個組中的優(yōu)勢菌種均為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門，但根據(jù)C/N不同，其優(yōu)勢菌種的占比各有差異。因此，張凱等[32]認為中華草龜養(yǎng)殖中，C/N 為15∶1 時是生物絮凝體形成的最佳比例。而鄧吉朋等[33]發(fā)現(xiàn)：保持水體C/N 為20∶1 時有利于斑節(jié)對蝦（Penaeusmonodon）池生物絮團的形成；Yu 等[34]發(fā)現(xiàn)當(dāng)C/N 為20∶1 時形成的生物絮團能最有效凈化水質(zhì)，促進黃金鯽（Carassiusauratus）生長，增強消化酶活力。很多學(xué)者認為在BFT 中，當(dāng)C/N 在15～20 時，就會有一部分細菌轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓪钡辙D(zhuǎn)化為菌體蛋白的同化細菌，進行同化反應(yīng)[35]，可抑制硝化反應(yīng)進程，避免NO3--N 的積累。然而，也有許多研究發(fā)現(xiàn)，即使添加PHB 使C/N 達到20，也無法阻止NO3--N 的積累，可能是因為水體中的有機碳主要由腐殖酸、黃腐酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)和羧酸等組成[36]，無法保證每個實驗研究的C/N 就是每個養(yǎng)殖對象的最優(yōu)選擇，未來仍需要探索最佳C/N 的構(gòu)成。

BFT 系統(tǒng)中的主要成分——生物絮凝體（BFO）在BFT中發(fā)揮了三個主要作用：

1）通過自主消耗含氮化合物廢料來維持水質(zhì)；

2）為栽培物種提供食物來源，減少商業(yè)飼料用量[37-38]；

3）通過病原體競爭并產(chǎn)生益生菌特性[39]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中，BFO 的存在，特別是纖毛蟲和線蟲等，可以使養(yǎng)殖物種有效地獲得蛋白質(zhì)、維生素、脂質(zhì)等，從而促進生長[40]。同時，可以通過鑒定BFO中各物種的含量，調(diào)整BFT 的作用，達到減少環(huán)境足跡、提高水產(chǎn)產(chǎn)量的目的[41]。

BFT 系統(tǒng)建立環(huán)境主要考慮五個方面：混合強度、好氧環(huán)境、碳源投放、溫度、pH 值。它們決定了生物絮凝體能否形成、緊湊程度、絮凝效果[42]。因此，要正確理解物種的類型、多樣性、豐富度，以及它們在生態(tài)系統(tǒng)中的作用（浮游植物作為初級生產(chǎn)者，細菌作為分解者等等），充分考慮環(huán)境因素、人為因素等是BFT中適當(dāng)系統(tǒng)管理的關(guān)鍵[43]。

但由于目前關(guān)于BFT 技術(shù)均只存在理論研究，實際應(yīng)用中仍有諸多問題，硝化細菌在BFT 系統(tǒng)中的緩慢建立也是該技術(shù)的缺點，要形成穩(wěn)定的生物絮凝體并使其穩(wěn)定生長也需要一個月時間，在此期間，很難預(yù)防對于敏感的養(yǎng)殖對象的干擾。生物絮凝機理也尚未有定論，如何優(yōu)化BFT 的培養(yǎng)條件，如何降低成本，如何大面積普及等問題尚待解決，因此，未來發(fā)展BFT 技術(shù)仍有無限的可能性。

6 問題與展望

國內(nèi)外在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的微生物法應(yīng)用已經(jīng)存在諸多方案，但缺乏一種效果好、研究成熟、普遍性高、價格低廉、利于推廣的方案。

益生菌飼料添加劑技術(shù)憑借價格低廉、可大面積推廣、存在普遍性增產(chǎn)的效果等優(yōu)勢，成為目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)應(yīng)用最廣泛的微生物技術(shù)，但目前仍存在著益生菌的作用機理研究不充分、生產(chǎn)機構(gòu)質(zhì)量不高、復(fù)合型益生菌配比不科學(xué)等問題。未來，應(yīng)該運用高通量測序和單細胞分析等技術(shù)對益生菌作用機理進行進一步研究，同時，通過基因組重排等技術(shù)對益生菌效果進行改良和大面積推廣實驗，尋找最優(yōu)復(fù)合益生菌配比。

微藻固定化包括菌藻聯(lián)合體固定化，目前已經(jīng)取得了一定研究成果，尤其是對于水體中不同污染物的降解作用機理以及菌藻的共生互利性研究，其已經(jīng)被證明是一種高效的凈水技術(shù)方案。目前遇到的問題是難以尋找一種可持續(xù)、耐腐蝕的包埋材料，以及難以循環(huán)利用過程末端微藻的營養(yǎng)價值。未來的研究可以朝如何利用生物質(zhì)材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)包埋材料、增加上游企業(yè)建設(shè)幫助收集利用末端的微藻以達到資源再利用的效果等方面發(fā)展。

微藻培養(yǎng)以及BFT 技術(shù)相較于益生菌飼料添加劑和微藻固定化技術(shù)仍不成熟，存在著理論、應(yīng)用、推廣、經(jīng)濟效益等多方面的問題，但目前已有研究已經(jīng)充分證實其在凈化水質(zhì)、防治致病毒害、減少飼料用量、提高養(yǎng)殖對象產(chǎn)量等方面的優(yōu)越性。未來如果完善這兩種技術(shù)的研究，其能夠在我國“雙碳”背景下作出巨大貢獻。