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鴿乳中產(chǎn)角蛋白酶菌株分離鑒定及酶學(xué)特征研究

2023-11-10 12:45:02王留兄鄭明德梅茹李璐璐季海波龔道清謝鵬
畜牧與獸醫(yī) 2023年11期
關(guān)鍵詞:豬皮芽胞角蛋白

王留兄,鄭明德,梅茹,李璐璐,季海波,龔道清*,謝鵬*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225125;2. 淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 淮安 223001;3. 淮安正昌飼料有限公司,江蘇 淮安 223001)

鴿屬晚成鳥類,剛出殼的幼鴿不具備覓食能力,只能依賴親鴿嗉囊形成的鴿乳來維持生長發(fā)育[1]。在催乳素和局部因子的作用下,親鴿嗉囊上皮細(xì)胞快速增殖并積累營養(yǎng)物質(zhì),最終從組織脫落形成鴿乳[2-5]。鴿乳營養(yǎng)成分十分復(fù)雜,包括蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)、免疫球蛋白以及促生長因子等[6-9]。Shao等[10]對早期鴿乳進(jìn)行蛋白組學(xué)分析,總共鑒定出2 558個蛋白,其中包括核糖體蛋白、角蛋白、過氧化氫酶、膜聯(lián)蛋白、熱休克蛋白和真核翻譯蛋白等,歸一化光譜豐度因素(NSAFs)法計算結(jié)果表明角蛋白約占鴿乳蛋白總量的3.52%。據(jù)報道,鴿乳中角蛋白種類繁多,其中角蛋白4(K4)的含量最高且角蛋白相關(guān)基因表達(dá)在不同時期呈現(xiàn)出動態(tài)變化[11]。此外,研究表明,鴿乳中含有多種微生物,包括:乳酸菌、鏈球菌和大腸桿菌等[12]。朱建國等[13]也從鴿乳中分離出了產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶微生物。由于早期動物消化道形態(tài)及功能尚未發(fā)育完全,宿主的消化功能可通過產(chǎn)酶微生物來改善[14]。因此,我們推測鴿乳中可能存在相關(guān)的產(chǎn)角蛋白酶微生物以輔助幼鴿消化鴿乳中的角蛋白。

角蛋白酶在動物飼料、生物肥料、洗滌工業(yè)、皮革和紡織工業(yè)等方面有著廣泛的應(yīng)用[15]。例如,在含有羽毛粉的動物飼料中添加角蛋白酶,能夠有效提高飼料中的組氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的生物利用率[16]。用產(chǎn)角蛋白酶菌株處理雞毛,發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生甲烷氣體,在厭氧條件下將羽毛水解物與稀釋的豬糞進(jìn)一步消化,此時產(chǎn)生的甲烷氣體比單獨(dú)用豬糞發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體更多,這對于保護(hù)環(huán)境、解決能源短缺具有重要意義[17]。產(chǎn)角蛋白酶菌株來源多,馬驍驍[18]從不同地區(qū)的羊圈或豬圈土壤樣品中篩選出對牛毛角蛋白具有較強(qiáng)降解作用的野生菌,根據(jù)基因序列分析和形態(tài)學(xué)觀察判定其為枯草芽胞桿菌。范佳鈺等[19]從5個不同省份的雞圈、羊圈和牛圈的土壤中篩選出1株腸桿菌,其能夠高效降解羊毛角蛋白。目前大多研究集中于對毛發(fā)角蛋白的降解,并評估其產(chǎn)酶能力,而對于分解皮革角蛋白微生物的分離鑒定以及其產(chǎn)酶能力的研究甚少。本試驗(yàn)將采集哺育期的鴿乳樣品,旨在通過富集培養(yǎng)、初篩、復(fù)篩以及發(fā)酵培養(yǎng),以期篩選出鴿乳中產(chǎn)角蛋白酶微生物并對其產(chǎn)物進(jìn)行初步酶學(xué)特征研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

鴿乳采于徐州鯤鵬肉鴿養(yǎng)殖場,豬皮、羊皮以及雞皮購于淮安市某菜市場。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:取1 g葡萄糖,0.3 g牛肉膏,1 g蛋白胨以及0.5 g NaCl溶于100 mL純水中,pH自然。

篩選培養(yǎng)基:取3.5 g豬皮粉,7 g葡萄糖,7 g瓊脂,0.175 g K2HPO4,0.035 g MgSO4,0.175 g NaCl以及0.42 g KH2PO4溶于350 mL純水中,pH自然。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:取2 g葡萄糖,0.05 g NaCl,0.042 g MgSO4·7H2O,0.07 g KH2PO4和0.209 g K2HPO4·3H2O,溶于100 mL純水中,pH自然。

LB固體培養(yǎng)基:取2 g胰蛋白胨,1 g酵母提取物,2 g NaCl和3 g瓊脂粉,溶于200 mL純水中,pH自然。

種子培養(yǎng)基:取1 g蛋白胨,0.5 g NaCl和0.5 g牛肉膏溶于100 mL純水中,pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:取0.5 g豬皮粉,0.3 g NaCl,0.03 g CaCl2,0.03 g MgSO4,0.07 g K2HPO4,0.02 g KH2PO4以及0.3 g可溶性淀粉,溶于60 mL純水中,pH自然。

保藏培養(yǎng)基:取0.3 g牛肉膏,1 g蛋白胨和1.5 g瓊脂溶于100 mL純水中,pH自然。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃條件下高壓滅菌30 min。

1.2 樣品采集與處理

選擇3日齡健康乳鴿,用手術(shù)刀在消毒后的乳鴿嗉囊上小心地切開采集鴿乳,將傷口消毒后立即用雙縫線縫合上[20]。取鴿乳樣品5 g,加入盛有45 mL無菌生理鹽水的三角瓶中,于搖床中150 r/min振蕩1 h,使得鴿乳與生理鹽水均勻混合,振蕩結(jié)束后靜置15 min,上層液體備用待測。

取新鮮豬皮、羊皮和雞皮,去除皮下脂肪部分,用水洗凈后用剪刀剪成小塊狀,放入烘干箱于70 ℃烘干,利用索氏提取法反復(fù)去除油脂,部分用粉碎機(jī)將其磨成粉末,過60目篩密封保存,其余整塊保存。

1.3 產(chǎn)角蛋白酶微生物的初篩、復(fù)篩及發(fā)酵

利用篩選培養(yǎng)基對產(chǎn)角蛋白酶菌株進(jìn)行篩選,根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來判斷其是否為產(chǎn)角蛋白酶的菌種,透明圈的大小代表菌的產(chǎn)酶能力高低。吸取4 mL樣品制備液,無菌接種到含有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中,37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h,期間觀察微生物的富集程度,稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng),并觀察菌落的生長情況。

選取透明圈較為明顯的菌株進(jìn)行復(fù)篩,于篩選培養(yǎng)基進(jìn)行劃線培養(yǎng)2~3次,挑選單菌落,一半接種于保藏培養(yǎng)基進(jìn)行斜面保種,另一半則于篩選培養(yǎng)基繼續(xù)劃線并使其傳代5次以上。挑取經(jīng)復(fù)篩分離的單菌落于揺瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,180 r/min,37 ℃震蕩培養(yǎng)48 h,測定產(chǎn)酶活性并進(jìn)行16S rDNA測序鑒定。

1.4 角蛋白酶活力的測定

酶活力測定參照Gradisar等[21]的方法并作調(diào)整。取2 mL Tris-HCl緩沖溶液,依次加入20 mg水解角蛋白底物和1 mL稀釋的粗酶液,于50 ℃恒溫水浴反應(yīng)50 min,每15 min振蕩1次,最后加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液4 ℃ 8 000 r/min離心15 min,取上清液于波長280 nm處測定吸光度。

對照試驗(yàn):在1 mL粗酶液中先加入2 mL 10%TCA溶液,再加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液。其余步驟同上。

一個酶活單位(1 U)定義為:在波長280 nm下,試驗(yàn)組比對照組每高出0.01吸光值便計為1 U。重復(fù)測量3次取平均值,計算公式如下所示:

角蛋白酶活力=5n×ΔA280/(0.01×50)。

樣品角蛋白酶活力單位為U·mL-1,ΔA280為試驗(yàn)組280 nm處的吸光度-對照組280 nm處的吸光度。n為粗酶液的稀釋倍數(shù),5為終反應(yīng)體積(mL),50為反應(yīng)時間(min)。

1.5 菌落分子鑒定

提取所篩菌株的基因組DNA并擴(kuò)增其16S rDNA,回收純化PCR產(chǎn)物并由南京金斯瑞公司測序,測序結(jié)果經(jīng)NCBI進(jìn)行BLAST比對得出所篩菌株的類型。采用引物為,27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.6 角蛋白酶酶學(xué)特征研究

1.6.1 制備種子液

將保存菌種取出解凍,各取100 μL菌液涂布LB固體培養(yǎng)基,30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h并進(jìn)行觀察,劃線傳代2次,分別挑取單菌落于100 mL種子培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min培養(yǎng)36 h,即制成種子液。

1.6.2 粗酶液制備

種子液2 mL,加入到60 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中去,于37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)48 h,將發(fā)酵液于4 ℃離心機(jī)中10 000 r/min離心10 min,取上清液,即為粗酶液。

1.6.3 豬皮降解率測定

將去脂去雜烘至恒重的豬皮稱重后加入含2 mL種子液的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng),分別在發(fā)酵0、24、48、51、53.5、54.5和55.5 h后過濾,將剩余的豬皮殘渣置于105 ℃的烘箱中烘至恒重,按照以下公式計算降解率。

降解率=(酶解前豬皮干重-酶解后豬皮干重)/酶解前豬皮干重×100%。

1.6.4 產(chǎn)角蛋白酶酶活測定

在發(fā)酵的第0、24、48、51、53.5、54.5和55.5小時分別取樣制備粗酶液,酶活測定方法參照1.4角蛋白酶活力測定步驟。

1.6.5 角蛋白酶底物特性研究

以不同來源的角蛋白(羊皮粉、豬皮粉和雞皮粉)作為底物,測定不同菌株所產(chǎn)角蛋白酶在不同底物處理下的酶活性(pH=8.8,反應(yīng)溫度50 ℃,反應(yīng)時間50 min),測定方法參照步驟1.4角蛋白酶活力的測定。

1.7 酶活數(shù)據(jù)分析

酶活數(shù)據(jù)結(jié)果取3個樣品重復(fù)的平均值。數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析,差異顯著性以P<0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)酶菌的菌落形態(tài)觀察

在篩選培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)有透明圈且生長良好的目標(biāo)菌落,通過復(fù)篩,最終挑選了3種菌落形態(tài)的目的菌株,分別編號為KPB-1、KPB-2、KPB-3。如圖1所示:KPB-1的菌落四周呈絨毛狀,菌落黃色;KPB-2單菌落形狀為圓形,呈淡黃色;KPB-3單菌落形狀為圓形,較小,呈淡黃色。

2.2 菌株產(chǎn)角蛋白酶酶活力

將篩選出的3個菌株(KPB-1、KPB-2、KPB-3)進(jìn)行角蛋白酶活力測定。結(jié)果如圖2所示,篩選出的3種菌株均具有較好的產(chǎn)酶能力,其中菌株KPB-1產(chǎn)角蛋白酶的活力最高。

圖2 3株菌產(chǎn)角蛋白酶的活性

2.3 菌株16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增16S rDNA,電泳結(jié)果如圖3所示,切膠回收并純化PCR產(chǎn)物。

M. Marker;1. KPB-1;2. KPB-2;3. KPB-3。

2.4 產(chǎn)酶菌株測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

測序所得3種菌株的16S rDNA序列(KPB-1為1 416 bp、KPB-2為1 397 bp、KPB-3為1 383 bp),在GenBank中作BLAST同源性檢索并利用MEGA 4.0軟件分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果如圖4所示:KPB-1和KPB-2為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis);KPB-3為大腸桿菌(Escherichiacoli)。

注:邊框?yàn)楸驹囼?yàn)分離株。

2.5 發(fā)酵過程中豬皮降解變化規(guī)律

由圖5可知,3種菌種對豬皮均有降解作用,隨著發(fā)酵時間增加,3種菌株對豬皮的降解率均呈上升趨勢。48 h后的降解率均達(dá)到60%以上,其中降解效果依次為枯草芽胞桿菌KPB-1、大腸桿菌KPB-3、枯草芽胞桿菌KPB-2。

圖5 3株菌對豬皮的降解率

2.6 發(fā)酵過程中3種菌株產(chǎn)角蛋白酶的酶活變化規(guī)律

由圖6可知,3種菌株的酶活都隨發(fā)酵時間的延長而增加。3種菌株7個不同時間點(diǎn)酶活大小為:枯草芽胞桿菌KPB-1>大腸桿菌KPB-3>枯草芽胞桿菌KPB-2。

圖6 不同時間點(diǎn)酶活變化曲線

2.7 不同底物對3種菌株產(chǎn)角蛋白酶活性的影響

由圖7可知,相較于豬皮粉和雞皮粉,KPB-1、KPB-2和KPB-3所產(chǎn)角蛋白酶在降解羊皮粉中表現(xiàn)出更高的酶活性(P<0.05)。

注:每組不同的字母之間表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

研究表明,微生物在動物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,不僅維持著宿主胃腸道屏障的完整性,其代謝產(chǎn)物還調(diào)節(jié)著機(jī)體的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝和免疫水平[22]。鴿乳是鴿嗉囊組織形成的富含營養(yǎng)成分的奶酪狀物質(zhì),是乳鴿早期階段唯一的營養(yǎng)來源[2,5]。剛出殼的幼鴿須由親鴿飼喂,其過程必然伴隨著親鴿消化道中的相關(guān)微生物的轉(zhuǎn)移[23]。由于剛出殼幼鴿腸道處于無菌狀態(tài),我們推測,鴿乳對于幼鴿腸道微生物種群的建立起著非常重要的作用[24-25]。本試驗(yàn)篩選出3種產(chǎn)角蛋白酶菌株,分別為枯草芽胞桿菌KPB-1、枯草芽胞桿菌KPB-2和大腸桿菌KPB-3。大腸桿菌根據(jù)其致病性可分為病原性和非病原性兩類[14]。作為條件性致病菌,大腸桿菌能夠引起鴿局部和全身性疾病[26],但確定本試驗(yàn)篩選出的大腸桿菌是否為條件致病菌,還有待進(jìn)一步研究??莶菅堪麠U菌種類繁多且能產(chǎn)生多種酶,例如,奶牛瘤胃源枯草芽胞桿菌BX1-12可產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶以及α-淀粉酶[27]。本試驗(yàn)所篩的枯草芽胞桿菌可產(chǎn)角蛋白酶,但其是否可產(chǎn)生其他酶類還需進(jìn)一步研究。

我國畜禽養(yǎng)殖量大,其屠宰后會產(chǎn)生大量的羽毛、皮革邊角料等廢棄物[28]。起初人們只是對這些廢棄物進(jìn)行簡單處理,造成了蛋白資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[29]。研究者們發(fā)現(xiàn)上述物質(zhì)的主要成分是角蛋白,若采用合適方法將會有很好的應(yīng)用潛力。目前所采取的角蛋白降解方法主要有物理和化學(xué)降解法,物理降解法包括高壓加熱水解法和擠壓膨化法,化學(xué)降解法包括酸水解法和堿水解法。物理降解法對參數(shù)設(shè)置要求較高,且實(shí)際操作中很難控制,而化學(xué)降解法不僅會造成環(huán)境污染,還會破壞角蛋白中的部分氨基酸,并在產(chǎn)品回收過程中產(chǎn)生大量的鹽分[30-31]。已有研究證實(shí),利用微生物法降解角蛋白不但具有環(huán)保、低成本等優(yōu)點(diǎn),而且只需通過常規(guī)優(yōu)化手段提高角蛋白酶活力,就能顯著提高降解效率,因此具有很大的應(yīng)用前景[32]。目前人們篩選出了多種能夠降解羽毛角蛋白的菌株,也探索了多種測定羽毛角蛋白酶活性的方法。胡介卿等[33]從鸕鶿腸道中分離出的枯草芽胞桿菌對羽毛角蛋白有強(qiáng)大分解能力;冀勇良等[21]確定了以羽毛粉為底物測定角蛋白酶活性的最佳方法。然而人們對于皮革角蛋白降解菌株的分離鑒定及其酶學(xué)特征研究少之甚少。

角蛋白按照二級結(jié)構(gòu)可分為α-角蛋白和β-角蛋白,根據(jù)其含硫量又可分為軟角蛋白和硬角蛋白。不同來源的角蛋白,其氨基酸組成和含量有所不同[34],這可能是造成同一菌株對不同底物呈現(xiàn)出不同酶活的主要原因。本試驗(yàn)所篩選出的3種菌株對豬皮均具有較好的降解作用,且48 h后的降解率均超過了60%,說明這3種菌株可能在降解皮革角蛋白方面具有較好的應(yīng)用前景。隨著發(fā)酵時間的延長,枯草芽胞桿菌KPB-1的酶活要顯著高于大腸桿菌KPB-3和枯草芽胞桿菌KPB-2。上述3種菌對羊皮、豬皮和雞皮的降解效果不一致,其中對羊皮的降解效果最好,由此推測羊皮角蛋白的構(gòu)成能夠更有效誘導(dǎo)上述3種菌株產(chǎn)角蛋白酶。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)分離鑒定出3種產(chǎn)角蛋白酶微生物,分別為1株大腸桿菌和2株枯草芽胞桿菌,3種菌株對動物皮革均有較好的降解作用。隨著發(fā)酵時間的延長,3種菌株所產(chǎn)角蛋白酶的酶活性均呈上升趨勢,且均在降解羊皮中表現(xiàn)出更高的酶活性。本研究為乳鴿營養(yǎng)物質(zhì)消化機(jī)理和產(chǎn)角蛋白酶微生物的研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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