郭 莎 李雪梅 任奎羽 陳兆恒 楊 莎

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,成都,610075; 2 南充精神衛(wèi)生中心,南充,637000)

原發(fā)性痛經(jīng)(Primary Dysmenorrhea,PD)也稱功能性痛經(jīng),是指生殖器官無器質(zhì)性病變引起的痛經(jīng),臨床表現(xiàn)以月經(jīng)前后與行經(jīng)期間出現(xiàn)周期性痙攣性下腹部疼痛為主。PD在年輕女性中是最常見的婦科疾病[1],在一項針對中國女大學(xué)生的研究中,51.1%的女大學(xué)生均患有PD,其中PD中度以上的疼痛的患病率為33.1%[2]。并且PD會嚴重影響女性的身體健康及生命質(zhì)量[3]。目前,PD尚無特效治療藥物,臨床上多以非甾體抗炎藥、避孕藥等藥物緩解疼痛[4],有一定療效,但不良反應(yīng)也較多,包括長期使用可導(dǎo)致高血壓、腦卒中、心臟病等疾病的產(chǎn)生[5]。同時,有20%～25%的女性對上述藥物反應(yīng)不佳[6]。

研究表明,溫和灸具有溫通經(jīng)脈、活血止痛的作用,對PD有獨特療效,不良反應(yīng)小,安全性高,能有效改善患者經(jīng)期疼痛癥狀、中醫(yī)證候表現(xiàn)及生命質(zhì)量[7-9]。PD的具體發(fā)病機制尚不明確,但有學(xué)者認為其發(fā)病機制可能與血液流變學(xué)及子宮微循環(huán)狀態(tài)有關(guān)[10-11]。同時課題組前期研究發(fā)現(xiàn),溫和灸治療對PD患者的子宮微循環(huán)狀態(tài)改善明顯,表現(xiàn)在治療后患者子宮內(nèi)血流增多、子宮動脈血流速度增快、血流阻力降低[12]。因此,在臨床有效的基礎(chǔ)上,溫和灸對子宮微循環(huán)及血液流變學(xué)的影響值得進一步研究。本研究對溫和灸治療PD可能的作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)雌性大鼠40只,鼠齡12周齡,體質(zhì)量(255±25)g,性成熟未交配,成都達碩實驗動物有限公司提供(許可證號:SCXK 2015-030)。飼喂普通大鼠清潔級飼料,清潔飲水。本實驗已通過成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(倫理審批號:2020-01)。實驗過程對動物的處置遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 藥物 苯甲酸雌二醇注射液(寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn),批號:B191001)、縮宮素注射液(寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn),批號:S190204)。

1.1.3 試劑與儀器 10%水合氯醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號:20200811),艾條(臨湘市湖香艾生物科技有限公司)。體視顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司,型號:SMZ-168)、自動血流變測試儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司,型號:SA-900)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,通過陰道涂片法確定其動情周期[13],根據(jù)細胞種類、形態(tài)及數(shù)量選出動情周期規(guī)律的SD雌性大鼠40只,按照隨機數(shù)字表法分為空白組、空白加艾灸組、模型組、艾灸組4組,每組10只。

痛經(jīng)大鼠模型采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素法制備。除空白組、空白加艾灸組外,其余組大鼠均在每日固定時間給予腹部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,連續(xù)10 d,第1天及第10天每只每日注射0.5 mg,第2～9天每只0.2 mg/d,末次給藥1 h后,腹腔注射縮宮素2 U/只,記錄大鼠20 min內(nèi)扭體反應(yīng)?？瞻捉M、空白加艾灸組皮下注射同等劑量的生理鹽水,連續(xù)10 d。

1.2.2 干預(yù)方法 從第11天起,開始給予空白加艾灸組和艾灸組溫和灸治療,空白組和模型組同樣抓取、固定但不做治療,于每日固定時間開始,連續(xù)10 d。大鼠穴位定位,常規(guī)消毒,定位依據(jù)余曙光《實驗針灸學(xué)》[14]的動物穴位圖譜,關(guān)元:臍下約25 mm處;三陰交:后肢內(nèi)踝尖上10 mm。溫和灸方法:空白加艾灸組和艾灸組各動物著自制鼠衣,并固定在自制鼠架上,暴露腹部及后肢,去除大鼠關(guān)元、三陰交處毛發(fā)約1 cm×1 cm,點燃艾條放置在離大鼠皮膚2～3 cm處,進行溫和灸。1次/d,20 min/次,連續(xù)10 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 扭體反應(yīng) 最后一次注射苯甲酸雌二醇1 h后,除空白組、空白加艾灸組外每只動物腹腔注射催產(chǎn)素2 U,觀察20 min內(nèi)扭體反應(yīng)動物數(shù)及扭體次數(shù),扭體反應(yīng)表現(xiàn)為:大鼠腹部收縮內(nèi)凹,軀干與后肢伸展,一側(cè)肢體內(nèi)旋。

1.2.3.2 子宮微血管管徑 參考文獻[15],于治療結(jié)束1 d后,給予大鼠10%水合氯醛麻醉,于腹部正中線外約0.5 cm處行2～3 cm縱行切口,游離一側(cè)子宮及其韌帶,并將其置于體式顯微鏡下。于40X線鏡視野中觀察各組大鼠子宮微血管的顏色和管徑,并拍攝照片。最后,將鏡下子宮微血管圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus軟件,測量微血管管徑并記錄。

1.2.3.3 血液流變學(xué) 大鼠麻醉狀態(tài)下,分離頸動脈,插管取血,使用SA-9000自動血液流變測試儀分析系統(tǒng)檢測血液流變學(xué)指標(biāo)(全血黏度、紅細胞壓積、紅細胞變形指數(shù)、紅細胞剛性指數(shù)、紅細胞沉降率)。

1.2.3.4 子宮組織形態(tài)學(xué)觀察 動物處死后,迅速取出大鼠子宮,肉眼觀察并記錄子宮形態(tài)學(xué)改變。剔除脂肪和其他組織后,測量子宮分角橫徑并記錄。

2 結(jié)果

2.1 痛經(jīng)大鼠扭體反應(yīng)情況 與空白組與空白加艾灸組比較,模型組與艾灸組扭體潛伏期均顯著縮短,扭體次數(shù)均增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);模型組與艾灸組扭體反應(yīng)、扭體潛伏期比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠扭體反應(yīng)比較

2.2 溫和灸對痛經(jīng)大鼠子宮組織形態(tài)及子宮橫徑的影響 雌激素刺激后,模型組大鼠子宮體明顯增大,子宮內(nèi)積液明顯增多,子宮橫徑較其余3組顯著增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,艾灸組子宮體增大不明顯,子宮橫徑明顯減少(P<0.01)?？瞻捉M與空白加艾灸組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。溫和灸對實驗性子宮增大有一定的抑制作用,而對正常狀態(tài)下的大鼠子宮形態(tài)影響不明顯。見圖1～2。

圖1 溫和灸對痛經(jīng)大鼠子宮橫徑的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加艾灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05

圖2 溫和灸對痛經(jīng)大鼠子宮形態(tài)的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加艾灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05

2.3 溫和灸對痛經(jīng)大鼠子宮微血管管徑的影響 與空白組比較,空白加艾灸組子宮微血管管徑輕微擴張(P>0.05),模型組子宮微血管管徑顯著收縮(P<0.05),艾灸組子宮微血管管徑收縮明顯(P<0.05);與空白加艾灸組比較,模型組及艾灸組微血管管徑明顯收縮(P<0.05);與模型組比較,艾灸組子宮微循環(huán)管徑顯著擴張(P<0.05)。溫和灸可顯著擴張痛經(jīng)大鼠子宮微血管管徑,改善子宮微循環(huán)障礙,但對健康大鼠子宮微血管管徑無明顯擴張作用。見圖3～4。

圖3 溫和灸對痛經(jīng)大鼠子宮微血管管徑的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲▲P<0.05

圖4 大鼠子宮微血管管徑(×40)注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲▲P<0.05

2.4 溫和灸對痛經(jīng)大鼠全血黏度的影響 與空白組比較,模型組與艾灸組所有切變率下的全血黏度均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與空白加灸組比較,模型組全血黏度切變度5、30及200均降低(均P<0.05);與模型組比較,艾灸組全血黏度有增高趨勢(P>0.05)。見圖5。

圖5 溫和灸對痛經(jīng)大鼠全血黏度的影響注:與空白組比較,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01

2.5 溫和灸對痛經(jīng)大鼠紅細胞變形指數(shù)、紅細胞剛性指數(shù)、紅細胞壓積及紅細胞沉降率方程K值的影響 與空白組比較,模型組紅細胞壓積、紅細胞剛性指數(shù)及紅細胞沉降率方程K值下降較明顯(P<0.05),艾灸組紅細胞沉降率方程K值及紅細胞壓積下降明顯(P<0.05)。與空白加艾灸組比較,模型組及艾灸組紅細胞沉降率方程K值及紅細胞壓積下降明顯(P<0.05)。與模型組比較,艾灸組方程K值、紅細胞壓積、紅細胞剛性指數(shù)及變形指數(shù)有升高的趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模法可能導(dǎo)致大鼠紅細胞沉降率方程K值、紅細胞壓積、紅細胞變形及剛性指數(shù)降低。經(jīng)溫和灸干預(yù)后,痛經(jīng)模型大鼠紅細胞沉降率方程K值、紅細胞壓積、紅細胞變形及剛性指數(shù)均有上升的趨勢。見圖6。

圖6 溫和灸對痛經(jīng)大鼠紅細胞剛形指數(shù)、紅細胞變性指數(shù)、紅細胞壓積,紅細胞沉降率方程K值的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.6 大鼠子宮微血管管徑與子宮橫徑、全血黏度各切變度相關(guān)性 大鼠微血管管徑與子宮橫徑、全血黏度各切變度間均存在線性關(guān)系,其中微血管管徑與子宮橫徑負相關(guān)(-1

3 討論

大鼠的動情周期受下丘腦-垂體-性腺軸支配,為規(guī)律的非妊娠生殖活動[16],因此,在痛經(jīng)模型制備前,篩選動情周期規(guī)律的雌性大鼠至關(guān)重要。篩選完成后采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造類痛經(jīng)模型,在雌激素的作用下,非妊娠大鼠子宮肌層縮宮素受體含量上升[17],大鼠腹腔注射縮宮素后,縮宮素與子宮肌層的縮宮素受體相結(jié)合,從而引起子宮平滑肌劇烈痙攣收縮,誘發(fā)大鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)[18]。扭體反應(yīng)是目前應(yīng)用最廣的內(nèi)臟痛模型之一,也是痛經(jīng)模型成功與否的重要判定指標(biāo)[19]。本研究中,經(jīng)苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模法造模后大鼠出現(xiàn)扭體潛伏期縮短,扭體次數(shù)顯著性增加,均提示痛經(jīng)大鼠模型制備成功。

子宮循環(huán)系統(tǒng)中最基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)為子宮微血管與毛細血管間的血液循環(huán),研究表明,子宮微血管管徑范圍為11～100 μm,而<10 μm的血管管徑則為毛細血管,子宮微血管異?？梢鸢≒D在內(nèi)的一系列婦科疾病[20]。研究顯示,微血管通透性增加,血漿蛋白可隨液體滲出血管,導(dǎo)致組織液的生成超過回流,引起組織、器官水腫和功能障礙[21-22],外滲的水腫液可壓迫微血管,加劇管腔狹窄[23],進而加快血液運行,而血液運行的加快及血漿蛋白的減少均可降低血液黏度[24],最終影響微血管灌注,導(dǎo)致組織缺血缺氧。雌二醇作為血管通透性誘導(dǎo)因子,可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達,使子宮內(nèi)膜微血管通透性增加,進而導(dǎo)致子宮水腫的發(fā)生[25]。本研究中,經(jīng)苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模后大鼠出現(xiàn)子宮橫徑增大,子宮組織水腫增生,同時本研究發(fā)現(xiàn)子宮橫徑與子宮微血管管徑負相關(guān),表現(xiàn)為子宮微血管管徑狹窄收縮。而子宮微血管管徑與全血黏度正相關(guān),出現(xiàn)全血黏度各切變度下降,同時引起紅細胞沉降率方程K值、紅細胞變形指數(shù)、紅細胞剛性指數(shù)、紅細胞壓積均下降,影響紅細胞聚集及變形作用[26],導(dǎo)致血液黏度降低,最終造成子宮缺血缺氧,引發(fā)痛經(jīng)。經(jīng)溫和灸治療后,痛經(jīng)大鼠子宮橫徑減少明顯,子宮水腫明顯減輕,微血管管徑明顯擴張,血液黏度則有恢復(fù)正常的趨勢。同時溫和灸作為應(yīng)激刺激,未引起正常大鼠即空白加艾灸組各項指標(biāo)的改變。

艾灸主要通過艾葉等易燃材料或藥物燃燒后的溫?zé)岽碳ぜ八幬镒饔眠M行防病治病。研究表明,艾灸可以明顯改善PD的疼痛程度及癥狀評分,且安全可靠,不良反應(yīng)少,患者依從性高[9,27]。中醫(yī)學(xué)認為,PD屬“經(jīng)行腹痛”范疇,病位在胞宮、沖任,主要病機為“不通則痛”或“不榮則痛”。關(guān)元為足三陰與任脈交會穴,有升陽補氣、調(diào)理沖任之功效。三陰交為足三陰之交會穴,具有疏肝理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效。關(guān)元、三陰交配合可使沖任氣機通暢,氣血調(diào)和,相關(guān)研究顯示,灸法治療PD腧穴運用頻次最高為關(guān)元、三陰交,兩穴配伍關(guān)聯(lián)亦最高[28]。因此,本研究最終選取關(guān)元、三陰交兩穴配伍使用。

本研究結(jié)果顯示,通過苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模法建立PD大鼠模型成功,與健康大鼠比較,PD大鼠存在子宮水腫,微血管管徑收縮,血液流變學(xué)指標(biāo)下降,這可能是PD的發(fā)病機制。溫和灸干預(yù)后子宮水腫減輕,子宮微血管管徑擴張,血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)有上升的趨勢,子宮微循環(huán)障礙顯著改善。表明改善PD大鼠子宮水腫、血液流變性及微循環(huán)狀態(tài)是溫和灸治療PD可能的作用基礎(chǔ),具體的機制有待于進一步研究。

利益沖突聲明:無。