王曉潔，王 哲，趙 丹，王 倩，陸秀君,2，郭 巍

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省核桃工程技術(shù)研究中心，河北 臨城 054300）

美國白蛾（Hyphantria cunea）是重要的檢疫性農(nóng)林害蟲，在我國連續(xù)多年爆發(fā)成災(zāi)且危害范圍逐年擴(kuò)大［1］。目前，生產(chǎn)上防治美國白蛾采取化學(xué)防治和生物防治相結(jié)合的方法［2-3］，生物防治中源自蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的Bt Cry1Ac 毒素蛋白應(yīng)用最廣泛［3］，近年來對Bt Cry1Ab 也有較深入研究［4］。蘇云金芽胞桿菌Bt Cry 蛋白與昆蟲中腸上皮細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致中腸穿孔，是其殺蟲的重要環(huán)節(jié)［5］。多種昆蟲中腸蛋白已被鑒定為Bt Cry 毒蛋白的受體，主要包括：鈣粘蛋白（Cadherin，CAD）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、氨肽酶N（Aminopeptidase N，APN）和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）等4 類［6］。

ABC 轉(zhuǎn)運蛋白包含2 個結(jié)合膜及水解ATP 的腺苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-binding domains，NBD） 和2 個跨膜結(jié)構(gòu)域（Trans-membrane domain，TMD），包括ABCA 至ABCG 等八類。該類蛋白不僅是Bt Cry 蛋白的受體，其跨膜結(jié)構(gòu)域也參與農(nóng)藥對昆蟲的毒力作用過程［5］。目前已在棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、美洲棉鈴蟲（H.zea）、 小菜蛾（Plutella xylostella）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）和草地貪夜蛾（S.frugiperda）等至少14 種重要昆蟲得到證實［7］。多種昆蟲的ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCG1 等中腸蛋白分別能與Bt Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ca、Cry1Fa、Cry2Aa 和Cry2Ab 結(jié)合［6］。棉鈴蟲ABCC2、ABCC3 可以與Bt Cry1Ac 特異性結(jié)合［7］。小菜蛾ABCB1、ABCG1 和ABCC2 與Bt Cry1Ac 特異性結(jié)合［8］；甜菜夜蛾（S.exigua）ABCC2 與Bt Cry1Ac 和Cry1Ca 特異結(jié)合［9］；桃蛀螟（Conogethes punctiferalis）ABCC 受體與Cry1Ah 和Vip3Aa19 對其殺蟲協(xié)同增效有關(guān)［10］；斜紋夜蛾ABCC2 是Bt Cry1Ca 功能受體［6］。由此可見，ABCC 類受體是多種鱗翅目昆蟲中廣泛存在的Bt Cry 蛋白受體。目前，有關(guān)ABCC4 受體蛋白相關(guān)研究報道，僅見于家蠶中存在ABCC4基因［11］；經(jīng)Bt Cry1Ac 處理后，家蠶（Bombyx mori）ABCC4基因表達(dá)上調(diào)（基因序列尚未公開）［11］。由此推測ABCC4 蛋白可能也是鱗翅目昆蟲Bt Cry 毒素的重要受體蛋白，查閱GenBank 可知，目前共收錄15種鱗翅目的ABCC4基因，但該類基因的功能仍不清楚，有待深入研究。

Bt Cry9 類蛋白是一類對多種鱗翅目害蟲高效的毒素蛋白。有研究表明，Bt Cry9Aa 和Vip3Aa 對二化螟（Chilo suppressalis）具有協(xié)同增效作用［12］；Bt Cry9Aa3 對小菜蛾和亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis） 有較高的殺蟲活性［13］；Bt Cry9Ee對Cry1Ab 抗性亞洲玉米螟致死率高達(dá)96%，可以作為理想的候選基因延緩和克服抗性［14］；cry2Ab+cry9Ea 復(fù)合基因型菌株JN001 對亞洲玉米螟表現(xiàn)出較高毒性［15］。有關(guān)Bt Cry9 類蛋白對美國白蛾的殺蟲活性，初步研究表明Cry9Ea10 對美國白蛾有殺蟲活性［16］。

為明確Bt Cry 蛋白對美國白蛾的生防潛力及作用機(jī)制，基于中腸iTraq 和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，前期本實驗室已發(fā)現(xiàn)美國白蛾中腸中存在APN、CAD、ALP，ABC 等多種Bt Cry 毒素的受體蛋白［17-18］，包括ABCB6，ABCC4 和ABCG4 等多個ABC 類蛋白，鑒定得到美國白蛾中腸受體蛋白基因HcABCC4（GenBank 登錄號為MW727508.1），其全長為4 161 bp，并克隆表達(dá)了其約70 kD 的TMD 結(jié)構(gòu)域（待發(fā)表）。Bt Cry9Ea10 蛋白是本實驗室前期構(gòu)建的對鱗翅目多種害蟲高效的蛋白［16］。為明確美國白蛾受體蛋白ABCC4 與Bt Cry9Ea10 毒蛋白的互作機(jī)制，本研究在生物測定基礎(chǔ)上，開展了Cry9Ea10毒素蛋白與HcABCC4TMD 結(jié)構(gòu)域蛋白的體外結(jié)合試驗，利用RNAi 技術(shù)結(jié)合生物測定研究HcABCC4基因沉默后Cry9Ea10 蛋白對美國白蛾毒力變化，以明確Bt Cry9Ea10 蛋白對美國白蛾的作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)害蟲防治新靶標(biāo)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

美國白蛾蟲卵購自中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所昆蟲病毒研發(fā)中心，置于（26±1）℃，RH(60±5)%，光周期16L∶8D 培養(yǎng)箱中孵化，1 齡幼蟲后飼喂人工飼料，至四齡幼蟲，備用。人工飼料的配制參考曹利軍等［19］方法。

配體印記試驗預(yù)染Protein Marker 購自Thermo公司；蛋白抗體為實驗室保存；Anti 6 × His 抗體購自中杉金橋公司，羊抗鼠IgG-AP 抗體、羊抗兔IgG-AP 抗體購自BOSTER 公司。

1.2 Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白對美國白蛾的殺蟲活性測定

Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白對美國白蛾四齡幼蟲生物測定參考趙丹方法［20］。將Bt Cry 蛋白逐級稀釋至終濃度為28.0、56.0、112.0、224.0 和448.0 μg/mL，以無菌水為對照；逐日統(tǒng)計幼蟲死亡情況，3 d 后，計算平均校正死亡率（%），SPSS 26.0 推斷毒力回歸方程，得到LC50和LC70。

1.3 美國白蛾HcABCC4 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用本實驗室前期克隆的HcABCC4 基因（GenBank 登錄號：MW727508.1）推導(dǎo)的氨基酸序列，與GenBank 數(shù)據(jù)庫檢索到的鱗翅目昆蟲ABCC4 氨基酸序列，采用MEGA7.0 軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 HcABCC4 TMD 重組蛋白與Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白Ligand blot 分析

利用本實驗室前期構(gòu)建的HcABCC4 TMD 結(jié)構(gòu)域（第25 ～1 387 bp 區(qū)）表達(dá)載體，表達(dá)70 kD重組蛋白，10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，將PVDF 膜用1%BSA 室溫封閉1 h，與2 μg 的Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 毒素蛋白孵育1 h， 與Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 抗體（前期實驗室制備）稀釋10 000 倍條件下進(jìn)行配體印記實驗，以未進(jìn)行Bt Cry 毒素孵育的處理作為對照，分析HcABCC4 TMD 蛋白與Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 毒素蛋白的結(jié)合特性。

1.5 HcABCC4 TMD 重組蛋白與2 種BtCry 蛋白親和力測定

以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別測定Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 蛋白與HcABCC4 TMD 蛋白的結(jié)合能力。將終濃度5 μg/mL HcABCC4 TMD 受體蛋白，加入酶標(biāo)板4 ℃包被過夜。各孔中分別加入0、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 nmol/L 的Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 蛋白，孵育1 h；漂洗，分別加入一抗（Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 特異抗體），二抗（AP 偶聯(lián)的羊抗兔IgG），100 μL含1 mg/mL 對硝基苯磷酸二鈉六水合物（pNPP）顯色液顯色（37℃；避光15 min），最后加入25 μL 的3 mol/L NaOH 終止顯色。iMark 酶標(biāo)儀雙波長（405 ～450）nm 檢測，讀取吸光值。SPSS 26.0軟件分析比較親和力差異。

1.6 RNAi 及生物測定

RNAi 相關(guān)試驗參考趙丹方法［20］。根據(jù)T7 RiboMAX? Express RNAi System 說明書，分別設(shè)計HcABCC4基因的dsRNA 引物，以gfp為對照。由生工合成dsRNA 需要的正向、反向引物（見表1），以美國白蛾四齡cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化回收后，通過Promega T7 RiboMAX? Express RNAi System 試劑盒，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA，轉(zhuǎn)錄體系參考說明書。

表1 HcABCC4 基因dsRNA 引物Table 1 Primers for dsRNA of HcABCC4 gene

采用注射法進(jìn)行試驗，注射完成3 d 后，提取處理組RNA，合成cDNA，qRT-PCR 檢測不同處理美國白蛾HcABCC4基因表達(dá)量。SPSS 26.0 進(jìn)行差異顯著性分析。

將注射dsRNA 3 d 后的美國白蛾幼蟲轉(zhuǎn)移至含有LC70的Bt Cry9Ea10 蛋白飼料，每處理20 頭幼蟲進(jìn)行生物測定，重復(fù)3 次，逐日統(tǒng)計幼蟲死亡情況。SPSS 26.0 統(tǒng)計分析HcABCC4基因沉默前后Bt Cry9Ea10 蛋白對美國白蛾毒力變化，分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白對美國白蛾的殺蟲活性測定

生物測定結(jié)果顯示，Bt Cry9Ea10 和Bt Cry 1Ac蛋白對美國白蛾幼蟲均有殺蟲活性，毒力回歸方程分別為y=-4.61+2.28x、y=-4.90+2.376x，LC50和LC70值分別為115.60、104.58 μg/mL 和177.58、192.15 μg/mL。由此推斷，Bt Cry9Ea10 蛋白對美國白蛾的毒力與Bt Cry 1Ac 蛋白相當(dāng)。

2.2 美國白蛾HcABCC4 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

經(jīng)GenBank 檢索， 得到16 個鱗翅目昆蟲ABCC4 氨基酸序列，HcABCC4 和其他15 種鱗翅目昆蟲的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。結(jié)果顯示，美國白蛾HcABCC4氨基酸序列與夜蛾科害蟲棉鈴蟲H.armigera（XM 049842273.1）、 美洲棉鈴蟲H.zea（XM 047179823.1）、 草地貪夜蛾S.frugiperda（XM 035574947.2）和斜紋夜蛾S.litura（KP335688.1）的ABCC4 氨基酸序列聚為一支，相似性一致，支持率為98%。根據(jù)目前ABCC4 已知序列推斷，美國白蛾HcABCC4 與夜蛾科昆蟲ABCC4 親緣關(guān)系最近，而與其他鱗翅目昆蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 基于氨基酸序列構(gòu)建的美國白蛾與15 種鱗翅目昆蟲ABCC4 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of ABCC4 between H.cunea and other insects from Lepidoptera based on amino acid sequences

2.3 Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白與重組HcABCC4 TMD 的結(jié)合能力分析

Ligand blot 分析結(jié)果表明，Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白與HcABCC4 TMD 重組蛋白能夠特異結(jié)合（圖2）。ELISA 蛋白親和力測定結(jié)果表明，結(jié)合信號隨蛋白濃度增加而增強(qiáng)，且結(jié)合存在飽和現(xiàn)象；Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白與HcABCC4 TMD 重組蛋白的解離常數(shù)Kd 值分別為（276.80 ±0.056）、（131.30±0.087）nmol/L，最大親和力Bmax 為（0.23±0.06）、（0.86±0.086）（見圖3）。

圖2 HcABCC4 TMD 蛋白與Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 的配體印記實驗Fig.2 Ligand blot analysis of Bt Cry9Ea10, Cry1Ac and HcABCC4 TMD proteins

圖3 Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 與 HcABCC4 TMD 蛋白的親和力測定Fig.3 Affinity between Bt Cry9Ea10 and Bt Cry1Ac with HcABCC4 TMD protein

由圖3 可知，Bt Cry9Ea10 與HcABCC4 TMD的解離常數(shù)Kd 值高于Cry1Ac 的Kd 值，表明Bt Cry9Ea10 與HcABCC4 TMD 間親和力較弱。推測HcABCC4 為Bt Cry9Ea10 毒素的中腸受體蛋白。

2.4 美國白蛾HcABCC4 在Bt Cry9Ea10 蛋白殺蟲中的功能研究

2.4.1 沉默效率檢測 合成dsRNA，經(jīng)分光光度計檢測dsgfp、dsHcABCC4的濃度分別為10 582.3、8 681.1μg/mL，A260/A280分別為1.95、2.02，濃度與質(zhì)量均符合要求，可用于注射幼蟲。HcABCC4沉默結(jié)果顯示，注射dsHcABCC4的幼蟲靶標(biāo)基因表達(dá)水平下降了58.04%（圖4），且與對照間差異顯著（P＜0.05），表明已成功沉默HcABCC4，且沉默效率高。

圖4 美國白蛾幼蟲dsRNA-gfp/-HcABCC4 沉默后基因的表達(dá)水平Fig.4 Gene expression levels in the larvae of H.cunea after injection with dsRNA-gfp or -HcABCC4

2.4.2 沉默HcABCC4基因后美國白蛾對Bt Cry9Ea10 蛋白的敏感性變化HcABCC4基因沉默后美國白蛾幼蟲對Bt Cry9Ea10 蛋白的敏感性試驗表明，分別沉默HcABCC4、gfp基因后Bt Cry9Ea10 蛋白對美國白蛾的校正死亡率分別為26.7%和65.1%（見圖5），平均校正死亡率下降58.97%（P＜0.05）。由此證明，HcABCC4 蛋白是Bt Cry9Ea10 的中腸受體蛋白。

圖5 美國白蛾幼蟲dsRNA-gfp/-HcABCC4 沉默后對Bt Cry9Ea10 蛋白的敏感性Fig.5 Sensitivity of H.cunea larvae to Bt Cry9Ea10 protein after injection with dsRNA-gfp or -HcABCC4

3 結(jié)論與討論

美國白蛾自傳入我國后，對我國的生態(tài)環(huán)境、經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生物安全均造成了嚴(yán)重危害［1-2］。蘇云金芽胞桿菌（Bt）是應(yīng)用最成功的生防微生物。在多種害蟲防控上，已鑒定多種中腸受體蛋白與Bt Cry 蛋白特異性結(jié)合，影響B(tài)t Cry 蛋白對害蟲的毒力。已有研究表明Bt Cry9 類蛋白對多種鱗翅目害蟲有較高毒力［13］。而有關(guān)Bt Cry9 類蛋白與昆蟲中腸受體蛋白互作機(jī)制研究仍很有限。由于昆蟲與Bt 殺蟲毒素互作機(jī)理表現(xiàn)出種間差異性［5,21］，因此，無法根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)推斷Bt Cry 蛋白對美國白蛾的中腸蛋白受體類型。本研究利用生物測定、配體印記雜交和基因沉默等技術(shù)對美國白蛾與高毒力Bt Cry9Ea10 毒素互作機(jī)制進(jìn)行了研究，研究結(jié)果將為生產(chǎn)提供高效Bt 毒素蛋白，也為構(gòu)建二代轉(zhuǎn)基因抗美國白蛾林木提供候選基因。

2010 年首次發(fā)現(xiàn)昆蟲ABC 轉(zhuǎn)運蛋白是Bt Cry蛋白的重要受體蛋白［5］，而有關(guān)美國白蛾ABC 類受體研究尚未見報道。本研究配體印記雜交試驗表明，Bt Cry9Ea10 蛋白與HcABCC 結(jié)構(gòu)域TMD 重組蛋白發(fā)生特異結(jié)合，通過RNAi 技術(shù)對HcABCC4進(jìn)行沉默后，進(jìn)行美國白蛾幼蟲Bt Cry9Ea10 蛋白蛋白敏感性試驗發(fā)現(xiàn)Bt 毒素的敏感性顯著下降。說明美國白蛾ABCC4蛋白是Bt Cry9Ea10的重要受體，同時通過數(shù)據(jù)庫分析，該蛋白還是農(nóng)藥的重要受體，因此，該基因的克隆表達(dá)為研究美國白蛾對農(nóng)藥抗性也提供了重要參考。