葛祥武

（大連市檢驗檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116037）

人參（Ginseng）作為一種珍貴的中草藥，不僅能夠提高人體免疫能力，而且對神經(jīng)類疾病、糖尿病、心血管類疾病等有良好的治療和預(yù)防效果[1-2]。隨著人們生活水平的提高，人參開始作為保健品食用，市場需求量大增，人參種植農(nóng)戶也越來越多[3]。人參作為多年生植物，易遭受病蟲害，為保產(chǎn)量和質(zhì)量，農(nóng)藥使用必不可少。人參每年春季出苗展葉期易染銹病，1 ～3 年生人參發(fā)病較重，防治不當(dāng)可能導(dǎo)致表皮產(chǎn)生裂紋，須根枯死，莖葉萎蔫，參根隨之腐爛，造成嚴(yán)重?fù)p失。為防治銹病，常在每年春季出苗展葉期施用三唑類農(nóng)藥[4]。三唑類殺菌劑是指含有1,2,4-三唑環(huán)的化合物，因其具有穩(wěn)定性高、半衰期長、不易生物降解、易在環(huán)境中擴(kuò)散等特點，所以在各種環(huán)境介質(zhì)中被廣泛檢出[5-6]。長期濫用農(nóng)藥不僅會導(dǎo)致農(nóng)藥在土壤、水中蓄積，也會影響人們的身體健康。因此，開發(fā)靈敏、高效的農(nóng)藥多組分殘留分析方法，用以檢測人參及其種植土壤中這些化合物的實際殘留水平，不僅能夠有效監(jiān)控環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，指導(dǎo)合理用藥，而且可以進(jìn)一步保障種植產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

目前尚未見同時檢測人參及其種植土壤中三唑類殺菌劑殘留的報道，本研究選取在人參種植中經(jīng)常使用且檢出率較高的4 種三唑類殺菌劑（苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、氟環(huán)唑、戊唑醇）[7-9]為目標(biāo)化合物，探討并建立同時檢測人參及其種植土壤中此類殺菌劑殘留的方法。QuEChERS 前處理方法于2003 年首次被提出，與傳統(tǒng)的固相萃取柱凈化法相比，具有提取速度快、溶劑用量少、樣品制備簡便等眾多優(yōu)點，在農(nóng)藥殘留分析檢測中得到越來越廣泛的應(yīng)用[10-12]。檢測三唑類農(nóng)藥殘留采用QuEChERS 處理樣品，凈化效果好，速度快[13-14]。本文采用QuEChERS 前處理方法結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能夠快速準(zhǔn)確地分析人參及其種植土壤中三唑類殺菌劑殘留，前處理操作簡單、快速、成本低，適合大批量樣品的快速定性及定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC XEVO TQ-S 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），美國Waters 公司；NU-C200R-E 型高速冷凍離心機(jī)，美國NuAire公司；MMS-5020型振蕩器，日本Eyela 公司；分析天平，奧豪斯儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特。

苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、氟環(huán)唑和戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（Optima LC/MS），美國Thermo Fisher 公司；QuEChERS 提取包（1 g 氯化鈉、4 g 硫酸鎂、0.5 g 檸檬酸氫二鈉、1 g 檸檬酸鈉），QuEChERS 分散凈化包，美國Agilent 公司。

1.2 樣品來源及處理

30 批樣品采集自遼寧省撫順市新賓縣、本溪市桓仁縣和丹東市寬甸縣，每個基地隨機(jī)選取同時種植的3 年生人參5 株，對應(yīng)植株下土壤樣品5 份（每份500 g）。15 批鮮人參和15 批土壤，編號分別為G1 ～G15 和S1 ～S15。人參新鮮樣品收集后，用軟毛刷刷洗干凈，切片，于40 ℃烘箱中烘干72 h，后經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過2 號篩，裝袋密封；土壤樣品風(fēng)干，過1 mm 篩，樣品于4 ℃保存，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液制備

分別精確稱取5 g 人參及土壤樣品，放置于50 mL 離心管中，先加入10 mL 水，渦旋混勻后靜置10 min，再加入乙腈10 mL、QuEChERS 提取包及1 顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min，4 200 r·min-1離心5 min。吸取6 mL 上清液于15 mL離心管中（預(yù)先裝有分散凈化包及1 顆陶瓷均質(zhì)子），劇烈振蕩1 min，4 200 r·min-1離心5 min。取1 mL上清液過0.22 μm 微孔濾膜，用于LC-MS/MS 測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。將質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的4 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。使用前再分別移取4 種質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備液100 μL于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃保存。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。準(zhǔn)確移取適量1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.005 mg·L-1、0.010 mg·L-1、0.020 mg·L-1、0.050 mg·L-1、0.100 mg·L-1和0.500 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（3）基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取不含4 種供試農(nóng)藥的空白人參和土壤樣品，按照“1.3.1”項方法進(jìn)行空白基質(zhì)溶液的制備，進(jìn)一步配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過0.22 μm 微孔濾膜。

1.4 檢測條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）； 柱 溫：30 ℃； 流 動 相：A 為0.1% 甲酸水溶液，B 為0.1% 甲酸乙腈；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫程序：0 ～1.5 min，90% A；1.5 ～5.0 min，90%→50% A；5.0 ～7.0 min，50%→30% A；7.0 ～8.0 min，30%→10% A；8.0 ～10.0 min，10% A；10.1 ～12.0，90% A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓：3 kV；去溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；錐孔氣流：150 L·h-1。4 種目標(biāo)分析物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1，TIC 圖見圖1。

圖1 4 種農(nóng)藥的TIC 圖

表1 4 種農(nóng)藥的質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

本文分別考察了丙酮、甲醇、乙腈對目標(biāo)物提取效率的影響。如表2 所示，乙腈對人參及土壤中的目標(biāo)化合物的提取效果相對較好，共提物雜質(zhì)較少，回收率均接近100%，因此最終選取乙腈作為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對4 種農(nóng)藥回收率的影響

2.2 凈化材料的選擇

采 用A（1 200 mg MgSO4+400 mg PSA）、B（1 200 mg MgSO4+400 mg PSA+400 mg C18）、C（885 mg MgSO4+150 mg PSA+15 mg GCB）、D（885 mg MgSO4+150 mg PSA+45 mg GCB）4 種不同組成的QuEChERS 分散凈化包進(jìn)行凈化，通過回收率比較這4 種凈化材料的凈化效果。如圖2 所示，4種凈化包對于目標(biāo)化合物的回收率均在70%以上，但使用凈化包C 和D 的目標(biāo)物回收率偏低，可能是因為這兩種凈化包中含有一定含量的GCB，GCB 可以有效凈化色素類雜質(zhì)，但也對一些平面結(jié)構(gòu)的目標(biāo)物造成了嚴(yán)重吸附，如苯醚甲環(huán)唑。使用凈化包A和B 后，人參及土壤樣品中4 種農(nóng)藥都有較好的回收，使用凈化材料A 得到的回收率更接近100%，因此本方法選用分散凈化包A 作為最終凈化材料。

圖2 不同凈化材料對人參和土壤回收率的影響

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 空白試驗

除不加樣品外，按“1.3.1”項供試品溶液制備方法制得空白溶液，經(jīng)分析，實驗過程和方法對4 種農(nóng)藥的分析檢測均無干擾。

2.3.2 線性范圍和定量下限

在優(yōu)化條件下測定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以農(nóng)藥質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，得相關(guān)系數(shù)r2均≥0.991 5，見表3。通過在空白基質(zhì)中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實驗的方式，以滿足方法學(xué)要求的最低添加回收水平為定量下限（Lower Limits of Quantification，LLOQ）[15]。4 種 農(nóng) 藥 的LLOQ 為0.01 mg·kg-1，在該水平下的平均回收率為90.5%～103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）均低于7.9%，表明該定量下限滿足方法學(xué)驗證要求。

表3 人參和土壤中4 種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)及基質(zhì)效應(yīng)

2.3.3 回收率和精密度

按“1.3.1”項試驗方法對人參及種植土壤樣品分別進(jìn)行低、中、高3 個水平的添加，回收率和精密度測定結(jié)果見表4。在3 個添加水平下，4 種農(nóng)藥的回收率在90.1%～104.1%，RSD 在3.2%～8.6%（n=6），說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

表4 人參和土壤中4 種農(nóng)藥的回收率、RSD 測定結(jié)果

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%，基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果為負(fù)數(shù)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)，結(jié)果為正數(shù)表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果在-20%～20%為弱基質(zhì)效應(yīng)；在-50%～-20%和20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；超過-50%或50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。計算得出基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3，4 種農(nóng)藥均存在弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，為更準(zhǔn)確地定量，仍使用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行計算。

2.4 實際樣品測定

應(yīng)用本研究優(yōu)化后的方法，對30 批樣品中4種三唑類殺菌劑進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。農(nóng)藥殘留總檢出率為83.3%，人參樣品中農(nóng)藥殘留檢出率為80.0%，土壤樣品中農(nóng)藥殘留檢出率為86.7%。在30批次樣本中，5（16.7%）批次樣本僅檢出1 種三唑類殺菌劑，20（66.7%）批次樣本檢出2 ～4 種三唑類殺菌劑。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763——2021）[16]中的規(guī)定，在15批次人參樣本檢測中，苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇無超標(biāo)情況，5 批人參丙環(huán)唑殘留量超標(biāo)，其安全性不容忽視。同時測定發(fā)現(xiàn)土壤中農(nóng)藥殘留量高于人參中農(nóng)藥殘留量，且殘留量較高，檢出值多在0.016 ～0.250 mg·kg-1，說明三唑類殺菌劑在土壤中不容易分解，長期使用會在土壤中累積，存在安全隱患。

表5 30 批樣品測定結(jié)果 單位：mg·kg-1

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS 技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定藥食兩用中藥材人參及其種植土壤中三唑類農(nóng)藥殘留的分析方法，該方法具有良好的專一性、廣泛的線性，操作簡單、靈敏度高，為多種類樣品的質(zhì)量監(jiān)控提供方法參考，解決了傳統(tǒng)單一檢測種植產(chǎn)品農(nóng)藥殘留而生長環(huán)境監(jiān)控滯后的問題。人參及種植土壤中三唑類檢出率較高，農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全問題已經(jīng)顯現(xiàn)，推進(jìn)植物源性食品、中藥種植綠色防控技術(shù)迫在眉睫。