劉鳴昊，黃亞森，張振凌，張麗慧，劉素彤，趙文霞

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450006；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046）

化痰祛濕活血方是第二屆全國(guó)名中醫(yī)趙文霞教授根據(jù)非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）“痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)、肝失條達(dá)”的病機(jī)而制定的復(fù)方，該方由澤瀉、海藻、丹參、郁金、水飛薊、決明子、山楂、柴胡8味中藥組成。方中澤瀉利水滲濕，行氣消瘀，為君藥。丹參活血化瘀，涼血安神；郁金活血止痛，行氣解郁；海藻化痰利濕，軟堅(jiān)消痰。三藥共為臣藥。決明子清肝明目，山楂消積散瘀，水飛薊清熱解毒。三藥共為佐藥。柴胡疏肝理氣，為使藥。全方共奏化痰祛濕活血之功。前期研究[1-4]證實(shí)，化痰祛濕活血方具有良好的抗NASH作用。文獻(xiàn)研究顯示，決明子生品長(zhǎng)于清肝熱；凈山楂長(zhǎng)于活血化瘀。麩炒澤瀉長(zhǎng)于滲濕和脾，降濁以升清，利尿作用較生品顯著增強(qiáng)；而鹽澤瀉幾乎無(wú)利尿作用，23-乙酰澤瀉醇B為其主要有效成分，且在澤瀉中含量較高；麩炒澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于生品，而其他炮制品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于生品[5-7]。丹參酒制后，寒涼之性緩和，活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛之功增強(qiáng)；丹參酒炙后化學(xué)成分的種類(lèi)和含量變化顯著，其中二氫丹參酮Ⅰ和丹參酮Ⅰ的峰面積增加，隱丹參酮、丹參新醌乙、丹參酮ⅡA和丹參新酮的峰面積明顯降低，紫草酸或丹酚酸H、丹參酮ⅡB色譜峰消失,推測(cè)丹參酒炙后活血化瘀作用的增強(qiáng)與所含成分轉(zhuǎn)化為體內(nèi)更易吸收的活性成分有關(guān)[8-10]。醋郁金能夠引藥入血，增強(qiáng)舒肝止痛作用。郁金炮制品的藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，醋郁金在止痛方面作用最強(qiáng)[11]。醋柴胡引藥入肝，疏肝解瘀止痛效果最佳。柴胡醋炙后會(huì)使原生皂苷向次生皂苷轉(zhuǎn)化，醋柴胡疏肝解郁作用強(qiáng)于生品[12]?；奠顫窕钛皆斤嬈鶠樯罚词褂靡陨吓谥破?。目前尚無(wú)研究對(duì)不同煎煮方法有效成分溶出進(jìn)行過(guò)比較。

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已對(duì)飲片質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）規(guī)定，并基于正交試驗(yàn)對(duì)化痰祛濕活血方標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行研究。其煎煮工藝為：加12倍量水、浸潤(rùn)60 min、煎煮30 min、煎煮3次。故本研究基于中藥炮制理論，采用高效液相色譜（HPLC）法比較將方中澤瀉、丹參、郁金、柴胡換成麩炒澤瀉、酒丹參、醋郁金、醋柴胡后，以及單煎、混煎的方式對(duì)水煎液中18種主要有效成分含量的影響，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis,PCA）及偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA）化學(xué)模式識(shí)別方法評(píng)價(jià)生品混煎組（8味飲片均為生品，混煎下文簡(jiǎn)寫(xiě)為YH）、生品單煎組（8味飲片均為生品，單煎后混合，下文簡(jiǎn)寫(xiě)為YD）、炮制混煎組（麩炒澤瀉、酒丹參、醋郁金、醋柴胡、海藻、山楂、決明子、水飛薊，混煎，下文簡(jiǎn)寫(xiě)為PH）、炮制單煎組（麩炒澤瀉、酒丹參、醋郁金、醋柴胡、海藻、山楂、決明子、水飛薊，單煎后混合，下文簡(jiǎn)寫(xiě)為PD）間的質(zhì)量差異，以期為化痰祛濕活血方如何選用藥物炮制品、如何煎煮提供一定的參考，從而為明確飲片炮制對(duì)方劑功效的影響提供數(shù)據(jù)支撐，為臨床方劑煎煮提供指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 材料 澤瀉飲片（批號(hào)：200403641，200202011，200500691）、丹參飲片（批號(hào)：201200631，201100181）、柴胡飲片（批號(hào)：200403321，200900911）、山楂飲片（批號(hào)：210102511，191203831，190804891）、決明子飲片（批號(hào)：191000099，190200099）、郁金飲片（批號(hào)：201201391，191001211）、海藻飲片（批號(hào)：190601871）均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司；郁金飲片（批號(hào)：200502）購(gòu)自普寧市澤群中藥飲片有限公司；海藻飲片（批號(hào)：200801）購(gòu)自廣東天誠(chéng)中藥飲片有限公司；水飛薊飲片（批號(hào)：190501CP0122）購(gòu)自安國(guó)市光明飲片加工廠。上述飲片由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張振凌教授鑒定均為正品，且符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）規(guī)定。柴胡皂苷b1（批號(hào)：58558-08-0，純度≥98.0%）、柴胡皂苷b2（批號(hào)：58316-41-9，純度≥98.5%）、蘆丁（批號(hào)：153-18-4，純度≥98.0%）、橙黃決明素（批號(hào)：67979-25-3，純度≥98.0%）、橙皮苷（批號(hào)：520-26-3，純度≥98.0%）、金絲桃苷（批號(hào)：482-36-0，純度≥98.0%）、23-乙酰澤瀉醇C（批號(hào)：26575-93-9，純度≥98.0%）、綠原酸（批號(hào)：327-97-9，純度≥98.0%）、阿魏酸（批號(hào)：1135-24-6，純度≥98.0%）、丹酚酸B（批號(hào)：121521-90-2，純度≥98.0%）、山柰酚（批號(hào)：20736-09-8，純度≥98.5%）、蘆?。ㄅ?hào)：153-18-4，純度≥98.0%）、丹參酮ⅡA（批號(hào)：568-72-9，純度≥98.0%）、槲皮素（批號(hào)：20874-52-6，純度≥98.5%）、槲皮苷（批號(hào)：522-12-3，純度≥98.0%）、水飛薊賓（批號(hào)：802918-57-6，純度≥98.0%）、丹參素鈉（批號(hào)：1135-24-6，純度≥98.0%）、柚皮素（批號(hào)：19885-10-0，純度≥98.0%）均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2 儀器 BSA224S-CW I級(jí)電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；YP10002 Ⅲ級(jí)電子天平（上海橫際科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸法系統(tǒng)（上海愛(ài)朗儀器有限公司），包括OSB-2100型油浴鍋、CA-1115A型冷卻水循環(huán)裝置、隔膜真空泵；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；5424R型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取1/10處方量的各飲片，浸泡60 min，加12倍水，煎煮3次，30 min/次，合并水煎液，混勻，于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，取10 mL置于25 mL容量瓶中，75%甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、水飛薊賓、丹參素鈉、橙皮苷、槲皮苷、23-乙酰澤瀉醇C、丹酚酸B、金絲桃苷、綠原酸、柚皮素、蘆丁、槲皮素、阿魏酸、橙黃決明素、山柰酚、芹菜素、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，加甲醇溶解配制成各成分質(zhì)量濃度分別為0.112、0.123、0.120、0.988、0.145、0.121、0.161、0.243、0.378、0.266、0.239、0.322、0.128、0.158、0.731、0.149、0.237、0.248 mg/mL的對(duì)照品溶液。取丹酚酸B對(duì)照品溶液1 mL和其他對(duì)照品溶液各20 μL配制成混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件 Eclipse XDS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-1%磷酸（B），梯度洗脫：0～5 min，5%A～8%A；5～10 min，8%A；10～45 min，8%A～39%A；45～70 min，39%A～41.5%A；70～74 min，41.5%A；74～83 min，41.5%A～48%A；83～93 min，48%A～67.4%A；93～103 min，67.4%A～95%A；103～105 min，95%A～5%A；105～108 min，5%A；柱溫：35 ℃；流速：0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；進(jìn)樣量：5 μL?；旌蠈?duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC 圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液適量，依次稀釋至1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.010、0.001倍的對(duì)照品梯度溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。各成分在線性范圍內(nèi)線性良好，18個(gè)成分相關(guān)系數(shù)（r）均在0.900 0以上。（見(jiàn)表1）

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的峰面積。結(jié)果18個(gè)待測(cè)成分峰面積的RSD在0.54%～1.13%之間，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取化痰祛濕活血方（YH1）供試品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件于0、3、6、9、12、24 h后進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果18個(gè)待測(cè)成分峰面積的RSD在0.54%～1.36%之間，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取1/10處方量的化痰祛濕活血方樣品（YH1）6份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果18個(gè)待測(cè)成分峰面積的RSD在1.28%～3.58%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的1/20處方量的化痰祛濕活血方樣品（YH1）6份，分別加入各對(duì)照品溶液適量（加入后待測(cè)物總量相當(dāng)于1/10處方量樣品中含有量），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值。結(jié)果18個(gè)待測(cè)成分峰面積的RSD在0.49%～3.51%之間，表明方法準(zhǔn)確度良好。（見(jiàn)表2）

表2 18 種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取1/10處方量的各飲片，按“2.1.1”項(xiàng)下方法分別制備3批YH、YD、PH、PD樣品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積，并計(jì)算各成分的含量。（見(jiàn)表3）炮制前后單煎水煎液中丹參素鈉、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、柚皮素、23-乙酰澤瀉醇C均高于混煎水煎液，混煎水煎液中綠原酸、蘆丁、丹酚酸B、水飛薊賓、山柰酚、芹菜素、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、丹參酮ⅡA含量均高于單煎水煎液；無(wú)論單煎還是混煎，原方綠原酸、阿魏酸、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、23-乙酰澤瀉醇C、柴胡皂苷b1、丹參酮ⅡA含量均高于炮制后的組方，炮制后的組方中柴胡皂苷b2含量高于原方。

表3 不同化痰祛濕活血方樣品中18 種成分的含量

2.5 聚類(lèi)分析 建立3批YH、YD、PH、PD化痰祛濕活血方樣品的18種成分含量的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 22.0分析軟件，采用系統(tǒng)聚類(lèi)，組間均聯(lián)，Euclidean距離平方為測(cè)度，進(jìn)行聚類(lèi)模式識(shí)別分析。由聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖可知，12個(gè)樣品分成5類(lèi)：YH1、YH2為第Ⅰ類(lèi)，PH1、PH2為第Ⅱ類(lèi)，PH3、YH3為第Ⅲ類(lèi)，PD1、PD2、PD3為第Ⅳ類(lèi)，YD1、YD2、YD3為第Ⅴ類(lèi)。當(dāng)歐氏距離小于20時(shí)，可分為兩類(lèi)，單煎為第Ⅰ類(lèi)，混煎為第Ⅱ類(lèi)。（見(jiàn)圖2）

圖2 HCA 圖

2.6 主成分分析 將3批YH、YD、PH、PD化痰祛濕活血方樣品的18種成分含量為變量，導(dǎo)入SIMCA-P+14.1(Demo）軟件進(jìn)行PCA處理，系統(tǒng)自動(dòng)擬合后選用前2個(gè)主成分進(jìn)行分析，模型檢驗(yàn)R2Xcum=0.76，Q2cum=0.494，表明該模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)信度良好，樣品分類(lèi)良好。其中第1個(gè)主成分貢獻(xiàn)46.2%，代表了原始數(shù)據(jù)46.2%的信息，說(shuō)明原始數(shù)據(jù)之間的差異，46.2%的差異由煎煮方式引起；第2主成分貢獻(xiàn)率29.8%，代表了原始數(shù)據(jù)29.8%的信息，說(shuō)明原始數(shù)據(jù)之間的差異，29.8%是由炮制引起的。（見(jiàn)圖3）經(jīng)PCA模型擬合分析得到載荷散點(diǎn)圖可知，柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、丹參酮ⅡA、橙皮苷對(duì)主成分1貢獻(xiàn)較大，綠原酸、柚皮素、金絲桃苷、槲皮苷、23-乙酰澤瀉醇C對(duì)主成分2貢獻(xiàn)較大。（見(jiàn)圖4）

圖3 PCA 得分圖

圖4 PCA 載荷散點(diǎn)圖

圖5 PLS-DA 得分圖

2.7 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 在P CA的基礎(chǔ)上選擇具有監(jiān)督模式的PLS-DA進(jìn)行分析，結(jié)合評(píng)價(jià)PLS-DA模型質(zhì)量的3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)R2Xcum=0.747，R2XYcum=0.569，Q2cum=0.376，說(shuō)明樣品聚類(lèi)、分離良好。（見(jiàn)圖6）

圖6 PLS-DA VIP 圖

2.8 差異成分分析 為明確炮制前后、單煎及混煎引起差異的質(zhì)量標(biāo)志物，采用變量重要性投影（variable importance in the projection,VIP）對(duì)數(shù)據(jù)矩陣分析，建立炮制前后（YH-PH、YD-PD）、不同煎煮方式（YH-YD、PH-PD）的VIP圖。VIP＞1，代表具有顯著影響。（見(jiàn)圖6）

（1）YH-PH中VIP＞1的成分包括：23-乙酰澤瀉醇C、槲皮素、丹參酮IIA、蘆丁、山柰酚、金絲桃苷、橙皮苷。（見(jiàn)圖6A）

（2）YD-PD中VIP＞1的成分包括：柴胡皂苷b2、橙黃決明素、金絲桃苷、23-乙酰澤瀉醇C、槲皮素、丹參酮ⅡA、水飛薊賓、阿魏酸。（見(jiàn)圖6B）

（3）YH-YD中VIP＞1的成分包括：柴胡皂苷b2、橙皮苷、槲皮素、蘆丁、丹參酮ⅡA、阿魏酸、柴胡皂苷b1、丹參素鈉、23-乙酰澤瀉醇C、丹酚酸B。（見(jiàn)圖6C）

（4）PH-PD中VIP＞1的成分包括：槲皮素、橙皮苷、23-乙酰澤瀉醇C、柴胡皂苷b2、橙黃決明素、芹菜素、山柰酚、丹參酮ⅡA、水飛薊賓、阿魏酸、柴胡皂苷b1。（見(jiàn)圖6D）

3 討 論

金絲桃苷、蘆丁、橙皮苷、槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚、芹菜素為黃酮類(lèi)化合物，具有顯著的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[13]；阿魏酸、綠原酸為苯丙酸類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗腫瘤等藥理活性[14-15]；丹參素鈉為丹參素的鈉鹽結(jié)構(gòu)，功效與丹參素一樣；丹參素與丹酚酸B、丹參酮ⅡA為丹參的主要活性成分，對(duì)NASH有一定的治療的作用[16-18]；水飛薊賓為水飛薊的主要活性成分，具有良好的保護(hù)肝臟和清除自由基作用[19]；橙黃決明素為決明子主要有效成分，具有較好的降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[20]；23-乙酰澤瀉醇C為三萜類(lèi)成分，是澤瀉主要有效成分之一，具有利尿、降血脂、保肝、抗炎、抗氧化等作用[21]；柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝纖維化等作用[22]。本試驗(yàn)通過(guò)HPLC法建立了同時(shí)測(cè)定化痰祛濕活血方中丹參素鈉、綠原酸、阿魏酸、金絲桃苷、蘆丁、橙皮苷、槲皮苷、丹酚酸B、槲皮素、柚皮素、水飛薊賓、山柰酚、芹菜素、橙黃決明素、23-乙酰澤瀉醇C、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、丹參酮ⅡA等18種主要有效成分的含量測(cè)定方法，方法穩(wěn)定、可靠。

本研究對(duì)炮制前后、不同煎煮方式的化痰祛濕活血方進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)樣品聚類(lèi)良好，說(shuō)明樣品間差異較大，炮制、煎煮方式對(duì)化痰祛濕活血方影響較大。為進(jìn)一步闡釋差異成分，本研究分別對(duì)炮制前后、單煎和混煎的樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)23-乙酰澤瀉醇C、槲皮素、丹參酮ⅡA、蘆丁、山柰酚、金絲桃苷、橙皮苷可能是引起YH、PH的差異成分；柴胡皂苷b2、橙黃決明素、金絲桃苷、23-乙酰澤瀉醇C、槲皮素、丹參酮ⅡA、水飛薊賓、阿魏酸可能是引起YD、PD的差異成分。兩組樣品組成相同而煎煮方式不同，故蘆丁、山柰酚、橙皮苷、柴胡皂苷b2、橙黃決明素、水飛薊賓、阿魏酸可能是不同煎煮方式的差異成分?；赮H、YD分析，柴胡皂苷b2、橙皮苷、槲皮素、蘆丁、丹參酮ⅡA、阿魏酸、柴胡皂苷b1、丹參素鈉、23-乙酰澤瀉醇C、丹酚酸B可能是引起YH、YD的差異成分；基于PH、PD分析，槲皮素、橙皮苷、23-乙酰澤瀉醇C、柴胡皂苷b2、橙黃決明素、芹菜素、山柰酚、丹參酮ⅡA、水飛薊賓、阿魏酸、柴胡皂苷b1可能是引起PH、PD的差異成分。兩組樣品煎煮方式相同，樣品不同，故蘆丁、丹參素鈉、丹酚酸B、橙黃決明素、芹菜素、山柰酚、水飛薊賓的差異可能是由炮制因素造成的。

本試驗(yàn)建立了不同炮制品組方、不同煎煮方式的化痰祛濕活血方的18種有效成分的含量測(cè)定方法，并通過(guò)HCA、PCA、PLS-DA初步分析了影響不同炮制、煎煮方式的化痰祛濕活血方的差異標(biāo)志性成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠較為全面地探討不同炮制、煎煮方式對(duì)化痰祛濕活血方的影響。但中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，本研究?jī)H對(duì)識(shí)別的18種成分進(jìn)行分析，不夠深入，后期可加強(qiáng)對(duì)其他化學(xué)成分的識(shí)別，并跟蹤體內(nèi)代謝過(guò)程，通過(guò)比較入血成分含量、組織分布、代謝等情況探討炮制、煎煮方式對(duì)中藥復(fù)方在體內(nèi)外的影響，從而為中藥炮制理論、臨床藥效提供依據(jù)。