劉 理 謝燕飛 余 軍 （江西中醫(yī)藥大學醫(yī)學轉化中心，南昌 330004）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，其主要病變表現為部分動脈脂質沉積，并伴有平滑肌細胞和纖維基質增生，逐漸發(fā)展為動脈粥樣硬化斑塊，斑塊破裂往往伴隨纖維帽變薄、脂質池增大、炎癥活動增加、蛋白水解酶含量增加等現象［1］。巨噬細胞可分為M1 型和M2 型，分別釋放促炎因子及抑炎因子，促炎因子可促進斑塊形成，反之抑炎因子減緩斑塊形成。同時，巨噬細胞兩種表型可在一定條件下相互轉換［2］。研究表明，斑塊病變處存在大量不同表型巨噬細胞，穩(wěn)定斑塊中以M2 型巨噬細胞為主，不穩(wěn)定斑塊中以M1 型巨噬細胞為主［3］。綜上，巨噬細胞及其極化狀態(tài)對斑塊的穩(wěn)定性具有重大影響，以極化為切入點可能是治療動脈粥樣硬化的有效途徑。因此，本文從巨噬細胞表型、巨噬細胞極化對斑塊的影響以及表型機制調節(jié)等方面進行綜述。

1 巨噬細胞極化

巨噬細胞極化主要受微觀環(huán)境影響，不同刺激可導致巨噬細胞向不同表型轉化。目前主要將巨噬細胞分為兩大類，即促炎M1 型及抗炎M2 型，前者由Th1 細胞因子誘導，后者由Th2 細胞因子誘導［4］。兩種細胞亞型功能、表面標志物、趨化因子等方面各不相同（表1）。

表1 巨噬細胞不同表型及其特點Tab.1 Phenotypes and characteristics of macrophage

M1 型巨噬細胞主要發(fā)揮促炎作用，能產生TNF-α、IL-6 等炎癥因子及CXCL9、CXCL10 等標志物［5］。M1 型巨噬細胞還能產生活性氧、一氧化氮合酶等物質，誘導組織損傷并阻礙傷口愈合［6］。

M2 型巨噬細胞可進一步分化為M2a、M2b、M2c、M2d 4 種亞型。M2a 巨噬細胞由IL-4、IL-13 誘導，具有組織重塑、內吞功能；M2b 巨噬細胞由免疫復合物與IL-1β 或脂多糖聯合誘導，主要發(fā)揮免疫調節(jié)作用；M2c 巨噬細胞由IL-10、TGF-β 或糖皮質激素誘導，發(fā)揮細胞外吞作用；M2d巨噬細胞由TLR以及腺苷A2A受體激動劑共同誘導［5，12-13］。所有M2型巨噬細胞均能發(fā)揮一定抗炎效應，主要表現為IL-12 低表達、IL-10 和TGF-β 高表達，但每種亞型都有其特定標志物，并表現不同特性（表1）。

除M1、M2型巨噬細胞外，近年又陸續(xù)發(fā)現了其他不同亞型巨噬細胞，如M（Hb）、Mhem、Mox、M4等，其中Mhem 是對HA-mac 重新定義的結果，具有抑制氧化應激、抗炎效果（表1）［14-21］。

2 不同表型巨噬細胞在斑塊中的定位

動脈粥樣硬化往往伴隨炎癥反應，炎癥因子可刺激巨噬細胞分泌MMP-2和MMP-9，降解細胞外基質，影響纖維帽厚度，從而影響斑塊穩(wěn)定［22］。此外，研究發(fā)現，ApoE-/-MMP10-/-小鼠斑塊中M1 型巨噬細胞極化標志物IL12a、NOS2和TNF-α表達減少，小鼠炎癥程度較低，斑塊表型更穩(wěn)定［23］。隨著對斑塊的深入研究發(fā)現，斑塊中存在不同巨噬細胞表型，且存在分布差異。斑塊中M1、M2 型巨噬細胞數量均較外周正常組織明顯增多。CHO等［3］在此基礎上進一步研究斑塊中巨噬細胞分型，發(fā)現穩(wěn)定斑塊中M2 型呈高分布，而不穩(wěn)定斑塊中以M1 型居多。與M2型相比，M1型多分布于內膜易破裂的肩部區(qū)，M1型巨噬細胞增多促進斑塊破裂，導致血栓形成。

3 不同巨噬細胞表型對斑塊的影響

3.1 M1 和M2 巨噬細胞 剪切力、維生素D 受體、LPS、IFN-γ 等均可誘導巨噬細胞向M1 型極化，并釋放促炎因子如IFN-γ、IL-1β、TNF-α。炎癥因子可破壞內皮細胞，促進平滑肌細胞、巨噬細胞凋亡，凋亡細胞堆積形成脂核，進一步加速斑塊形成［7-8］。另外，研究證實M1型巨噬細胞釋放的促炎因子TNF-α在動脈斑塊中高表達，尤其在不穩(wěn)定斑塊內膜與中膜［24］。研究發(fā)現，動脈粥樣硬化病變中的M1 型巨噬細胞通過活化NF-κB 信號通路增加C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）表達，且斑塊中M1 型巨噬細胞數與CRP 水平呈正相關［15］。因此，誘導巨噬細胞從M1 型向M2 型轉變或許可減少CRP 的有害作用，并減緩粥樣硬化斑塊中的炎癥反應。與M1 型巨噬細胞相反，M2 型巨噬細胞分泌的IL-10 等抑炎因子能增強斑塊穩(wěn)定性［25］。LIU 等［26］取頸動脈斑塊患者和正常人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分化為巨噬細胞，檢測兩組PBMCs 源巨噬細胞基因表達差異，結果表明，與正常組比較，頸動脈斑塊患者低表達LXRα，進一步過表達LXRα 發(fā)現，M2 型標志物CD163、CD206、Arg1表達升高，M1型標志物TNF-α、IL-6、IL-10表達降低。提示LXRɑ過表達促使PBMCs源巨噬細胞向M2型極化。

3.2 M4、Mox、Mhem、M（Hb）型巨噬細胞 研究者發(fā)現了與斑塊穩(wěn)定相關的M4 型巨噬細胞，這種表型的巨噬細胞由血小板趨化因子CXCL4 誘導［20］。OKSALA 等［21］進一步研究發(fā)現，人頸動脈斑塊中所有M4 巨噬細胞標志物均與MMP12和組蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）相關。表明M4 巨噬細胞可能是HDAC9和MMP-12在晚期人類斑塊中表達的來源。

KADL 等［18］在小鼠斑塊中發(fā)現了Mox 型巨噬細胞，與傳統的M1 或M2 表型相比，這種巨噬細胞由氧化磷脂誘導，顯示出弱的吞噬能力和趨化特性，氧化還原調節(jié)的轉錄因子Nrf2 參與調控其形成過程。這種類型巨噬細胞主要通過上調Nrf2、增加Hmox1 蛋白表達及轉錄、膜鐵轉運蛋白（FPN）轉錄引起鐵潴留，從而促進動脈粥樣硬化發(fā)展［19］。血紅素（hemoglobin，Hb）刺激的巨噬細胞也稱為M（Hb）型巨噬細胞，這種巨噬細胞高表達MR/CD163［14］。FINN 等［14］發(fā)現，與泡沫細胞相比，M（Hb）型巨噬細胞內脂質沉積明顯減少。同時，M（Hb）型巨噬細胞內含鐵量減少，促使ROS減少，進一步使LXRα受體驅動膽固醇外排基因ABCA1表達增加，最終增加膽固醇外排，延緩動脈粥樣硬化發(fā)展，與Mox型巨噬細胞鐵表型促進鐵潴留和脂質累積恰恰相反。另一種巨噬細胞——斑塊出血區(qū)的Mhem 細胞可通過轉錄激活因子1（transcription factor 1，ATF-1）影響動脈粥樣硬化發(fā)展。如BOYLE 等［15］指出斑塊內出血區(qū)的HA-mac/Mhem共表達p-ATF-1、HO-1 以及LXR 的靶基因ApoE 和ABCA1，減少泡沫細胞變化，從而減輕斑塊內出血。

綜上，巨噬細胞極化與微環(huán)境緊密相關，極化狀態(tài)以及極化后的分布對斑塊穩(wěn)定性尤為重要。因此，治療動脈粥樣硬化時可通過調節(jié)M1/M2 型巨噬細胞比例使巨噬細胞向M2 型極化，或誘導巨噬細胞向其他增加斑塊穩(wěn)定性的表型分化，延緩動脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生。此外，雖然M1 型及M2 型巨噬細胞對動脈粥樣硬化的作用已明確，但M2 型巨噬細胞各亞型在動脈粥樣硬化中的作用及具體機制還有待闡明。

4 巨噬細胞極化的調節(jié)機制

4.1 miRNAs miRNAs是一種小的、內源性的非編碼RNA，長度為22～26 個核苷酸，廣泛參與癌癥、肥胖、動脈粥樣硬化等多種疾病發(fā)生發(fā)展［27］。研究表明miR-33、miR-155、miR-223、miR-27 等均可影響巨噬細胞極化［28-31］。NAZARI-JAHANTIGH 等［31］研究發(fā)現，miR-155 在動脈粥樣斑塊及促炎型巨噬細胞中上調，進一步研究發(fā)現miR-155 通過抑制轉錄因子BCL-6 表達促進NF-κB 信號轉導，增加趨化因子CCL2 表達，促進動脈粥樣硬化發(fā)展。DONNERS等［32］將miR155-/-及野生型小鼠骨髓移植到LDLR-/-小鼠中，研究miR-155對動脈粥樣硬化的作用，結果發(fā)現，與正常組相比，miR-155-/-組小鼠斑塊面積增大，血脂水平升高，且動脈粥樣病變處中性粒細胞、巨噬細胞增加，T 細胞減少，提示miR-155 具有抗動脈粥樣硬化作用。OUIMET 等［30］為研究miR-33 與巨噬細胞炎癥的關系，將骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）分別用IFN-γ/LPS或IL-4處理24 h后檢測miR-33水平，結果顯示，與M2 型相比，M1 型巨噬細胞miR-33表達更高，提示miR-33 可能參與巨噬細胞M1 型極化，進一步過表達miR-33 后發(fā)現，M1 型巨噬細胞標志物（如IL-6、NOS2 和IL-1β）轉錄水平升高，同時M2 型巨噬細胞標志物CD206 和Fizz1/Retnla 轉錄水平降低。

miR-216a 可通過靶向Smad/NF-κB 信號通路發(fā)揮促炎作用［33］。YANG 等［34］在此基礎上研究miR-216a對巨噬細胞極化的影響，發(fā)現miR-216a能夠通過Smad/NF-κB 信號通路誘導巨噬細胞中端粒酶激活，并促進巨噬細胞向M1 型極化。由此看來，靶向miR-216a 開展治療對穩(wěn)定斑塊、治療動脈粥樣硬化或將起到積極作用。

4.2 轉錄因子 STAT6作為STAT家族成員在細胞分化和細胞因子產生中發(fā)揮重要作用［35］。據報道，高脂喂食ApoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化模型后，易損斑塊中CD86、iNOS 表達升高，Arg-1、TGF-β 表達降低。進一步研究發(fā)現，易損斑塊中STAT6 及磷酸化STAT6 表達降低，穩(wěn)定斑塊中STAT6 及M2 型標志物CD163上升［36］。STAT6在動脈粥樣化中的作用在其他報道中也得到了證實。王凌等［37］研究脂連蛋白對動脈粥樣硬化小鼠的作用，發(fā)現脂連蛋白可能通過上調p-STAT6 表達誘導脂肪組織巨噬細胞M2型極化，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

糖原合酶激酶-3α（glycogen synthase kinase-3α，GSK-3α）參與糖原合酶合成及細胞增殖、分化［38］。MCALPINE 等［39］建 立 了 骨 髓 特 異 性 敲 除GSK3α（LMαKO）的LDLR-/-小鼠模型，結果表明，LMαKO小鼠巨噬細胞中GSK3α 缺失可顯著增強STAT3 和STAT6 磷酸化，最終減弱M1 型標志物CD36 表達，同時促進M2 型標志物Arg-1、Pgc1 表達，提示巨噬細胞GSK3α對斑塊的穩(wěn)定可能有影響。

轉錄因子Mafb 屬于Maf 家族，Mafb 在造血骨髓細胞中高表達，對單核巨噬細胞譜系建立和維持起重要作用［40］。KIM 等［41］通過慢病毒技術將Mafb 導入小鼠骨髓來源巨噬細胞，檢測不同表型巨噬細胞標志物表達，結果發(fā)現Mafb 抑制M1 型巨噬細胞標志物表達，促進M2 型標志物表達，進一步研究表明，Mafb 通過IL-4/STAT6 通路調節(jié)巨噬細胞向M2型極化，在RAW264.7 巨噬細胞中也得出了同樣結果，提示Mafb 可能對動脈粥樣硬化斑塊進展起保護作用。其他轉錄因子如同源盒A5（homeobox A5，HOXA5）是同源盒轉錄因子之一，與巨噬細胞表型轉換密切相關［41］。最近研究證實HOXA5 通過激活頸動脈轉錄輔激活子1（mediator subunit 1，MED1）促進動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞向M2 型轉換，延 緩 動 脈 粥 樣 硬 化 進 展［42］。Krüppel 樣 因 子4（KLF4）是一種鋅指轉錄因子，屬于KLF4 轉錄因子家族。已有研究表明KLF4 可調節(jié)巨噬細胞極化［43］。LIAO 等［44］研究卡利司汀（KS）這種組織激肽酶結合蛋白和絲氨酸蛋白酶抑制劑時，發(fā)現KS通過激活KLF4 調節(jié)巨噬細胞M1/M2 比例延緩ApoE-/-小鼠斑塊形成速度。

4.3 核受體 過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）是核激素受體家族中的配體激活受體，具有抗炎活性［45］。研究表明，PPAR-γ 能促進單核細胞向M2 型巨噬細胞分化［46］。此外，也有研究發(fā)現瑞舒他汀通過激活PPAR-γ 促進人外周血單核細胞中M2 型標志物CD206、IL-10、CCL18 表達增加，從而治療動脈粥樣硬化［47］。

NR4A 家族核受體Nurr1、Nur77 和NOR1 在人動脈粥樣硬化病變的巨噬細胞中表達［48-49］。研究表明，LDLR-/-小鼠中Nur77缺失可促進巨噬細胞向M1型極化，從而導致動脈粥樣硬化病變增加［49］。NOR1 高表達于人動脈粥樣斑塊中CD68+CD206+（M2 型巨噬細胞）富集區(qū)域，沉默NOR1 后，M2 型標志物CD206、IL-1Ra、CD200R、F13A1、IL-10 水平降低。另外，全基因組芯片分析顯示，在M2 巨噬細胞中沉默NOR1后，MMP-9上調較為明顯。提示NOR1可誘導人巨噬細胞向M2 型轉化，并通過調控MMP-9影響斑塊穩(wěn)定性。

4.4 硫氧還原蛋白 Thioredoxin-1（Trx-1）是一種分子量為12 kD、高度保守的氧化應激抑制蛋白，具有抑炎、抗凋亡等作用［50］。Trx-1 能減少過氧化，下調IL-4 刺激的巨噬細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p16INK4a 表達，或在LPS 誘導的巨噬細胞中降低AP-1 和Ref-1 表達，最終調節(jié)巨噬細胞向M2型極化。動物實驗表明，Trx-1 與M2 型巨噬細胞共定位于動脈粥樣硬化病變部位，顯著減緩動脈粥樣硬化病變，提示Trx-1 可通過調節(jié)巨噬細胞向M2 型極化延緩動脈粥樣硬化發(fā)展［51］。近年Trx-1 的截短形式Trx-80對動脈粥樣硬化的作用也有研究。Trx-80是由1～80 或1～84 個N-端氨基酸組成的C 端截短形式，具有細胞激酶樣活性，被未知的酶在細胞表面切割，具有細胞因子樣活性［52］。據報道，巨噬細胞會切割全長Trx-1 產生Trx-80。MAHMOOD 等［53］證實Trx-80 可促進M1 型巨噬細胞分化并促進動脈粥樣硬化發(fā)展。

4.5 KCa3.1 通道 KCa3.1 即中間電導鈣激活鉀通道，是信號級聯的一部分，在許多免疫細胞（包括T細胞、B細胞、小膠質細胞和巨噬細胞）活化、增殖、細胞因子分泌和體積調節(jié)過程中調控相對全局和長時間的鈣升高［54］。RENDE 等［55］為探究KCa3.1通道在巨噬細胞極化中的作用及其與動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的關系，采用聯合結扎ApoE-/-小鼠左腎動脈和左頸總動脈的方法建立斑塊不穩(wěn)定模型，發(fā)現在人單核細胞向巨噬細胞分化過程中，KCa3.1表達顯著上調，阻斷KCa3.1可抑制STAT-1磷酸化，顯著降低巨噬細胞極化過程中促炎基因表達，抑制巨噬細胞向M1型分化，動物模型中，KCa3.1阻斷治療可顯著降低與M1 巨噬細胞極化相關標志物表達，增強動脈粥樣硬化病變中M2 型標志物表達，降低頸動脈斑塊破裂和管腔血栓發(fā)生率。

4.6 免疫蛋白酶體 26S 蛋白酶體復合物是UPS的蛋白水解中心，通常由3個催化亞基β1（PSMB6）、β2（PSMB7）和β5（PSMB5）組成，LMP10 是β2 受炎癥刺激后的誘導形式［56］。研究報道，LMP10 缺失顯著降低了主動脈巨噬細胞浸潤，M2/M1 升高，同時促炎M1 細胞因子MCP-1、IL-1 和IL-6 表達降低，抗炎M2 細胞因子IL-4 和IL-10 表達增加，斑塊壞死核心面積明顯減少［57］。ox-LDL 誘導的體外泡沫細胞形成過程中，LMP10 缺失減弱了巨噬細胞極化和炎癥，與IκBα降解和NF-κB激活降低有關。免疫蛋白酶體亞基LMP10 可能通過調節(jié)NF-κB 介導的巨噬細胞極化和炎癥，促進飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化。靶向LMP10 可能是動脈粥樣硬化的治療方法。

4.7 HIF-1α/PDK4途徑 最近研究發(fā)現，晚期糖基化終產物刺激巨噬細胞極化后會促進動脈粥樣硬化發(fā)展。其中缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）是調節(jié)葡萄糖代謝的兩種關鍵蛋白。進一步研究發(fā)現，糖尿病ApoE-/-小鼠頸動脈中AGEs 表達和M1 巨噬細胞數量增加，此外，AGE-牛血清白蛋白通過HIF-1α/PDK4 軸誘導RAW264.7向M1型轉化［10］。因此，靶向巨噬細胞的HIF-1α 或PDK4降低M1型巨噬細胞表達，可能有助于糖尿病動脈粥樣硬化治療。

4.8 其他 SIRT2 是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，參 與 調 節(jié) 巨 噬 細 胞 極 化。ZHANG 等［58］用 雌 性LDLR-/-小鼠研究SIRT2 對動脈粥樣硬化的作用，發(fā)現SIRT2 能抑制LDLR-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊進展和增強斑塊穩(wěn)定性，其作用與抑制巨噬細胞向M1型轉化有關。

高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）能夠清除細胞中多余的膽固醇，對動脈粥樣硬化起保護作用。SANSON等［59］用IL-4及HDL聯合IL-4分別處理小鼠原代巨噬細胞，發(fā)現HDL、IL-4 共處理組M2 型標志物Arg-1 和Fizz-1 轉錄水平更高，iNOS、IFN-γ 轉錄水平降低。進一步提取STAT6-/-小鼠巨噬細胞檢測各組轉錄水平，發(fā)現IL-4 或HDL 作用被抑制［58］。說明HDL 增加M2 型標志物表達、發(fā)揮抗炎作用需要STAT6參與。

肝 細 胞 生 長 因 子（hepatocyte growth factor，HGF）也稱肝細胞生長素，廣泛表達于各種組織和細胞，具有保護血管內皮細胞、抗炎、抗凋亡等作用。張亮等［60］用新西蘭兔建立動脈粥樣硬化模型研究HGF 對巨噬細胞表型及斑塊穩(wěn)定性的影響，發(fā)現與模型組相比，HGF 可抑制M1 型巨噬細胞浸潤，誘導M2 型巨噬細胞分化，增加斑塊膠原纖維和VSMCs含量，增強斑塊穩(wěn)定性，延緩動脈粥樣硬化發(fā)展。但HFG 如何促進M1 型向M2 型轉化的機制有待進一步研究。

5 小結

綜上，巨噬細胞極化狀態(tài)，尤其是M1/M2 比例對斑塊的穩(wěn)定性影響重大。研究已證實一定條件下，使M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞轉換有利于提高斑塊穩(wěn)定性，但M2 型中不同亞型細胞對斑塊的作用是否一致還不明確，相關機制也有待進一步研究。此外，巨噬細胞其他表型如M4、Mox、Mhem、M（Hb）型均與斑塊穩(wěn)定性相關（圖1）。鑒于巨噬細胞的可塑性及其在動脈粥樣硬化中的關鍵作用，以巨噬細胞表型調控為切入點或許能為動脈粥樣硬化靶向治療或新藥研發(fā)提供新的思路。

圖1 巨噬細胞不同表型對斑塊的作用Fig.1 Effects of different phenotypes of macrophages on plaque