袁浩芳，朱曉暉，張雨，李焱，李可偉，胡劍武，2，李家奎*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070；2. 西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳獸醫(yī)局，西藏 拉薩 850000)

牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是牛感染牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起的急性、接觸性傳染病，臨床又稱“紅鼻病”。IBRV在機體內(nèi)分布極為廣泛，可感染多種組織和器官，引起多種臨床表現(xiàn)，常表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、呼吸道黏膜損傷，也可導致生殖道損傷如母畜陰道炎、流產(chǎn)，公畜包皮龜頭炎等，偶見犢牛出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，肌肉震顫、共濟失調，病程嚴重者亦會死亡[1-3]。該病被世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)列為必須通報的動物疫病，在中國被列為二類動物疫病[4-5]。2014年對青海地區(qū)的牦牛血清流行病學調查顯示，牦牛感染IBRV的陽性率為44.64%[6]；2019年蘇中華等[7]檢測西藏地區(qū)牦牛的IBR血清抗原平均陽性率達10%?？梢娫摬≡陉笈Ｈ后w中流行廣泛，制約了牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

IBR會造成免疫抑制、潛伏感染、終生帶毒，從而導致病牛終生排毒，極難控制，難以實現(xiàn)群體凈化[8]。盡管該病在一些歐洲發(fā)達國家已經(jīng)完全被根除，但在我國，因為對該病沒有有效的治療方法，對牛鼻氣管炎的預防措施仍然主要依靠疫苗接種。因此，建立能夠早期特異性診斷IBR的方法將極大地提高疫苗接種的效率，對IBR的防控意義重大。IBRV基因組編碼70個左右的蛋白，包括11種糖蛋白，近年來血清學檢測方法的快速發(fā)展，針對血清中gB、gD、gE、gG、gL等糖蛋白特異性抗體的ELISA檢測方法已在實驗室得到了初步運用[9-14]。PCR方法是實驗室常用的檢測手段之一，徐娜等[15]基于gB和gE基因建立了普通雙重PCR方法，在傳統(tǒng)檢測單基因基礎上提高了準確率；曲光剛等[16]在2012年就基于gB基因建立了TaqMan探針熒光定量PCR方法，后續(xù)李東麗[17]、任強林[18]在此基礎上選擇gB保守區(qū)域設計引物，對該方法進行了改進。除此之外，王亞新等[19]基于gB基因設計引物建立了SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法；任亞初等[20]根據(jù)gD基因設計了相應的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，隨后王倩穎等[21]根據(jù)gD基因保守序列優(yōu)化了該方案。gE基因在IBRV基因組中高度保守，可作為PCR檢測時的靶點。唐泰山等[22]根據(jù)gE基因完整序列設計了TaqMan探針熒光定量PCR方法，SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法尚未有報道。目前常用的IBR基因缺失疫苗為gE缺失苗，因此建立針對IBRVgE基因的檢測方法，可篩選牛群中經(jīng)過基因缺失疫苗免疫和野毒感染的牛，為IBR感染牛只的淘汰及牛群IBR的凈化提供有效手段。

本研究基于gE基因的保守序列設計了MGB探針和特異性引物，構建了TaqMan-MGB和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，旨在建立快速準確的IBRV檢測方法，為牛傳染性鼻氣管炎的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒株和樣品來源

IBRV、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)、巴氏桿菌、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)等相關病毒及菌株均為本實驗室保存。130份牦牛鼻拭子樣品來自西藏。

1.2 主要試劑

AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2，AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix，2 × Phanta Max Master Mix (Dye Plus)，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，F(xiàn)astPure?Gel DNA Extraction Mini Kit，質粒小提試劑盒，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BM2000+ DNA Marker及GL DNA Marker 2000，分別購自北京博邁德基因技術有限公司及艾科瑞生物科技有限公司。

1.3 引物與探針的設計與合成

下載GenBank中IBRV的gE基因序列(GenBank：MK035760.1)，通過Primer 5.0軟件設計TaqMan熒光引物1對，F(xiàn)1：5′-GCCGTACCACTCCCACGTA-3′，R1：5′-TCGATGCTGGCCGAGAAG-3′，及探針Probe：5′-FAM-ATTCCTTTCTGCTATCGGT-MGB-3′，擴增目的片段大小為100 bp；SYBR Green Ⅰ熒光引物1對，F(xiàn)2：5′-GCCAGTTAGCGACGACGAAT-3′，R2：5′-ACTTTGAACCCAGAGCGACT-3′，擴增目的片段大小為186 bp；常規(guī)PCR引物1對，F(xiàn)3：5′-GTGTACTTCCTGTACGACCG-3′，R3：5′-CTTGAGTCGCGCTGCTACCA-3′，擴增目的片段大小為1 245 bp；參照王亞新等[19]建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法合成引物F4：5′-CGTGACGGTAGCCTGGGACT-3′，R4：5′-CGTCTCGCAGCATTTCGTC-3′。引物與探針均由擎科生物技術有限公司合成。

1.4 重組質粒標準品的制備

利用病毒基因組提取試劑盒，提取200 μL IBRV病毒原液DNA作為模板，F(xiàn)3/R3為引物，進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，檢測無誤后將目的片段回收，使用5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit快速克隆試劑盒進行純化產(chǎn)物的連接，測序鑒定重組質粒序列正確后，測定重組質粒濃度，并使用以下公式將重組質粒的濃度轉換為重組質粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=質粒濃度×109×6.02×1023/(660×質粒長度)，并作為陽性標準品，命名為pCE2-gE，于-80 ℃保存。

1.5 熒光定量PCR反應程序及體系優(yōu)化

制備20 μL以pCE2-gE為模板的反應體系。通過控制單一變量，對探針和引物濃度進行優(yōu)化，并且設置不同的退火溫度，根據(jù)擴增曲線Ct值最小、熒光值融解曲線單一且最高和特異性最明顯為標準，確定最佳反應條件。

1.6 標準曲線的建立

將重組質粒標準品pCE2-gE稀釋至1×1010copies/μL后再10倍梯度稀釋至1×100copies/μL，獲得1×1010～1×100copies/μL系列標準模板，利用已確定的最佳反應條件進行探針法和染料法熒光定量PCR擴增，以起始模板量拷貝數(shù)的稀釋倍數(shù)作為橫坐標，Ct值作為縱坐標繪制標準曲線。

1.7 特異性試驗

分別以BVDV、BPIV-3、巴氏桿菌及IBRV的核酸為模板，以ddH2O為陰性對照，采用已建立的探針法和染料法熒光定量PCR進行擴增，分析該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

以1.6中的系列標準質粒為模板，對照組使用ddH2O，每個模板濃度做3個重復，用已建立的探針法和染料法熒光定量PCR進行擴增，獲得2種檢測方法的最低檢測限。

1.9 重復性試驗

批內(nèi)重復性試驗：模板為5份不同稀釋度pCE2-gE質粒，設置空白對照，進行熒光定量PCR檢測，每份樣品做3個重復，分析Ct值的標準差(S)和變異系數(shù)(CV)來確定批內(nèi)重復性。

批間重復性試驗：模板為5份不同稀釋度pCE2-gE質粒，設置空白對照，進行熒光定量PCR檢測，每間隔7 d重復1次共進行3次重復，分析Ct值的S和CV來確定批間重復性。

1.10 熒光定量 PCR 臨界值的確定

取檢測最低限質粒30份，用建立的熒光定量PCR方法進行檢測，對Ct值計算平均值M和標準差SD。根據(jù)統(tǒng)計學規(guī)律，該方法的臨界值為：陽性臨界值=M-3SD，可疑區(qū)間為M±3SD[23]。

1.11 臨床樣品的檢測

為比較2種熒光定量檢測方法的臨床應用性能，分別用本試驗建立的2種熒光定量方法和王亞新等[19]建立的IBRV SYBR Green Ⅰ PCR方法對臨床上收集的疑似感染IBRV的牦牛病料進行檢測，比較不同檢測方法的檢出率及符合率。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的制備

將提取的IBRV DNA作為模板，分別用F1/R1、F2/R2、F3/R3這3對引物進行PCR擴增，得到大小分別約為100 bp(圖1A)、186 bp(圖1B)和1 245 bp(圖1C)的3條目的片段，與預期片段大小相符。經(jīng)測序驗證，重組質粒序列完整無誤，質粒標準品pCE2-gE構建正確。擴菌后提取質粒，pCE2-gE的質粒濃度為396 ng/μL，經(jīng)計算拷貝數(shù)為6.943×1010copies/μL。

M. DM2000+ DNA Marker；1. 目的片段；2. 陰性對照。

2.2 熒光定量PCR反應程序及體系優(yōu)化

通過單一變量法改變反應體系中引物和探針濃度、退火溫度，確定最終的反應條件。

TaqMan熒光定量PCR法反應體系：2 × AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2 10.0 μL，上、下游引物(F1/R1)各0.4 μL，IBRV DNA 模板為2 μL，探針0.2 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應程序：37 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。

SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法反應體系：2 × AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物(F2/R2)各0.4 μL，IBRV DNA模板2 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

2.3 SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR溶解曲線

使用建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法擴增重組質粒pCE2-gE，可見溶解曲線中，在89 ℃左右擴增產(chǎn)物均出現(xiàn)單峰(圖2)，表明擴增體系有特異性。

圖2 SYBR Green Ⅰ熒光定量 PCR 溶解曲線

2.4 標準曲線的建立

以1.0×103～1.0×1010copies/μL的標準質粒為模板分別用2種熒光定量PCR方法進行檢測并繪制標準曲線，其中，X軸為標準質粒稀釋倍數(shù)，Y軸為讀取的Ct值。

結果顯示，探針法擴增相關系數(shù)R2為0.994，標準曲線方程為：y=-3.169 8x+44.153(圖3A)；染料法擴增相關系數(shù)R2為0.999，標準曲線的方程為：y=-3.756 1x+34.909(圖3B)。

A. TaqMan熒光定量PCR標準曲線；B. SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR標準曲線。

2.5 特異性試驗

用建立的2種熒光定量PCR方法對IBRV、巴氏桿菌、BVDV和BPIV-3的核酸進行檢測，結果顯示，僅IBRV出現(xiàn)特異性擴增，表示建立的2種熒光定量PCR方法特異性良好(圖4A和圖4B)。

A.TaqMan 熒光定量PCR；B. SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR。1. IBRV，2～5. 分別為BVDV、BPIV-3、巴氏桿菌、陰性對照。

2.6 敏感性試驗

用本試驗建立的2種熒光定量PCR法分別對1.0×101～1.0×1010copies/μL 10×倍比稀釋的重組質粒pCE2-gE進行檢測。

結果顯示，探針法能檢測到的最低濃度為1.0×101copies/μL(圖5A)，染料法能檢測到的最低濃度為1.0×102copies/μL(圖5B)，探針法敏感性是染料法的10倍。結果表明，本研究建立的熒光定量PCR方法靈敏度高，且TaqMan熒光定量PCR法較SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法敏感性更高。

A. TaqMan熒光定量PCR法；B. SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法。1～11. 標準質粒濃度分別為1.0×1010～1.0×100 copies/μL；12. 陰性對照。

2.7 重復性試驗

TaqMan-MGB熒光定量PCR法：以連續(xù)5個稀釋倍數(shù)的重組質粒pCE2-gE為模板分別進行組內(nèi)和組間重復性試驗，結果顯示組內(nèi)和組間Ct值變異系數(shù)(CV)分別為0.75%～2.02% 和0.42%～2.30%(表1)。

表1 TaqMan熒光定量PCR法的重復性試驗結果

SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法：以連續(xù)5個稀釋倍數(shù)的重組質粒pCE2-gE為模板分別進行組內(nèi)和組間重復性試驗，結果顯示組內(nèi)和組間Ct值變異系數(shù)(CV)分別為0.82%～1.90%和0.75%～1.95%(表2)。

表2 SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法的重復性試驗結果

以上結果顯示2種方法的CV值均小于2.3%，具有良好的可重復性。

2.8 熒光定量PCR臨界值的確定

取檢測最低限質粒30份，分別用建立的2種熒光定量PCR方法進行檢測，計算Ct值的平均值和標準差。探針法平均值和標準差分別為35.25和0.39，根據(jù)統(tǒng)計學規(guī)律計算：陰性臨界值為M-3SD=34.08；可疑區(qū)間為M±3SD=34.08～36.42。染料法的平均值與標準差分別為33.79和0.40，根據(jù)統(tǒng)計學規(guī)律計算：陰性臨界值為M-3SD=32.59；可疑區(qū)間為M±3SD=32.59～34.99。

使用建立的探針法熒光定量PCR檢測時，當Ct<34.08并且擴增曲線規(guī)則判定為陽性；當34.08

使用建立的染料法熒光定量PCR檢測時，當Ct<32.59并且擴增曲線規(guī)則判定為陽性；當32.59

2.9 臨床樣品的檢測

使用建立的2種熒光定量PCR檢測法分別對收集的130份疑似IBRV病料進行檢測，探針法檢出Ct值為28.19～34.57，130份樣品均為陽性，檢出率為100%；染料法檢出Ct值為29.1～32.53，130份樣品均為陽性，檢出率為100%，2種熒光定量PCR方法的檢測符合率為100%；使用王亞新等[19]建立的熒光定量檢測方法檢測出陽性130份，檢出率為100%。結果表明，本試驗建立的檢測方法與已成功發(fā)表的檢測方法檢測符合率100%。

3 討論

由于缺乏有效治療措施，IBR自1980年在國內(nèi)報道后就一直是我國重點監(jiān)測的動物疫病之一[24]。防控本病的關鍵在于帶病牛的及時檢出和處理。牦牛粗放散養(yǎng)的養(yǎng)殖模式使得樣本采集難度提高，相比之下鼻咽拭子要便于血清采集。因此，本試驗設計IBRV檢測方法時首選PCR法檢測抗原。本研究基于IBRV的保守基因gE設計了引物，分別對反應條件進行優(yōu)化后，建立了2種熒光定量PCR方法。敏感性試驗結果顯示，TaqMan熒光定量PCR法與SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法可檢測到的最小質粒濃度分別為1.0×101copies/μL和 1.0×102copies/μL。王亞新等[19]建立的針對gB基因的SYBR Green Ⅰ熒光定量檢測方法最低檢測限為5.747×102copies/μL；王倩穎等[21]建立的針對gD基因SYBR Green Ⅰ光定量檢測方法最低檢測限為4.8×100copies/μL；劉占悝等[25]建立的針對IBRV SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法最低檢測限為3.04×101copies/μL；張喜喜[26]建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量和TaqMan探針熒光定量檢測方法最低檢測限為1.0×102copies/μL。綜合比較而言，本試驗建立的2種熒光定量PCR方法靈敏度較好，具備轉化成快速準確的臨床檢測試劑盒的潛力。目前國內(nèi)的IBRV檢測試劑多用于血清抗體檢測，缺乏商品化的鼻咽拭子抗原檢測試劑盒。本次試驗所檢測的臨床樣本為IBR疑似樣品，檢測的結果不代表真實感染率，但經(jīng)與王亞新等[19]在2022年建立的IBRVgB基因的SYBR Green Ⅰ檢測方法進行對比，3種方法陽性檢出率均為100%，陽性檢出符合率為100%，表明試驗結果仍具有參考價值。