周新星，張玲玲*，周曉瑩，施莎敏，任亦洋，賈福懷

（1.寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江寧波 315012；2.寧波御益生物科技有限公司，浙江寧波 315012）

近些年，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到B 族維生素是人體不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)素，市場(chǎng)上也出現(xiàn)越來越多的多種維生素片、復(fù)合維生素片以及維生素類功能飲料等保健食品。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定B 族維生素含量的方法大多數(shù)前處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)且成本高[1-4]。因此，研究出能同時(shí)快速準(zhǔn)確分析保健食品中煙酰胺、維生素B1、維生素B6、維生素B2且前處理簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集市場(chǎng)上暢銷的3 種含多種B 族維生素的保健食品，作為實(shí)驗(yàn)1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)樣品。

煙 酰 胺（ 批 號(hào) 為100115-202005， 純 度 為99.9%）、維生素B1（批號(hào)為100390-202107，純度為97.4%）、維生素B6（批號(hào)為100116-201906，純度為99.9%）和維生素B2（批號(hào)為100369-201905，純度為98.2%），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院出品；乙腈（HPLC）、鹽酸（GR），國(guó)藥集團(tuán)；三氟乙酸（HPLC），阿拉丁；超純水，由Arium Comfort I 純水超純水一體機(jī)制得，其電阻率不大于18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200 高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫公司；METTLER TOLEDO XS205DU 電子天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；KH-250DB 數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Arium Comfort I 純水超純水一體機(jī)，賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于適宜容量瓶中，加入鹽酸溶液（1+1）2 mL 并超聲溶解，然后用水定容搖勻，配成100 μg·mL-1的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別精密稱取20 mg 煙酰胺、維生素B1及維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品于適宜容量瓶中，加0.01 mol·L-1鹽酸溶解并定容搖勻，配成濃度為400 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密移取每種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用0.1%三氟乙酸稀釋定容，從而得到煙酰胺濃度100 μg·mL-1、維生素B1濃度50 μg·mL-1、維生素B6濃度50 μg·mL-1、維生素B2濃度50 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品處理

精密量取混合均勻的液體樣品1 mL 或精密稱取研磨混勻的固體樣品0.1 g 于適宜的容量瓶中，加適量的0.1%三氟乙酸溶液，超聲提取5 min，待樣液冷卻后定容搖勻，用0.45 μm 濾膜過濾，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱：Agilent SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動(dòng)相：A 為0.1%三氟乙酸溶液，B 為乙腈，梯度洗脫見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

根據(jù)維生素B1、維生素B6、煙酰胺、維生素B2的理化性質(zhì)[5]，對(duì)不同提取方法和提取溶劑進(jìn)行研究，選擇出最佳提取條件。

2.1.1 提取方法

以1 號(hào)樣品為試樣，考察了在室溫下用0.1%三氟乙酸溶液超聲提取5 min、手搖振蕩提取5 min 和搖勻靜置提取5 min 3 種不同提取方法對(duì)4 種B 族維生素提取效果的影響。結(jié)果顯示，對(duì)于維生素B2，超聲提取的提取率明顯高于其他兩種方法；對(duì)于其他3 種B 族維生素，3 種提取方法的提取率比較接近。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用超聲提取。

2.1.2 提取溶劑

以1 號(hào)樣品為試樣，考察了純水、鹽酸、0.1%三氟乙酸溶液的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純水對(duì)維生素B6的提取效果明顯比其他兩種溶劑差；鹽酸對(duì)煙酰胺的提取效果明顯比其他兩種溶劑差；對(duì)于其他兩種B 族維生素，0.1%三氟乙酸溶液的提取效果與其他兩種溶劑相近。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)中都選用0.1%三氟乙酸溶液作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

本次實(shí)驗(yàn)選擇三氟乙酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，提高分離效果，避免離子對(duì)試劑損害色譜柱的同時(shí)也大大降低了檢測(cè)成本。

2.2.2 色譜柱的選擇

通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比了兩款性能較優(yōu)的C8柱與C18柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過梯度洗脫程序優(yōu)化后C8柱未能將維生素B1和維生素B6分離開，而且維生素B2出峰位置處有梯度引起的基線波動(dòng)，會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，而C18柱的分離效果良好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用C18柱。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也比較了25 ℃、35 ℃及40 ℃柱溫下4 種維生素色譜峰的分離效果，結(jié)果表明柱溫改變對(duì)分離效果幾乎無影響，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用25 ℃柱溫。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

各種維生素最大紫外吸收波長(zhǎng)都不相同，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)4 種維生素在波長(zhǎng)200 ～450 nm 進(jìn)行紫外圖譜掃描。在兼顧每種B 族維生素最大紫外吸收波長(zhǎng)和靈敏度的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)采用紫外280 nm 檢測(cè)，4 種B 族維生素的分離效果良好。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取適量1.3.1 項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和1.3.2 項(xiàng)下的試樣溶液，根據(jù)1.3.3 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣品色譜圖中B 族維生素的理論塔板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，均達(dá)到基線分離，因此本方法能進(jìn)行定性定量分析。

2.3.2 線性關(guān)系及檢出限實(shí)驗(yàn)

取1.3.1 項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1%三氟乙酸水溶液稀釋制備成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)1.3.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到4 種維生素的回歸方程。煙酰胺為y=3.273 4x+0.555 8，r=0.999 8；維 生 素B1為y=16.145x-4.039 7，r=0.999 8；維 生素B6為y=33.789x+0.32，r=0.999 9；維 生 素B2為y=58.074x-5.227，r=1.000 0。用3 倍信噪比（S/N=3）確定檢出限，煙酰胺的檢出限為0.3 μg·mL-1，其他維生素均為0.2 μg·mL-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，煙酰胺在5 ～50 μg·mL-1呈直線回歸，其他維生 素在2.5 ～25 μg·mL-1呈直線回歸，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，檢出限低，所以本方法能進(jìn)行定量分析。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

（1）重復(fù)性。準(zhǔn)確稱取6 份實(shí)驗(yàn)1 號(hào)樣品，根據(jù)1.3.2 項(xiàng)的方法進(jìn)行供試液的配制，并根據(jù)1.3.3 項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得各B 族維生素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.41%～1.79%，表明該方法精密度高。

（2）重現(xiàn)性。不同實(shí)驗(yàn)員（n=3）用本方法對(duì)實(shí)驗(yàn)1號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)樣品進(jìn)行獨(dú)立測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.11%～1.96%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6 份實(shí)驗(yàn)1 號(hào)樣品，每2 份為1 組，共3 組，再分別加入低（樣品濃度80%）、中（樣品濃度100%）、高（樣品濃度120%）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)1.3.2 項(xiàng)的方法進(jìn)行供試液的配制，并根據(jù)1.3.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得到回收率（表2）。測(cè)得各B 族維生素平均回收率在98.1%～99.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.29%～2.06%，由此可見該方法回收率好。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

用本方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)樣品進(jìn)行測(cè)定，并比較檢測(cè)結(jié)果（表3）。本方法和國(guó)標(biāo)方法測(cè)定結(jié)果偏差較小，均在允許范圍內(nèi)，因此本方法可用于保健食品中B 族維生素的檢測(cè)。

表3 方法對(duì)比結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測(cè)定保健食品中B 族維生素的方法，經(jīng)過色譜條件的優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了煙酰胺、維生素B1、維生素B6、維生素B2的基線分離。本方法操作流程簡(jiǎn)便，前期處理工作量少，實(shí)用性較高，能在25 min 內(nèi)完成上述4 種維生素的同時(shí)檢測(cè)，能為保健食品中B族維生素的同時(shí)分析提供實(shí)際幫助。