肖金枝,余 偉,張 昊

口腔癌是頭頸部最常見的一種惡性腫瘤,其中90%的患者病理診斷為口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)[1-2]。目前,多數(shù)患者接受以手術(shù)為主,聯(lián)合放化療的治療方案[3]。但因口腔癌高惡性、易復(fù)發(fā)、易引起其他臟器受損等問題[4],患者的5年生存率僅為50%～70%[2-3]?；熓禽o助腫瘤治療的重要手段,但其在治療過程中會產(chǎn)生許多不良后果,其中化療藥物的耐藥性是困擾臨床工作者的一大難題,克服耐藥性是一項艱巨的挑戰(zhàn)[5]。有文獻(xiàn)指出一些化療藥物治療多種腫瘤時可發(fā)生細(xì)胞的自噬。自噬是細(xì)胞死亡的一種方式,其能幫助細(xì)胞自我降解,參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝平衡,在腫瘤中發(fā)揮著雙重作用,且有報道指出其與口腔鱗狀細(xì)胞癌密切相關(guān)[6-8]。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展,人們對中醫(yī)藥的研究逐漸深入,因其具有易提取、毒性低、抑制腫瘤生長等優(yōu)勢,目前已有多種中藥應(yīng)用于抗腫瘤治療[9]。鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride,BH)是源于中草藥黃連的一種生物堿[10],目前多用于消炎殺菌,但有文獻(xiàn)報道其能抑制多種腫瘤[11-12]。本實驗通過探究鹽酸小檗堿對口腔鱗癌Cal-27細(xì)胞增殖及自噬的影響,為將來鹽酸小檗堿用于口腔癌治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人口腔鱗癌Cal-27細(xì)胞(豐暉生物,中國);鹽酸小檗堿(源葉生物,中國);高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS以及胰蛋白酶(Hyclone,美國);CCK-8檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液(碧云天,中國);瑞氏-吉姆薩染液、一抗(PCNA、Beclin-1、LC3B、β-actin)、二抗(博士德生物,中國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人口腔鱗狀細(xì)胞癌Cal-27細(xì)胞在適宜條件下置于高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至一定程度時,對其進(jìn)行傳代,取活性、形狀良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 藥物配制 溶劑:DMSO及PBS溶液,利用溶劑與鹽酸小檗堿融合形成母液,且保證DMSO溶劑濃度低于0.1%,將藥物分裝后置于-20 ℃避光儲存。

1.2.3 CCK-8實驗 藥物濃度分組:對照組(0),鹽酸小檗堿組(60、90、120、240 μmol/L)。選狀態(tài)良好的Cal-27細(xì)胞,在96孔板中設(shè)計平行復(fù)孔,每孔的細(xì)胞數(shù)目為8×103個,過夜培養(yǎng)后,加入藥物。藥物作用24、48、72 h后,避光吸棄上清,加入CCK-8試劑后,培養(yǎng)箱中1 h進(jìn)行孵育。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的OD值,收集3次有效數(shù)據(jù)。計算細(xì)胞存活率及IC50。根據(jù)IC50選擇適宜濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。為了進(jìn)一步闡明鹽酸小檗堿是否通過調(diào)節(jié)自噬從而抑制Cal-27細(xì)胞的增殖,使用CCK-8實驗篩選適宜濃度的自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)進(jìn)行后續(xù)實驗。設(shè)置分組:對照組(0),單獨藥物組(90 μmol/L BH),雷帕霉素組(50 nmol/L RAPA)以及鹽酸小檗堿+雷帕霉素共同處理組(90 μmol/L BH+50 nmol/L RAPA)。

1.2.4 單克隆形成實驗 在6孔板中的每孔中鋪數(shù)目為4×105個細(xì)胞,放于培養(yǎng)箱。細(xì)胞長至75%～80%時,分別加入0、60、90、120、240 μmol/L濃度的鹽酸小檗堿培養(yǎng)液。6 h后,消化,再以1×103個/孔種在6孔培養(yǎng)板中,4 d一換液。2個星期后,室溫下輕柔地加入PBS溶液,晃動6孔板(1 min),棄掉清洗液,反復(fù)3次后,固定液固定(15～30 min),棄去溶液,每孔加入瑞氏-吉姆薩A、B溶液,兩者混勻,染色3～5 min。沖洗干凈,晾干,拍照,計數(shù)分析。

1.2.5 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 將4×105個Cal-27細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,給予不同濃度鹽酸小檗堿處理24 h,提取總蛋白,測濃度,變性,分裝,貯藏于-20 ℃。室溫下制備SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)膜,封閉2 h,一抗4 ℃(Anti-PCNA 1∶2 000,Anti-Beclin-1 1∶1 000,anti-LC3B 1∶500)過夜孵育。次日洗膜3次。室溫下二抗(1∶5 000)孵育2 h,再次清洗。顯影,分析蛋白結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 鹽酸小檗堿對Cal-27細(xì)胞活性的影響

如圖1所示,隨著鹽酸小檗堿濃度的提高,Cal-27細(xì)胞存活率逐漸降低。表明鹽酸小檗堿對Cal-27細(xì)胞的抑制呈濃度依賴性(圖1A)。根據(jù)實驗結(jié)果算出24 h的IC50為(92±10)μmol/L。

同一時間下,不同濃度鹽酸小檗堿對Cal-27細(xì)胞活性影響的量化圖。與同時段對照組(0 μmol/L)相比,Tukey檢驗,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.0001

2.2 鹽酸小檗堿對克隆形成能力的影響

如圖2所示,隨著藥物濃度的提高,Cal-27細(xì)胞集落形成的數(shù)目逐漸降低(圖2A、B)。當(dāng)藥物濃度逐漸上升至240 μmol/L時,Cal-27細(xì)胞培養(yǎng)14 d后幾乎無集落形成,說明鹽酸小檗堿抑制了Cal-27細(xì)胞的增殖能力。

A:Cal-27細(xì)胞培養(yǎng)14 d平板克隆形成結(jié)晶紫染色圖(相機拍照,96 dpi);B:克隆數(shù)目量化圖;與對照組(0 μmol/L)相比,Tukey檢驗,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.3 鹽酸小檗堿對Cal-27細(xì)胞增殖及自噬相關(guān)蛋白的影響

其影響如圖3所示(圖3A),與對照組相比,隨著鹽酸小檗堿濃度的提高,PCNA的蛋白量化值逐漸降低(圖3B);Beclin-1蛋白量化值及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值也逐漸降低(圖3C、D),說明鹽酸小檗堿抑制Cal-27細(xì)胞的增殖及自噬。

A:Western Blot實驗檢測細(xì)胞PCNA、Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況;B:PCNA蛋白相對表達(dá)量量化圖;C:Beclin-1蛋白相對表達(dá)量量化圖;D:LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達(dá)量量化圖。與對照組(0 μmol/L)相比,Tukey檢驗,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.000 1

2.4 鹽酸小檗堿抑制細(xì)胞自噬與抑制Cal-27細(xì)胞增殖的關(guān)系

如圖4所示,CCK-8結(jié)果示濃度為50 nmol/L的RAPA對Cal-27細(xì)胞的毒性較小(圖4A)。與對照組相比,單獨藥物組(90 μmol/L BH)對Cal-27細(xì)胞的活性具有抑制作用,而當(dāng)鹽酸小檗堿與雷帕霉素(90 μmol/L BH+50 nmol/L RAPA)共同處理后,Cal-27細(xì)胞的活性稍有提升(圖4B)。

A:雷帕霉素對Cal-27細(xì)胞活性影響的量化圖;B:鹽酸小檗堿與雷帕霉素分別及共同作用后對Cal-27細(xì)胞活力影響的量化圖;與對照組相比,Tukey檢驗,**:P<0.01,****:P<0.000 1;與RAPA相比,Tukey檢驗,####:P<0.0001;ns:無統(tǒng)計學(xué)差異

克隆形成實驗可以明顯看出,單獨藥物組(90 μmol/L BH)對Cal-27細(xì)胞的克隆形成能力具有明顯的抑制作用,而鹽酸小檗堿與雷帕霉素(90 μmol/L BH+50 nmol/L RAPA)共同處理后,Cal-27細(xì)胞集落形成的數(shù)目多于單獨藥物組,說明RAPA逆轉(zhuǎn)了鹽酸小檗堿對Cal-27細(xì)胞增殖的抑制作用(圖5A、B)。

A:加入雷帕霉素后,Cal-27細(xì)胞培養(yǎng)14 d平板克隆形成結(jié)晶紫染色圖(相機拍照,96 dpi);B:其克隆數(shù)目量化圖;與對照組相比,Tukey檢驗,***:P<0.001,****:P<0.000 1。與RAPA相比,Tukey檢驗,##:P<0.01,####:P<0.000 1;與BH相比,Tukey檢驗,△:P<0.05

為進(jìn)一步探究鹽酸小檗堿抑制Cal-27細(xì)胞的增殖與其自噬是否有關(guān)聯(lián),我們又進(jìn)行了蛋白印跡實驗。其結(jié)果顯示(圖6A),與單獨藥物組相比,加入雷帕霉素的共同處理組,PCNA的表達(dá)增多(圖6B),并且Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)也增多(圖6C、D)。說明鹽酸小檗堿是通過抑制自噬從而抑制Cal-27細(xì)胞的增殖。

A:Western Blot實驗檢測細(xì)胞PCNA、Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況;B:PCNA蛋白相對表達(dá)量量化圖;C:Beclin-1蛋白相對表達(dá)量量化圖;D:LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達(dá)量量化圖;與對照組(control)相比,Tukey檢驗,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.000 1;與BH相比,Tukey檢驗,△:P<0.05,△△:P<0.01,△△△:P<0.001

3 討 論

口腔鱗癌是頭頸部癌的一種主要亞型,與煙草、酒精和HPV等風(fēng)險因素有關(guān),是全球最常見的12種癌癥之一,并且危及生命[3]。其中化療藥物的耐藥性是患者生存率低的主要因素之一。

近年來,中醫(yī)藥在抗腫瘤領(lǐng)域逐漸成為焦點,因其介入可以降低腫瘤治療的不良反應(yīng),提高患者生活水平,并且還具有多種靶點、多條途徑、多類效應(yīng)等優(yōu)勢,逐漸成為臨床抗腫瘤的一線藥物[13]。先前有研究表明,鹽酸小檗堿這類藥物可作為抗腫瘤藥[14-15],對胃癌[16]、乳腺癌[17]、鼻咽癌等具有抑制作用[12,18-19]。

本研究通過體外CCK-8實驗、克隆形成實驗證實一定濃度的鹽酸小檗堿對口腔鱗癌Cal-27細(xì)胞活力有明顯抑制作用。并通過Western Blot實驗檢測出鹽酸小檗堿刺激Cal-27細(xì)胞后,增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量逐漸降低,進(jìn)一步說明其對細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。此外,有研究學(xué)者已證實當(dāng)鹽酸小檗堿作用于人口腔鱗狀細(xì)胞癌時能夠抑制細(xì)胞的增殖,這與本研究的結(jié)果一致,但作者尚未對其作用機制深入研究[20]。

自噬是一種細(xì)胞代謝的途徑,是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控者。同時在過去的10年中,自噬已成為腫瘤研究中重要角色,參與腫瘤抑制和腫瘤發(fā)展[21]。其中Beclin-1是自噬的關(guān)鍵調(diào)控基因,在自噬體成熟過程中起作用。而LC3B是自噬的關(guān)鍵蛋白家族之一,其獨特性在于能夠定位于自噬泡膜內(nèi)[22]。且LC3B的表達(dá)水平反映著細(xì)胞自噬的發(fā)生是受到抑制或誘導(dǎo)[23]。近年有學(xué)者指出自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B可與OSCC患者預(yù)后有著密切的聯(lián)系[23-25]。目前,關(guān)于鹽酸小檗堿對自噬作用的研究較少,我們通過Western Blot實驗檢測自噬標(biāo)志物Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的表達(dá),發(fā)現(xiàn)單獨藥物組LC3Ⅱ/Ⅰ比值以及Beclin-1的表達(dá)量與對照組比較顯著下調(diào),表明自噬體的形成逐漸降低,說明鹽酸小檗堿能夠抑制Cal-27細(xì)胞的自噬效應(yīng)。為了進(jìn)一步探究鹽酸小檗堿能否通過抑制自噬從而抑制Cal-27細(xì)胞增殖,我們加入自噬激活劑RAPA后,發(fā)現(xiàn)與單獨藥物組相比,共同處理組抑制Cal-27細(xì)胞增殖及自噬的效果減弱,即RAPA逆轉(zhuǎn)了鹽酸小檗堿對Cal-27細(xì)胞自噬及增殖的抑制作用,表明鹽酸小檗堿可通過抑制細(xì)胞自噬從而抑制增殖。

基于自噬調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖的具體分子機制,既往已有多項研究對其進(jìn)行探索。有研究表明甘草素在體外作用于口腔癌細(xì)胞后,通過抑制AKT、mTOR的磷酸化使得PI3K/AKT/mTOR通路失活從而誘導(dǎo)自噬反應(yīng),進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長[26]。小檗堿作用于胃癌細(xì)胞后,阻斷MAPK/mTOR/p70S6K和AKT信號通路的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制其生長[27]。目前有較多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與增殖的主要信號通路之一,其中磷酸化的mTOR可影響自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),但鹽酸小檗堿是否通過介導(dǎo)這條信號通路發(fā)揮抑制Cal-27細(xì)胞自噬的作用,需要我們進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,本次實驗證實鹽酸小檗堿抑制口腔鱗癌Cal-27細(xì)胞的增殖和克隆形成,并且誘導(dǎo)抑制性自噬從而抑制增殖,但其具體機制尚未探究。本實驗為鹽酸小檗堿作為抗口腔癌藥物提供一定的依據(jù),為今后的研究提供新的思路。