王 芳 胡潔瓊 馮彥虎 何 東 （蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化科，蘭州 730030）

胃癌是目前第四大常見腫瘤類型，也是癌癥死亡的第二大原因［1］。盡管胃癌治療方法有所改進，如手術(shù)、化療和放療，但這些傳統(tǒng)療法在降低胃癌病死率方面效果有限［2］。胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是多數(shù)胃癌相關(guān)死亡和復(fù)發(fā)的主要原因，嚴(yán)重影響療效［3］。此外，越來越多的證據(jù)表明，免疫逃逸對胃癌細(xì)胞存活和發(fā)展至關(guān)重要［4］。因此，尋找既能有效治療胃癌又能抑制腫瘤活動的藥物是臨床急需解決的問題。傳統(tǒng)癌癥治療會引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此，近幾十年來，植物化學(xué)物質(zhì)抗癌作用研究逐漸流行［5］。次烏頭堿（hypaconitine，HA）是烏頭中最重要的活性成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［6］。據(jù)報道，HA 可抑制肺癌A549 細(xì)胞黏附、遷移和侵襲，表明HA 具有抗癌作用［7］。但HA 對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、免疫逃逸的影響鮮有報道。研究顯示，激活環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶（cyclic GMPAMP synthase，cGAS）/干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）信號通路可抑制胃癌進展［8］。但HA能否通過調(diào)控cGAS/STING通路影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、免疫逃逸尚不可知。因此，本研究主要探討HA 對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、免疫逃逸的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 人胃癌細(xì)胞系BGC-823 購自上海美灣生物科技有限公司；人源NK 細(xì)胞購自上海繼和生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 HA 購自上海源葉生物科技有限公司；cGAS 抑制劑RU.521 購自美國MCE 公司；CCK-8 試劑盒購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；趨 化 因 子 配 體（chemokine ligand，CXCL）2、CXCL8 ELISA 試劑盒購自伊艾博（武漢）科技股份有限公司；兔源一抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-9、cGAS、STING、GAPDH、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將BGC-823 細(xì)胞、NK 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期BGC-823細(xì)胞，分為對照組（NC組）、HA低劑量組（HA-L 組）、HA 中劑量組（HA-M 組）、HA 高劑量組（HA-H 組）、RU.521（cGAS 抑制劑）組、HA-H+RU.521 組，參考文獻(xiàn)及前期預(yù)實驗結(jié)果，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組、RU.521 組BGC-823 細(xì)胞分別用2 μmol/L HA、4 μmol/L HA、8 μmol/L HA、1 μmol/L RU.521 處理24 h；HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì)胞用8 μmol/L HA 和1 μmol/L RU.521 同時處理24 h［7，9］；NC 組BGC-823 細(xì)胞為未經(jīng)任何處理的BGC-823 細(xì)胞。處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞或細(xì)胞上清用于后續(xù)實驗。將上述各組BGC-823 細(xì)胞置于Transwell 上室，分別與置于Transwell 下室的NK細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，共培養(yǎng)細(xì)胞體系依次命名為NC共培養(yǎng)組、HA-L 共培養(yǎng)組、HA-M 共培養(yǎng)組、HA-H 共培養(yǎng)組、RU.521 共培養(yǎng)組、HA-H+RU.521 共培養(yǎng)組，收集共培養(yǎng)的NK細(xì)胞用于NK細(xì)胞殺傷力鑒定。

1.2.2 CCK-8 檢測BGC-823 細(xì)胞增殖 將BGC-823 細(xì)胞以3×103個/孔接種于96 孔板并培養(yǎng)24 h，按照1.2.1 處理后，10 μl/孔加入CCK-8 試劑，37 ℃再孵育1.5 h，酶標(biāo)儀檢測處理0 h、24 h時450 nm處吸光度。

1.2.3 克隆形成實驗檢測BGC-823 細(xì)胞克隆形成能力 將各組BGC-823 細(xì)胞以500 個/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)14 d后4%多聚甲醛固定20 min，加入0.5%結(jié)晶紫溶液室溫染色20 min，拍攝照片并計算克隆形成率。

1.2.4 劃痕愈合實驗檢測BGC-823 細(xì)胞遷移 將各組BGC-823 細(xì)胞以3×105個/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度90%以上，采用200 μl 移液器吸管尖端在細(xì)胞表面劃痕，顯微鏡下對0 h 和24 h 劃痕進行拍照，并計算劃痕愈合率。

1.2.5 Transwell 測定BGC-823 細(xì)胞侵襲 將30 μl Matrigel 基質(zhì)膠均勻涂抹于Transwell 小室，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至基質(zhì)膠完全凝固。各組BGC-823細(xì)胞加入不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，稀釋后的細(xì)胞濃度為2×105個/ml。Transwell 上 室 加入100 μl 細(xì)胞，下室加入500 μl 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取出Transwell 小室，棉簽輕輕擦拭上層細(xì)胞，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照。

1.2.6 ELISA 檢 測BGC-823 細(xì) 胞 上 清 中CXCL2、CXCL8 水平 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書檢測BGC-823細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8水平。

1.2.7 檢測NK 細(xì)胞殺傷力［10］以NK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，BGC-823 細(xì)胞為靶細(xì)胞，將NK 細(xì)胞與BGC-823 細(xì)胞以1∶10 比例加入96 孔板孵育4 h，離心并收集50 μl 上清，加入新的96 孔板，加入50 μl 乳酸脫氫酶孵育30 min，50 μl 終止液孵育1 h，酶標(biāo)儀測量450 nm 處吸光度。NK 細(xì)胞殺傷力（%）=（實驗組OD 平均值-僅培養(yǎng)BGC-823 細(xì)胞時OD 平均值-僅培養(yǎng)NK 細(xì)胞時OD 平均值）/（BGC-823 細(xì)胞用10 μl 30%TritonX-100培養(yǎng)時OD 平均值-僅培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞時OD平均值）×100%。

1.2.8 Western blot 檢 測BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING 蛋白表達(dá) RIPA 裂解緩沖液提取BGC-823 細(xì)胞總蛋白，定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗PCNA（1∶2 000）、MMP-9（1∶2 000）、cGAS（1∶3 000）、STING（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000） 4 ℃孵育過夜，次日加入二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h，ECL 試劑觀察蛋白條帶顯色，Image J 軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進行多組間差異比較，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HA 對BGC-823 細(xì)胞增殖的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞OD450（24 h）、克隆形成率降低（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞OD450（24 h）、克隆形成率升高（P＜0.05）；與HA-H 組比較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì)胞OD450（24 h）、克隆形成率升高（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 各組BGC-823 細(xì)胞OD450（0 h、24 h）、克隆形成率比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of OD450 （0 h， 24 h） and clone formation rate of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

表1 各組BGC-823 細(xì)胞OD450（0 h、24 h）、克隆形成率比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of OD450 （0 h， 24 h） and clone formation rate of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

Clone formation rate/%47.75±2.13 41.12±1.811）33.58±1.611）2）19.95±0.841）2）3）58.86±2.271）35.54±2.064）Groups OD450 0 h 0.24±0.02 0.23±0.01 0.23±0.02 0.22±0.02 0.22±0.01 0.24±0.01 24 h 0.87±0.08 0.75±0.061）0.62±0.061）2）0.41±0.031）2）3）0.93±0.081）0.66±0.054）NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521

圖1 克隆形成實驗檢測BGC-823細(xì)胞克隆形成Fig.1 Clone formation assay detects BGC-823 cell clone formation

2.2 HA 對BGC-823 細(xì)胞遷移的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與HA-H組比較，HA-H+RU.521組BGC-823細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 各組BGC-823細(xì)胞劃痕愈合率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of scratch healing rates of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

表2 各組BGC-823細(xì)胞劃痕愈合率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of scratch healing rates of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

Scratch healing rates/%43.37±2.08 36.65±1.541）27.74±1.031）2）13.36±0.621）2）3）51.12±2.111）30.66±2.044）Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521

圖2 劃痕愈合實驗檢測BGC-823細(xì)胞遷移Fig.2 BGC-823 cell migration detected by scratch healing test

2.3 HA 對BGC-823 細(xì)胞侵襲的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞侵襲數(shù)減少（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞侵襲數(shù)增多（P＜0.05）；與HA-H 組比較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì) 胞 侵 襲 數(shù) 增 多（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 各組BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of invasion numbers of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

表3 各組BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of invasion numbers of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

Number of cell invasion/number 78.85±3.67 65.59±2.491）51.52±2.011）2）22.23±1.361）2）3）89.96±2.951）54.42±2.024）Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521

圖3 Transwell實驗檢測BGC-823細(xì)胞侵襲（×400）Fig.3 BGC-823 cell invasion detected by Transwell assay（×400）

2.4 HA 對BGC-823 細(xì)胞上清CXCL2、CXCL8 水平的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平降低（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平升高（P＜0.05）；與HA-H 組比 較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì) 胞 上 清 中CXCL2、CXCL8水平升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of CXCL2 and CXCL8 levels in supernatant of BGC-823 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

表4 各組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of CXCL2 and CXCL8 levels in supernatant of BGC-823 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

CXCL8 126.34±4.15 109.94±3.881）94.45±3.751）2）52.23±2.071）2）3）156.67±5.791）98.86±4.174）Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521 CXCL2 169.73±7.21 136.67±4.561）112.26±3.691）2）73.35±2.191）2）3）201.17±8.671）121.23±6.854）

2.5 HA 對共培養(yǎng)細(xì)胞體系NK 細(xì)胞殺傷力的影響 與NC 共培養(yǎng)組比較，HA-L 共培養(yǎng)組、HA-M 共培養(yǎng)組、HA-H 共培養(yǎng)組NK 細(xì)胞殺傷力增強（P＜0.05）；與NC 共培養(yǎng)組比較，RU.521 共培養(yǎng)組NK細(xì)胞殺傷力減弱（P＜0.05）；與HA-H共培養(yǎng)組比較，HA-H+RU.521 共培養(yǎng)組NK 細(xì)胞殺傷力減弱（P＜0.05），見表5。

表5 各共培養(yǎng)細(xì)胞體系中NK細(xì)胞殺傷力比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of NK cell lethality in various co-cultured cell systems （±s，n=6）

表5 各共培養(yǎng)細(xì)胞體系中NK細(xì)胞殺傷力比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of NK cell lethality in various co-cultured cell systems （±s，n=6）

Note：Compared with NC co-cultured group， 1）P＜0.05； compared with HA-L co-cultured group， 2）P＜0.05； compared with HA-M cocultured group， 3）P＜0.05； compared with HA-H co-cultured group， 4）P＜0.05.

NK cell lethality/%7.69±0.37 17.79±0.861）26.65±1.331）2）40.77±2.191）2）3）3.26±0.211）20.23±1.014）Groups NC co-cultured HA-L co-cultured HA-M co-cultured HA-H co-cultured RU.521co-cultured HA-H+RU.521 co-cultured

2.6 HA 對BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9 蛋 白 及cGAS-STING 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NC 組比 較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9 蛋白表達(dá)降低，cGAS、STING 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823細(xì)胞PCNA、MMP-9蛋白表達(dá)升高，cGAS、STING蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與HA-H 組比較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì)胞PCNA、MMP-9 蛋白表達(dá)升高，cGAS、STING 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖4、表6。

表6 各組BGC-823細(xì)胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.6 Comparison of protein expressions of PCNA， MMP-9， cGAS and STING in BGC-823 cells of each group （±s，n=6）

表6 各組BGC-823細(xì)胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.6 Comparison of protein expressions of PCNA， MMP-9， cGAS and STING in BGC-823 cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group， 2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-Hgroup， 4）P＜0.05.

Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521 PCNA/GAPDH MMP-9/GAPDH cGAS/GAPDH STING/GAPDH 0.22±0.02 0.32±0.031）0.46±0.031）2）0.85±0.071）2）3）0.10±0.011）0.35±0.024）1.72±0.19 1.36±0.151）1.05±0.091）2）0.67±0.051）2）3）2.06±0.181）1.21±0.104）1.06±0.12 0.83±0.081）0.64±0.061）2）0.32±0.031）2）3）1.51±0.161）0.71±0.064）0.31±0.03 0.43±0.031）0.78±0.061）2）1.21±0.141）2）3）0.21±0.021）0.59±0.054）

圖4 Western blot 檢 測BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detects PCNA， MMP-9， cGAS and STING protein expressions in BGC-823 cells

3 討論

胃癌是消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、病死率高的特點［11］。臨床治療胃癌的一線藥物毒性大、療效差［12］。因此，胃癌治療需要療效和安全性更好的新型藥物。

近年中藥抗腫瘤作用顯著，引起了國內(nèi)外廣泛關(guān)注，具有不良反應(yīng)小、價格低廉等優(yōu)點［13］。HA 是一種在烏頭根中發(fā)現(xiàn)的二萜生物堿，具有細(xì)胞毒性作用［14］。據(jù)報道，HA 可抑制肝癌HepG2 細(xì)胞系生長，表明HA 具有抗腫瘤作用，與本研究結(jié)果一致［15］。本研究顯示，HA 可抑制胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時抑制增殖相關(guān)蛋白PCNA、遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9 表達(dá)，且呈劑量依賴性，表明HA 可抑制胃癌惡性進展。CXCL2、CXCL8是一類有利于腫瘤生長發(fā)育的趨化因子，其異常表達(dá)會導(dǎo)致免疫細(xì)胞無法在正確位置發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答［16］；NK 細(xì)胞是免疫系統(tǒng)重要組成之一，可通過分泌毒性因子發(fā)揮免疫監(jiān)視作用進而清除腫瘤細(xì)胞［10］。本研究顯示，HA 可劑量依賴性地抑制BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 表達(dá)，提高共培養(yǎng)體系中NK 細(xì)胞殺傷力，表明HA 可抑制BGC-823 細(xì)胞免疫逃逸。提示HA 可能成為治療胃癌的潛在有效藥物。

cGAS 是一種細(xì)胞質(zhì)DNA 傳感器，可激活STING 蛋白，隨后誘導(dǎo)針對各種含DNA 病原體的保護性免疫防御并提供抗腫瘤免疫［17-18］。據(jù)報道，激活非小細(xì)胞肺癌的cGAS/STING 信號通路可促進NK 細(xì)胞浸潤和抗腫瘤免疫［19］；激活cGAS/STING 信號通路可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［20］；抑制cGAS/STING信號通路可促發(fā)胰腺癌，表明cGAS/STING 信號通路參與腫瘤進展，與本研究結(jié)果一致［21］。本研究顯示，與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞cGAS、STING 蛋白表達(dá)降低，BGC-823 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸能力增強，表明cGAS/STING 信號通路參與BGC-823 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HA 可劑量依賴性地上調(diào)BGC-823 細(xì)胞cGAS、STING 蛋白表達(dá)，推測HA 可能通過cGAS/STING通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸。為驗證該推測，本研究在高劑量HA 作用基礎(chǔ)上增加cGAS 抑制劑RU.521 干預(yù)BGC-823 細(xì)胞或共培養(yǎng)細(xì)胞體系，結(jié)果顯示RU.521 減弱了高劑量HA 對BGC-823 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸的抑制作用，證實HA 可能通過激活cGAS/STING 通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸。

綜上，HA 可能通過激活cGAS/STING 通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸。HA 對胃癌進展的抑制作用可能涉及其他通路，本研究尚未探究，將是后續(xù)研究重點。