余國春

四川省水產(chǎn)學(xué)校,四川 成都 611730

0 引言

反芻動物瘤胃是最強的微生態(tài)系統(tǒng)之一,其中含有細菌、原蟲和真菌等逾3 000種微生物[1],與宿主的各項生理生化功能密切相關(guān)。但瘤胃中的絕大多數(shù)微生物極度厭氧,培養(yǎng)極其不易,傳統(tǒng)研究弊端顯著。宏基因組測序作為新興組學(xué)技術(shù),規(guī)避了傳統(tǒng)培養(yǎng)研究的缺陷,且更能透徹地揭露微生物多樣性、差異性、功能性及其與宿主間的相互關(guān)系,在瘤胃微生物群落的研究上具有廣闊的前景。本文聚焦宏基因組學(xué)的研究方法,重點討論瘤胃微生物功能的相關(guān)影響因素,以期為提高反芻動物生產(chǎn)水平提供思路。

1 宏基因組學(xué)研究方法

宏基因組在反芻動物瘤胃微生物中的研究主要包括以下核心環(huán)節(jié)。

1.1 樣本采集

瘤胃口腔導(dǎo)管法或屠宰法采集瘤胃液,經(jīng)過濾后立即存于液氮罐。

1.2 宏基因組DNA提取

根據(jù)試劑盒說明書分離純化DNA,并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop分光光度計或Qubit熒光定量儀進行測驗評價。

1.3 宏基因組測序

運用PCR制作文庫并進行Illumina高通量測序平臺測序。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

1)采用Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾和質(zhì)控。

2)使用SOAPdenovo軟件、MEGAHIT軟件或IDBA-UD軟件對優(yōu)化數(shù)據(jù)進行拼接和組裝。

3)利用prodigal軟件對瘤胃宏基因組序列進行基因目錄的構(gòu)建。

1.5 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用BLAST將構(gòu)建的基因序列予以分析。

1)與GenBank的NR數(shù)據(jù)庫(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/taxonomy/) 進行比對,獲得物種注釋。

2)與COG數(shù)據(jù)庫 (https://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG/COG/)、GO數(shù)據(jù)庫 (http: //www.geneontology.org/) 和KEGG數(shù)據(jù)庫 (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) 進行比對,獲得基因功能注釋。

3)根據(jù)需要與CAZy數(shù)據(jù)庫 (http://www.cazy.org/) 進行比對,獲得碳水化合物活性酶注釋。

2 宏基因組學(xué)揭露反芻動物瘤胃微生物影響因子

瘤胃微生物系統(tǒng)是一個人類知之甚少的微生態(tài)環(huán)境,作為浩瀚微生物的聚居地,微生物族群在此或共生或寄生或競爭或捕食,關(guān)系錯綜復(fù)雜且功能繁復(fù),它們的功能是否正常發(fā)揮也決定了反芻動物的養(yǎng)殖成果和經(jīng)濟效益。宏基因組 (metagenome),也稱元基因組,由Handelsman et al.[2]在1998年首次提出,其定義為特定環(huán)境中全部微生物基因組的總和。隨著技術(shù)的不斷探索和熟化,Kittelmann[3]于2013年創(chuàng)投了一種避免對非目標(biāo)DNA測序,可同時高效分辨細菌、古菌、原蟲、真菌、核糖體間隔區(qū)的方法。近年來,因其維度廣、準(zhǔn)確率高,宏基因組測序被廣泛用于瘤胃微生物分類、功能注釋及代謝通路等[4-5]。

2.1 遺傳生理對瘤胃微生物的影響

2.1.1 種屬對瘤胃微生物的影響

源于生存本能,生命繁衍進化,萬物生而有異,不同種屬反芻動物的瘤胃微生態(tài)又是否有所不同?運用宏基因組技術(shù)系統(tǒng),Gao et al. 比較了蓋亞爾牛和云南黃牛瘤胃微生物的差異,結(jié)果表明2個品種在細菌、古菌和真菌方面確實存在差異,蓋亞爾牛的厚壁菌門與擬桿菌門的比例(1.06)高于云南黃牛(0.66),碳水化合物活性酶注釋結(jié)果顯示蓋亞爾牛GH5、GH26、GH94、CBM11和CBM63的豐度高于云南黃牛。Wang et al.研究了蓋亞爾牛、牦牛、西藏黃牛和云南黃牛的瘤胃真菌組成,鑒別出作為3個真菌門 (擔(dān)子菌門、子囊菌門和新麗鞭毛菌門) 中豐度之首,厭氧真菌新麗鞭毛菌門的優(yōu)勢屬的組成在4種牛中差異很大,未分類屬在4個品種間也存在分布不均的現(xiàn)象,分別占90.63%、98.52%、97.79%和27.01%。

2.1.2 生境對瘤胃微生物的影響

麻雀雖小五臟俱全,細胞的差異性演化造就了各司其職的組織、器官、系統(tǒng)和功能全備的機體。瘤胃素有“發(fā)酵罐”之稱,固相和液相2種生境相伴而生,合理推測生境的區(qū)別存在功用的分歧。Mullins et al.對8頭泌乳荷斯坦奶牛進行宏基因組檢測,全混合飼糧飼喂下,液相中主要以牛鏈球菌、棲瘤胃普氏菌和溶纖維丁酸弧菌為主,而固相中則存在更高比例的嚙齒真桿菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌以及白色瘤胃球菌,證實即使同一個體中瘤胃液相和固相的微生物菌群也明顯不同。

2.1.3 年齡對瘤胃微生物的影響

動物的生理年齡與其生長發(fā)育和性能密切相關(guān),它又與瘤胃微生物有無聯(lián)系呢? 就新生動物中微生物種群的定植及后續(xù)變化,Jami et al.[9]設(shè)置了1日齡～2歲齡的5個年齡組,對相同飼喂條件的16 頭荷斯坦奶牛瘤胃細菌種群進行分析,研究結(jié)果表明:群落多樣性和群內(nèi)相似性隨著年齡的增長而增加,成熟群落的多樣性和同質(zhì)性較強,而初級群落的多樣性較弱。

2.1.4 生理對瘤胃微生物的影響

相較于正常生理狀態(tài),在病理狀態(tài)下微生物的數(shù)量、類別和組成均會改變,進而導(dǎo)致機體的功能、代謝、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等出現(xiàn)異常。除此之外,不同生理狀態(tài) (如配種期、妊娠期和哺乳期) 的瘤胃生境或也不同,但相關(guān)對比分析較少。

2.2 飼養(yǎng)管理對瘤胃微生物的影響

2.2.1 飼料對瘤胃微生物的影響

飼料種類繁多、配制方法各異,為保證反芻動物的健康和高產(chǎn),學(xué)者們探尋不同飼料對瘤胃微生物組的影響。Pitta et al.[10]對低蛋白高纖維(狗牙根草組)到高蛋白低纖維(冬小麥組)飼料轉(zhuǎn)變的肉牛瘤胃內(nèi)容物進行測序,闡明狗牙根草組和冬小麥組的液相存在的微生物分別為149 個屬和118 個屬,其中普氏菌屬豐度均為最高,進一步論證了飼料配比的確在微生物水平上對動物機體產(chǎn)生影響。

2.2.2 添加物對瘤胃微生物的影響

飼料添加劑的養(yǎng)殖效益明顯,但食品安全隱患也隨之攀升。于萍 等[11]研究了飼喂納豆枯草芽胞桿菌的犢牛,證實納豆枯草芽胞桿菌有助于斷奶犢牛瘤胃細菌區(qū)系的建立和纖維分解菌群的定植和生長,且主要菌落是擬桿菌門和壁厚菌門。安雅靜 等[12]對瘤胃液樣本進行組學(xué)分析,揭示了黃曲霉毒素B1能降低擬桿菌門及厚壁菌門的豐度,而對普雷沃氏菌發(fā)揮抑制作用。朱智[13]探索了山羊瘤胃液中的細菌菌屬,得出灌注大蒜油會降低丁酸弧菌的比例,但也同時提高了菌種的遺傳多樣性。

2.2.3 養(yǎng)殖方式對瘤胃微生物的影響

依據(jù)市場導(dǎo)向、飼養(yǎng)環(huán)境、規(guī)模等因素,牛羊養(yǎng)殖方式應(yīng)勢選取,生產(chǎn)效益也不甚相同,但其與瘤胃微生物群的關(guān)聯(lián)鮮有研究。為此,李娟 等[14]選取了10頭健康青年雄性麥洼牦牛,對比研究了舍飼養(yǎng)殖和放牧養(yǎng)殖下瘤胃微生態(tài)的差異,顯示舍飼提高了優(yōu)勢菌門(厚壁菌門和擬桿菌門)、功能蛋白(瘤胃微生物轉(zhuǎn)錄、輔酶轉(zhuǎn)運和代謝等)和3大代謝通路(碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝)的相對豐度,并使得體重顯著增加,印證了舍飼的養(yǎng)殖優(yōu)勢。

3 展望

瘤胃是一個極其龐大而復(fù)雜的生物資源庫,瘤胃微生物與纖維飼料的消化[8]、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[15]和瘤胃壁絨毛的發(fā)育[16]相關(guān),其中蘊藏著不計其數(shù)的有待挖掘的基因。采用宏基因技術(shù)系統(tǒng)所得到的生物學(xué)信息,可深入挖掘反芻動物瘤胃微生態(tài)的奧秘,但礙于一些因素相關(guān)研究仍然相對滯后。

如今,得益于宏基因組學(xué)技術(shù)的聯(lián)動,許多學(xué)者對瘤胃微生物功能展開了積極深入的探索,嘗試并實際挖掘出一些與重要營養(yǎng)生理功能密切相關(guān)的瘤胃微生物功能基因。但宏基因組學(xué)的核心是與現(xiàn)存數(shù)據(jù)庫進行比對,數(shù)據(jù)庫的現(xiàn)有數(shù)據(jù)卻落后于宏基因組學(xué)的發(fā)展態(tài)勢;加之測序讀長和成本的限制,制約了宏基因組學(xué)的推廣和應(yīng)用。隨著數(shù)據(jù)庫的升級和完善,分析平臺的構(gòu)建和完備,測序技術(shù)的優(yōu)化和改進,以及測序成本的降低,宏基因組學(xué)勢必成為探究瘤胃生態(tài)系統(tǒng)的重要工具。