曲尼色珍,周延民

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種內(nèi)源性合成的雙原子分子,具有自由基特性,存在于人體的各種組織和細(xì)胞中,參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程[1]。NO通常由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生[2],其中NOS包括內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)、神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS,nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS,iNOS)[3]。牙周炎作為常見的口腔疾病之一,其進(jìn)展與牙周病原體引起的免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)[4],其中iNOS的表達(dá)使炎癥牙周組織中產(chǎn)生高濃度NO。本文將對NO在牙周炎進(jìn)展及治療中的作用研究進(jìn)行綜述。

1 NO在牙周組織中的表達(dá)

NO是免疫系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮生理功能的重要調(diào)節(jié)劑,在人體內(nèi)少量存在,其生成過多與細(xì)胞凋亡/死亡和組織損傷有關(guān)[5]。作為一種內(nèi)皮源性信號因子,由eNOS和nNOS介導(dǎo)產(chǎn)生的低濃度NO在健康牙周組織血管擴(kuò)張、神經(jīng)信號傳遞、成骨細(xì)胞分化等生物過程中發(fā)揮信使/調(diào)節(jié)劑作用,并參與疼痛刺激的信號傳遞[6]。有研究表明,利用NOS抑制劑阻斷NO的生成可顯著抑制牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化并刺激其分化為脂肪細(xì)胞[7],并進(jìn)一步證明NO可能通過JNK/MAPK信號通路平衡PDLSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。

牙周炎癥反應(yīng)過程中,病原體及其釋放的外毒素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生iNOS,催化底物L(fēng)-精氨酸長時(shí)間產(chǎn)生大量NO,參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展[8]。在牙周炎初期,菌群失調(diào)使大量中性粒細(xì)胞被招募至牙周組織,CD11b表達(dá)上調(diào),同時(shí)iNOS等促炎因子表達(dá)顯著增多,高濃度NO作用于致病微生物及其產(chǎn)生的生物膜,發(fā)揮抗菌作用[9]。然而,長時(shí)間高濃度的NO會過度激活炎癥反應(yīng),并通過為細(xì)菌提供組織分解產(chǎn)物(如膠原蛋白肽和含血紅素化合物)等營養(yǎng)物質(zhì),引起炎癥和微生物菌群失調(diào),兩者協(xié)同并產(chǎn)生正反饋回路[10],導(dǎo)致牙周上皮破壞和骨丟失。在炎癥消退階段,NO可抑制白細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮及中性粒細(xì)胞募集[11]。已有研究表明,與健康對照組相比,慢性牙周炎患者齦溝液及唾液中NO水平顯著升高[12-14],并且唾液NO水平隨著炎癥加重而增加。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),診斷為牙齦炎和牙周炎的患者在進(jìn)行牙周治療后,唾液中NO水平降低;未經(jīng)治療患者NO表達(dá)持續(xù)保持在較高水平[15]。因此,NO作為一種生物標(biāo)志物,可用作檢驗(yàn)牙周狀態(tài)的指標(biāo)之一。目前已有學(xué)者研制出電化學(xué)傳感平臺及熒光探針,以實(shí)時(shí)監(jiān)測和準(zhǔn)確定量細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的NO,在牙周炎的早期診斷中極具潛力[16-17]。

2 NO促進(jìn)牙周炎發(fā)展的作用機(jī)制

2.1 細(xì)胞毒性作用

牙周組織和唾液中的NO是口腔通過非特異性免疫抵抗病原體的一部分。iNOS完全依賴于炎癥刺激表達(dá),一旦激活,iNOS會在數(shù)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)高水平NO:一方面NO可以結(jié)合還原血紅素a3,與O2競爭,對細(xì)胞色素氧化酶產(chǎn)生抑制,同時(shí)其反應(yīng)產(chǎn)物(包括過氧亞硝酸鹽、二氧化氮或亞硝基硫醇)可破壞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性,使線粒體通透性改變,從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞以及周圍的牙齦上皮細(xì)胞線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18];另一方面NO與超氧化物反應(yīng)形成的活性氮(reactive nitrogen species,RNS)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)可通過脂質(zhì)過氧化和脫氧核糖中嘌呤堿基、嘧啶堿基的化學(xué)改變等途徑造成細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)損傷[19],從而抑制牙周病原體的增殖,減輕感染。但局部ROS和RNS產(chǎn)生過量可導(dǎo)致組織內(nèi)氧化應(yīng)激,造成結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收,繼而引起牙齒松動(dòng)脫落[20]。

2.2 骨組織吸收

可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)是NO受體,NO可激活sGC,促進(jìn)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)產(chǎn)生[21-22],從而抑制破骨細(xì)胞黏附和酸分泌[23],并增加成骨細(xì)胞IL-6表達(dá),促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[24]。生理?xiàng)l件下,NO誘導(dǎo)的sGC活化確保了骨吸收和骨形成之間的平衡;而在牙周炎癥狀態(tài)下,β1-sGC被氧化,sGC對NO的敏感度下降[25],從而抑制NO-環(huán)鳥苷單磷酸(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)途徑[26],促進(jìn)破骨細(xì)胞性骨吸收陷窩出現(xiàn),成骨細(xì)胞活性受抑制,骨穩(wěn)態(tài)破壞,并隨著牙周炎發(fā)展,導(dǎo)致牙槽骨吸收,牙齒松動(dòng)移位,最終牙齒脫落,咀嚼功能下降。

2.3 軟組織破壞

軟組織降解主要是由纖維溶解酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等宿主酶引起[27],NO可介導(dǎo)MMP的活化和表達(dá)。研究表明,NO的反應(yīng)中間體過氧亞硝酸鹽和二氧化氮可激活中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8),導(dǎo)致牙齦組織中膠原纖維在牙周炎早期嚴(yán)重流失[28]。成纖維細(xì)胞在結(jié)締組織更新和傷口愈合中起著關(guān)鍵作用,高濃度NO可抑制成纖維細(xì)胞活性,使膠原蛋白合成減少,可能引起愈合受損,導(dǎo)致組織破壞與組織修復(fù)的不平衡。這種失衡狀態(tài)下,牙周軟組織破壞增加,牙周膜基質(zhì)及膠原纖維變性、降解,牙周膜間隙增寬,結(jié)合上皮向根方遷移,出現(xiàn)附著喪失形成牙周袋。

3 NO與牙周炎治療

NO與牙周炎密切相關(guān),低水平NO參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并介導(dǎo)生理過程,可促進(jìn)血管擴(kuò)張、參與糖酵解途徑調(diào)節(jié)骨合成代謝,有助于牙周軟組織的修復(fù)與牙槽骨的重建[29],但高水平NO可產(chǎn)生細(xì)胞毒性,促進(jìn)炎癥的進(jìn)展[30]。近年來,眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)聚焦在NO雙向作用上,提出了截然不同的兩種治療策略。一種觀點(diǎn)認(rèn)為可以通過遞送NO來實(shí)現(xiàn)抗菌抗炎作用[31],另一種則認(rèn)為應(yīng)通過抑制iNOS的產(chǎn)生從而降低NO濃度以阻斷炎癥的進(jìn)展。

3.1 外源性NO遞送

目前,NO供體化合物主要包括硝酸酯類、偶氮二醇烯鎓鹽類(NONOates)、S-亞硝基硫醇類(RSNO/SNO)、呋咱氮氧化物類、NO-金屬配合物類等,通過水凝膠、微/納米顆粒、3D打印支架等載體進(jìn)行外源性NO遞送[32]。供體釋放NO的持續(xù)時(shí)間是其發(fā)揮抗菌功效的主要決定因素。有研究證實(shí),與瞬時(shí)NO濃度相比,供體釋放的細(xì)胞內(nèi)總NO濃度對殺死牙周病原體更重要,瞬時(shí)NO濃度越低,NO總量越大,殺菌效果越好,細(xì)胞毒性作用越小[33]。低劑量NO與抗生素共同作用時(shí),NO通過增加細(xì)菌磷酸二酯酶活性,減少細(xì)胞內(nèi)第二信使和生物膜調(diào)節(jié)劑環(huán)二鳥苷單磷酸(c-di-GMP)水平,使細(xì)菌恢復(fù)浮游狀態(tài),提高細(xì)菌對于抗生素的敏感性,從而有助于清除細(xì)菌生物膜。NO供體與抗生素聯(lián)合使用已被證明有助于克服與細(xì)菌生物膜相關(guān)的耐藥性[34-35]。但NO的物理性質(zhì)常影響其在局部應(yīng)用:①NO半衰期極短,為0.09～2 s(取決于O2和活性生物分子的局部濃度);②NO以“按需”方式合成,并容易通過磷脂膜擴(kuò)散;③NO在其合成點(diǎn)附近發(fā)揮功能,通常迅速擴(kuò)散,擴(kuò)散范圍僅數(shù)百微米[36]。根據(jù)這些性質(zhì),目前已開發(fā)多種NO釋放方式,包括結(jié)合光活化、電荷切換或細(xì)菌靶向基團(tuán)等,并通過在聚合物框架內(nèi)封裝或偶聯(lián)NO供體來增加NO的儲存和遞送。Feura等[37]評估了釋放NO的羧甲基纖維素衍生物對浮游狀態(tài)牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌體外殺菌功效以及細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)這種釋放NO的聚合物濃度為4 g/L時(shí),能夠在2 h內(nèi)將兩種細(xì)菌活力降低99.9%,反映了NO的強(qiáng)效快速殺菌作用,該聚合物可作為針對牙周病原體的抗菌劑。此外有學(xué)者合成GNRs@mSiO2-SNO/ICG納米粒子[38],在808 nm的近紅外光照射下,金納米棒將光能轉(zhuǎn)化為熱能,SNO分子也會被熱激活,在牙周炎癥部位釋放NO,光動(dòng)力、光熱療法以及氣體治療共同發(fā)揮抗菌作用,炎癥小體NLRP3和Caspase-1 mRNA表達(dá)急劇減少,進(jìn)一步表明適當(dāng)濃度的外源性NO遞送可以抑制促炎因子的表達(dá)。

3.2 抑制iNOS產(chǎn)生

與其他NOS不同,iNOS催化產(chǎn)生NO的效率最高,可以達(dá)到其他合酶的1 000倍,主要分布在巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中,參與炎癥性疾病的病理生理過程。在牙周炎中,iNOS水平與組織破壞的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。因此通過調(diào)控iNOS活性進(jìn)而抑制NO釋放以干預(yù)牙周炎的發(fā)展也是主流觀點(diǎn)之一。Kim等[39]從銅藻中分離出的天然產(chǎn)物Epiloliolide通過下調(diào)牙齦卟啉單胞菌脂多糖激活的NLRP3,抑制了iNOS的表達(dá),降低局部NO濃度,低濃度NO可有效促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的增殖和遷移。有研究表明亞硒酸鈉和α-生育酚的聯(lián)合應(yīng)用可以顯著抑制牙周炎的進(jìn)展,其中亞硒酸鈉通過抑制NF-κB表達(dá)來減少iNOS,從而減輕硝化應(yīng)激造成的牙周組織損傷,同時(shí)牙齦組織中CD95的表達(dá)受到抑制,CD95作為外源性細(xì)胞凋亡途徑的重要受體,可能參與牙周病的發(fā)病機(jī)制[40]。利特庫巴寧A(LA)是一種新型異喹啉生物堿[41],LA可以通過NF-κB途徑顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎性巨噬細(xì)胞活化,降低iNOS等炎癥因子表達(dá)。此外,分子模擬對接表明活性LA通過來自N→O基團(tuán)的電荷與iNOS的GLU 371殘基產(chǎn)生相互作用,直接與iNOS蛋白結(jié)合,抑制巨噬細(xì)胞NO表達(dá),減少NO合成,從而抑制牙周炎進(jìn)展。一氧化碳也可以作為牙周病的宿主反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,通過抑制iNOS等促炎因子表達(dá),從而有助于防治牙周病[42]。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,NO在牙周炎進(jìn)展中具有雙重作用。作為一種脂溶性的氣體小分子,NO在生理情況下有助于牙齦疼痛的感知、保護(hù)組織免受感染,維持牙齦循環(huán)的內(nèi)穩(wěn)態(tài);病理情況下,菌斑微生物激活iNOS,釋放高濃度NO促進(jìn)細(xì)菌裂解、炎癥發(fā)展及組織破壞。但NO在口腔組織和口腔疾病中的作用機(jī)制、雙向作用的濃度閾值尚需進(jìn)一步研究。目前研究證明,在合適的濃度閾值之內(nèi),外源性NO的遞送有助于抑制牙周病原體的繁殖,介導(dǎo)菌斑生物膜的清除,有助于治療牙周炎。但當(dāng)局部NO濃度過高時(shí),抑制iNOS產(chǎn)生進(jìn)而減少NO產(chǎn)生也可以作為減緩牙周炎發(fā)展的有效方法。此外,NO作為一種生物標(biāo)志物,應(yīng)用潛力較大,在疾病進(jìn)展的早期診斷中起著重要作用。隨著科技的發(fā)展,對牙周組織內(nèi)中NO的定位定量檢測將成為現(xiàn)實(shí),屆時(shí)可以根據(jù)局部NO的濃度實(shí)現(xiàn)牙周炎早期診斷、及時(shí)治療的目標(biāo),以達(dá)到延緩炎癥進(jìn)展,促進(jìn)組織再生目的。