王鵬娜，何英英，李文君，趙 陽，曲長鳳，繆錦來*

（1. 自然資源部 第一海洋研究所，山東 青島 266061；2. 青島市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 青島 266199）

互花米草（Spartina alternifolia）屬禾本科，鼠尾粟屬，二倍體、四倍體或十二倍體的多年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲與南美洲的大西洋沿岸（Rolando et al, 2022）。發(fā)達的根系使得互花米草具有很強的生長繁殖能力與環(huán)境適應能力，可在各種基質(zhì)上定居，使其在與其他植物在競爭資源時占據(jù)絕對優(yōu)勢。互花米草具有較強的連續(xù)擴散的能力，Liu等利用Landsat-8 OLI圖像等技術(shù)推算出互花米草在1979年至2018年的平均擴張速率約137 km2/10 a（Liu et al, 2018） 。1979年互花米草被引進我國（王壽兵等, 2023），用于保灘護岸、促淤造陸（ 欽佩等, 2012; 楊東等, 2014），因效果良好，后續(xù)在山東、廣東、江蘇等地的沿海灘涂上進行廣泛種植，并在我國海岸帶迅速擴散（王智晨等, 2006; 沈鴻坤等, 2022），目前在我國的分布面積達545.80 km2，緯度范圍為39°13′～20°55′N。

互花米草的入侵與擴散誘導濕地生態(tài)退化，影響濕地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能（張雪, 2022; 宗影等, 2023）?；セ撞菽軌蚋偁幦〈林参铮ㄈ琨}地堿蓬、蘆葦和紅樹林等），入侵污染土著植物的基因（饒清華, 2020）；且易造成原生態(tài)環(huán)境生物生存空間變窄、群落結(jié)構(gòu)改變，如鳥類、魚類及底棲無脊椎動物因食物來源和避難所發(fā)生改變而遷移；與灘涂養(yǎng)殖藻類爭奪營養(yǎng)導致藻類減產(chǎn)，養(yǎng)殖水產(chǎn)品被沖進米草群落而無法逃生導致大量水產(chǎn)品減產(chǎn)，威脅海岸帶水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)；改變潮間帶地形并影響海水正常流動，引起航道堵塞（王君, 2010）?？傊?，互花米草的擴散造成一系列巨大的生態(tài)和經(jīng)濟危害，因此2003年其被列入外來入侵物種（Jiang et al, 2022; Lin et al, 2022; Shen et al, 2022）。

互花米草入侵及擴散能力與其繁殖方式和高抗鹽性等密切相關(guān)。其有性繁殖體為種子，無性繁殖體為根狀莖、分蘗形成的分株與折落的植株（Daehler et al, 1994）。研究表明，互花米草為適應新的環(huán)境會選擇不同的繁殖方式（Winkler et al, 1999），傳播通常是人工種植后的無性繁殖，在潮間帶地區(qū)大多呈簇狀分布（Liu et al, 2018）。互花米草作為一種強泌鹽植物，鹽脅迫下能通過鹽腺結(jié)構(gòu)將組織中的鹽分排到莖葉等器官表面，因此互花米草對高鹽度有較強的耐受能力（適鹽范圍為0～3），同其他植物相比互花米草在鹽度較高的生境中競爭優(yōu)勢明顯（何軍等, 2009; 陳綠青, 2013; 趙陽,2022），這種特性也為其適應潮間帶環(huán)境提供了可能（Feng et al, 2017）。

目前，對互花米草的研究主要集中在生理特性和經(jīng)濟價值上，如互花米草對土壤的物理和化學性質(zhì)及生物群落的影響（布乃順等, 2017）、對金屬物質(zhì)的吸收（李佳枚等, 2011）、藻華抑制作用（Xu et al, 2019）等。但并未有研究闡明互花米草生物入侵分子機制與其高鹽度抗性之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，植物在鹽脅迫下，可以通過調(diào)節(jié)自身的基因表達、信號傳導、能量代謝及蛋白質(zhì)合成等途徑，來緩解高鹽環(huán)境帶來的不利影響（喬慧萍等, 2007; Badar et al, 2021; Delgado et al, 2021）。因此，本文利用Illumina高通量測序技術(shù)，從分子生物學層面揭示互花米草在不同鹽度脅迫下的基因表達調(diào)控規(guī)律，深度挖掘其與高鹽度抗性相關(guān)的基因及代謝通路，探討其生物入侵分子機制與其高鹽度抗性之間分子響應機制。以此為互花米草的入侵機制提供新的啟示，也為互花米草及其他入侵物種的防控手段提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及采集

互花米草（Spartina alterniflora）幼苗（3～5葉期）取自青島濱海鹽沼濕地（120°19′00″E，36°15′48″N），樣本無病蟲害，長勢良好。取樣時間為2021年8月，取樣地的鹽度為10。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將取樣的互花米草移栽到帶排水孔的塑料盆中，填充物為淤泥與砂的混合物，兩者比例為3∶1，實驗室培養(yǎng)兩周后進行鹽度脅迫轉(zhuǎn)錄組測序分析。培養(yǎng)條件為16 h/8 h周期的光/暗交替，溫度為（24±2） ℃，相對空氣濕度60%。每盆種植3棵長勢一致的互花米草幼苗，每 3 d澆灌1次。

1.2.2 脅迫處理

將適應實驗室環(huán)境且長勢較好的互花米草隨機分為3組（每組3個平行），設(shè)為對照組（Control Group，CG）（鹽度為10）、低鹽度組（Low Salinity Group，LG）（鹽度為24）和高鹽度組（High Salinity Group，HG）（鹽度為32）。用NaCl、純水和海水分別配制鹽度為10、24和32的水溶液，用以澆灌3組互花米草，脅迫處理12 h后，取下葉片放入液氮中速凍，并于?80 ℃冰箱保存。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序方法

將互花米草葉片樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司，采用Illumina高通量測序技術(shù)，進行轉(zhuǎn)錄組測序，并構(gòu)建其在正常生理條件和脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組文庫。將測序所得的原始序列使用Fast QC軟件進行質(zhì)量評估，使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)量剪切，使用Trinity軟件將樣本有效數(shù)據(jù)進行混合拼接。采用NCBI Blast+工具將轉(zhuǎn)錄本與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot和TrEMBL等數(shù)據(jù)庫進行比對，得到其功能注釋信息。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本與Swissprot、TrEMBL的注釋結(jié)果得到GO功能注釋信息，利用KAAS得到轉(zhuǎn)錄本KEGG注釋信息。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本與數(shù)據(jù)庫Blast比對結(jié)果和TransDecoder進行CDS（Coding Sequence）預測。以q＜0.05（q：多重檢驗校正后的P）、|log2Fold Change|＞1為條件，使用DESeq2進行Unigene表達差異分析，基于差異分析結(jié)果繪制熱圖。使用topGO軟件進行GO富集分析，繪制顯著性GO有向無環(huán)圖。使用clusterProfiler進行KEGG通路和KOG分類富集分析?；诨蚬δ芨患治鼋Y(jié)果繪制關(guān)聯(lián)分析網(wǎng)絡圖，查找差異表達Unigene參與的生化代謝途徑和信號傳導途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

對不同鹽度脅迫下的9個樣品進行測序分析，結(jié)果如表1所示。9組樣品分別獲得51852554、39508588、67375654、36726702、37468186、38988834、42742450、42941540、60585594條過濾序列，分別獲得7101166661、5649247965、9605379576、5256817516、5335440311、5562196605、6072862154、6134065719、8719915050 bp過濾堿基。各樣本GC含量為45.78%～54.20%，Q30堿基百分比在94.87%以上，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)組裝分析。

表1 9個互花米草樣品的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果Table 1 Transcriptome sequencing results of 9 Spartina alterniflora samples

對測序所得序列進行轉(zhuǎn)錄本拼接，共獲得121760個Unigene，長度范圍為201～12705 bp，平均長度為633 bp，N50為1046 bp。具體長度分布情況見圖1。

圖1 Unigene長度分布Fig. 1 Distribution of unigene length

2.2 基因功能注釋

將所得的單Unigene序列與NR、NT、KEGG、PFAM等8個數(shù)據(jù)庫進行比對，有63750個Unigene注釋到eggNOG數(shù)據(jù)庫，占Unigene總數(shù)的52.36%；58875個Unigene注釋到NR數(shù)據(jù)庫，占總數(shù)的48.35%。其中70455個Unigene在至少一個數(shù)據(jù)庫得到注釋，占總數(shù)的57.86%；1812個Unigene在8個數(shù)據(jù)庫均得到注釋，占總數(shù)1.5%。各數(shù)據(jù)庫Unigene注釋數(shù)量及比例如表2所示。

表2 Unigene注釋成功率統(tǒng)計Table 2 Statistical result of unigene annotation

將獲得的Unigene在GO （Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫中進行注釋與分類（孫晶京, 2012），結(jié)果如圖2所示。Unigene共分為67個功能組，根據(jù)注釋功能的不同又可分為3大類：分子功能（Molecular Function）、生物過程（Biological Process）和細胞組分（Cellular Component）。其中分子功能共包含19個功能組，主要為黏合物（Binding）、催化活性（Catalytic Activity）和轉(zhuǎn)運活性（Transporter Activity）；生物過程共包含26個功能組，主要為細胞過程（Cellular Process）、新陳代謝過程（Metabolic Process）和生物調(diào)節(jié)（Biological Regulation）；細胞組分共包含22個功能組，主要為細胞（Cell）、細胞組分（Cell Part）和細胞器（Organelle）。

圖2 Unigene的GO功能分類Fig. 2 GO functional classification of unigene

將獲得的Unigene在KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫中進行注釋與分類（李向真等, 2012），結(jié)果如圖3所示。得到注釋的Unigene共劃分為5大類：細胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、代謝（Metabolism）和機體系統(tǒng)（Organismal Systems）。細胞過程中注釋Unigene較多的是運輸和分解代謝（Transport and Catabolism）、細胞生長與死亡（cell growth and death）；環(huán)境信息處理中注釋Unigene較多的是信號傳導（signal transduction）、膜轉(zhuǎn)運（membrane transport）；遺傳信息處理中注釋Unigene較多的是翻譯（translation）、折疊分揀和降解（folding sorting and degradation）；代謝中注釋Unigene較多的是碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、概述（overview）與氨基酸代謝（amino acid metabolism）；機體系統(tǒng)中注釋Unigene較多的是內(nèi)分泌系統(tǒng)（endocrine system）、免疫系統(tǒng)（immune system）。

圖3 Unigene的KEGG代謝通路分類Fig. 3 KEGG pathway classification of unigene

2.3 差異表達基因分析

將3組樣品兩兩比較進行差異表達分析，以q＜0.05、|log2Fold Change|＞1為條件，篩選差異表達基因（Different Expression Genes，DEGs），繪制火山圖如圖4所示。共篩選到1190個DEGs，統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。 LG組與CG組中有411個DEGs，其中上調(diào)Unigene 169個，下調(diào)Unigene 242個；HG組與CG組中有56個DEGs，其中上調(diào)Unigene 9個，下調(diào)Unigene 47個；HG組與LG組中有723個DEGs，其中上調(diào)Unigene 319個，下調(diào)Unigene 404個。與互花米草耐鹽有關(guān)的上調(diào)表達Unigene有脯氨酸代謝相關(guān)基因（SaP5CS2）、穩(wěn)定Na+/K+比例的陽離子轉(zhuǎn)運體基因（HKT7）、鈉/氫交換器基因（NHX2）、抗K+外流基因（K+efflux antiporter 5）、葉綠體中脂氧合酶基因（Lipoxygenase,LOX2）、光系統(tǒng)Ⅱ穩(wěn)定性基因（Photosystem II stability/assembly factor HCF136）、泛素連接酶E3基因（E3 ubiquitin-protein ligase）等。

圖4 樣品組間基因差異表達分析火山圖Fig. 4 Volcano plot of differentially expressed genes between the two groups

表3 樣品組間的差異表達基因數(shù)量Table 3 Number of differentially expressed gene between the two groups

2.4 差異表達基因的GO功能富集分析

用GO seq軟件對三組樣本兩兩比較得到的差異表達Unigene分別進行GO富集分析，結(jié)果如表4所示。3組分別富集到2481、1146、2160個GO terms，分為分子功能、生物過程和細胞成分三部分，其中生物過程最多，分別占總數(shù)的74.32%、78.36%和70.93%。將GO富集分析的前10個結(jié)果作為主要節(jié)點，繪制有向無環(huán)圖（Directed Acyclic Graph，DAG）如圖S（附錄）所示。其中與互花米草高鹽度抗性相關(guān)的為GO: 0022857（跨膜轉(zhuǎn)運形成）、GO: 0098660（無機離子跨膜運輸）、GO:0015318（無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性）、GO: 0098662（無機陽離子跨膜運輸）、GO: 0015081（鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運器活性）、GO: 0035725（鈉離子跨膜運輸）、GO: 0015078（質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運器活性）、GO:0004129（細胞色素-C氧化酶活性）、GO: 003310（線粒體呼吸鏈復合體的組裝）、GO: 0017004（細胞色素復合體組裝）、GO: 0070469（呼吸鏈）、GO: 0098803（呼吸鏈復合體）、GO: 0017062（呼吸鏈復合體III的組裝）、GO: 0034551（線粒體呼吸鏈復合體III）、GO: 0045277（呼吸鏈復合體IV）、GO: 0016661（氧化還原酶活性，作用于其他含氮化合物作為供體）、GO: 0016705（氧化還原酶活性，作用于成對的供體，結(jié)合或還原分子氧）、GO: 0008940（硝酸還原酶活性）、GO: 0046857（氧化還原酶活性，作用于其他含氮化合物作為供體，NAD或NADP作為受體）、GO: 001670（氧化還原酶活性，作用于成對的供體，結(jié)合或還原分子氧，NADPH為供體，結(jié)合一個氧原子）、GO: 0009703（硝酸還原酶NADH活性）、GO: 0009507（葉綠體）、GO: 0034357（光合作用膜）、GO: 0042651（類囊體膜）、GO:0055035（質(zhì)體類囊體膜）、GO: 0009535（葉綠體類囊體膜）、GO: 0046906（四吡咯結(jié)合蛋白）和GO:0016168（葉綠素結(jié)合蛋白）。

表4 差異表達基因GO富集分析Table 4 GO enrichment analysis of differential expressed genes

2.5 差異表達基因的KEGG通路富集分析

使用KEGG數(shù)據(jù)庫對所有差異表達Unigene的代謝通路進行富集分析，對每組前30個富集通路做散點圖，富集結(jié)果如圖5所示。在LGvsCG組中，差異表達Unigene富集到118條代謝通路中，其中顯著富集（P＜0.05）的KEGG通路有20條，顯著富集的通路有血小板激活（platelet activation）、黏著物（focal adhesion）、白細胞內(nèi)皮遷移（leukocyte transendothelial migration）等信號通路，主要與細胞過程有關(guān)；在HG組與CG組中，差異表達Unigene富集到14條代謝通路中，其中顯著富集（P＜0.05）的KEGG通路有13條，顯著富集的通路有光合作用-天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins）、ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）、黏著物（focal adhesion）等信號通路，最顯著富集的通路主要與耐鹽相關(guān)；在HG組與LG組中，差異表達Unigene富集到98條代謝通路中，其中顯著富集（P＜0.05）的KEGG通路有17條，顯著富集的通路有神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路（neurotrophin signaling pathway）、氰氨酸代謝（cyanoamino acid metabolism）、硫代葡萄糖苷生物合成（glucosinolate biosynthesis）等信號通路，顯著富集通路可提高互花米草的耐鹽性。

圖5 差異表達基因的KEGG功能富集Fig. 5 KEGG functional enrichment of differentially expressed genes

2.6 不同鹽度脅迫下功能-基因互作關(guān)系

在KEGG數(shù)據(jù)庫中利用獲得的DEGs進行注釋與分類，挑選富集程度最高的前10個功能和與該功能相關(guān)的差異Unigene繪制不同鹽度脅迫下顯著富集功能-基因互作網(wǎng)絡圖（Damian et al, 2015; Finn et al, 2016），互作關(guān)系如圖6所示。其中，顯著富集到與互花米草抗逆有關(guān)的途徑有苯丙素代謝途徑（Phenylpropanoid Biosynthesis）、氧化磷酸化途徑（Oxidative Phosphorylation）（LG組與CG組）、氮代謝（Nitrogen Metabolism）、光合作用-天線蛋白（Photosynthesis-Antenna proteins）、ECM-受體相互作用（ECM-Receptor Interaction）、P13K-Akt信號通路（PI3K-Akt Signaling Pathway）、氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）等途徑（HG組與CG組），氰基氨酸代謝（Cyanoamino Acid Metabolism）、硫代葡萄糖苷生物合成（Glucosinolate Biosynthesis）、油菜素類固醇生物合成（Brassinosteroid Biosynthesis）、角質(zhì)、木栓和蠟生物合成（Cutin, Suberine and Wax Biosynthesis）（HG組與LG組）。顯著富集到的與互花米草抗逆有關(guān)的上調(diào)Unigene主要有K04392-ko04014 Ras信號通路（LG組與CG組）、 K02149-ko00190氧化磷酸化（LG組與CG組）、K04392-ko04014 Ras信號通路（HG組與LG組）、K06630-ko04722 神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路（HG組與LG組）、K13027-ko00966 硫代葡萄糖苷生物合成（HG組與LG組）。

圖6 樣品間顯著富集功能-基因互作網(wǎng)絡圖Fig. 6 Significant enrichment functional-gene interaction network diagram between the two groups

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及差異基因分析

將各鹽度脅迫處理的互花米草葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，得到的RNA-seq整體質(zhì)量評估較好，所測樣本無論是在測序數(shù)據(jù)量、測序錯誤率或是GC含量等方面都足以支撐后續(xù)實驗及分析的要求。共獲得121760個Unigene，長度范圍201～12705 bp，平均長度633 bp，N50為1046 bp。將獲得的Unigene與NR、NT、KEGG、PFAM等8個常用數(shù)據(jù)庫進行對比，結(jié)果表明57.86%的Unigene被至少1個數(shù)據(jù)庫注釋。

本文共得到1190個差異表達Unigene，其中LG組與CG組中有411個（上調(diào)Unigene 169個，下調(diào)Unigene 242個）、HG組與CG組中有56個（上調(diào)Unigene 9個，下調(diào)Unigene 47個）、HG組與LG組中有723個（上調(diào)Unigene 319個，下調(diào)Unigene 404個）。對各組差異Unigene進行深入挖掘分析，發(fā)現(xiàn)大量與互花米草抗鹽性相關(guān)的基因上調(diào)，如葉綠體中的脂氧合酶基因、磷脂酶基因、光系統(tǒng)Ⅱ穩(wěn)定性因子基因等。Mei等（2023）研究發(fā)現(xiàn)玉米可通過調(diào)控脂質(zhì)運輸相關(guān)基因的表達來調(diào)節(jié)光合膜中的脂質(zhì)組成，維持其在鹽脅迫下的光合活性和正常生長（Mei et al, 2023）。Temme等（2020）通過鹽度脅迫向日葵發(fā)現(xiàn)，累積的Na+會造成離子毒性風險，耐鹽植物可以通過離子轉(zhuǎn)運體將體內(nèi)多余鈉離子（Na+）轉(zhuǎn)運出體外，穩(wěn)定Na+/K+比例，也是維持植物正常代謝的必要條件（Temme et al, 2020）。在本研究中，LG組與CG組和HG組與LG組中富集到的陽離子轉(zhuǎn)運體基因、鈉/氫交換器基因、抗K+外流基因和鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因等Unigene表達量均顯著上調(diào)。非生物脅迫作用下，植物體內(nèi)脯氨酸作為兼容的滲透劑合成代謝會顯著提升（Hildebrandt, 2018; Batista-Silva et al, 2019），在LG組與CG組，與脯氨酸、蛋氨酸、絲氨酸和谷氨酸等氨基酸代謝與轉(zhuǎn)運相關(guān)Unigene顯著上調(diào)，包括SaP5CS2、蛋氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Methionine S-methyltransferase）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶EDR1基因（Serine/threonine-protein kinase EDR1）谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶2基因（Glutamate glyoxylate aminotransferase 2）等。此外，本研究中泛素連接酶（E3）Unigene表達量顯著上調(diào)，有報道稱該基因在植物-非生物脅迫（如高鹽度、干旱）相互作用中起調(diào)節(jié)作用（Shu et al, 2017）。因此，互花米草在受到鹽脅迫時，可以高度調(diào)動相關(guān)基因大量表達，從而使其具有較強的適應性與競爭優(yōu)勢。

3.2 GO注釋分析

對差異表達Unigene進行GO功能注釋與分類，主要分為3大類：細胞組分、分子功能和生物過程，其中生物過程占比最多，均達到70.93%及以上。生物過程中的細胞過程、代謝過程、刺激應答、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)控和定位等表達基因被大量富集，此外，還大量富集到與催化活性有關(guān)的分子功能相關(guān)基因和與細胞、細胞成分、細胞器、膜等細胞組分等有關(guān)的表達基因（圖2）。其中，刺激應答、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)控和細胞膜相關(guān)過程與植物的生長發(fā)育和脅迫應答調(diào)控密切相關(guān)，這些基因在互花米草應對鹽脅迫過程中被大量富集，其耐鹽響應是多生物過程共同調(diào)控（王濤濤, 2020）。

3.3 KEGG注釋分析KEGG

代謝通路富集分析表明，差異表達Unigene富集到118條代謝通路中，其中有多條代謝通路可以響應鹽度脅迫。細胞過程（如運輸和分解代謝（Juan et al, 2023））、遺傳信息處理過程（如翻譯、折疊分揀和降解（Monika et al, 2022））、環(huán)境信息處理過程中的信號傳導（如信號傳導（Wu et al, 2018）、膜轉(zhuǎn)運（Yuriko et al, 2014））和與應對脅迫有關(guān)的代謝過程（如碳水化合物代謝（Gao et al, 1998）、與氨基酸代謝（Batista‐Silva et al, 2019））都有大量基因被富集。因此互花米草可通過調(diào)動體內(nèi)多條代謝途徑來共同響應鹽度脅迫。

3.4 基因蛋白互作分析

高鹽度對比低鹽度的功能-基因互作網(wǎng)絡圖中也可見高表達的抗逆相關(guān)途徑。本研究中互花米草啟動多條代謝通路來響應高鹽度脅迫，同時有多個基因參與應答。其中互花米草的角質(zhì)、木栓和蠟生物合成，苯丙素、氮代謝，P13K-Akt信號通路、ECM-受體相互作用，氧化磷酸化等途徑在互花米草高鹽度脅迫處理時顯著激活。角質(zhì)和蠟是植物表皮的主要前體，能提供其各種脅迫保護，植物最適環(huán)境的改變會調(diào)動合成表皮前體基因的表達（Ayaz et al, 2021），因此，互花米草通過增加其莖葉等器官中角質(zhì)和蠟的表達，來增強其生物入侵能力及高鹽度抗性。鹽度脅迫會抑制植物吸收、運輸和利用含氮離子氮元素，進而影響氮代謝，進而影響植物代謝的中心“樞紐”——苯丙素途徑，該途徑在調(diào)控植物抗鹽度脅迫過程中發(fā)揮重要作用，可直接影響木質(zhì)素的積累量（Xu et al, 2022; 尚軍等, 2022），氮還可與硫代葡萄糖苷等物質(zhì)協(xié)作干預外源脅迫（Ashraf et al, 2018; Landi et al, 2019; Jia et al, 2022）。而硫代葡萄糖苷合成代謝的某一種調(diào)控途徑由油菜素內(nèi)酯參與。油菜素內(nèi)酯是國際公認的最有效、無毒的植物生長激素，能調(diào)節(jié)植物的光合作用、呼吸作用、蒸騰作用，還能提高植物的抗逆性（Liu et al, 2022）。另外，在高鹽的環(huán)境中，植物可通過保持有效的光合作用和防止氧化損傷來抵御鹽脅迫（陳健妙等, 2009; Rados?aw et al, 2021）。在基因-功能互作HG組與CG組中多次被富集到的P13K-Akt信號通路的研究集中在抗炎抗病性，尤其是動物腫瘤方面（Yu et al, 2022; Wang et al,2023），推測在高鹽脅迫下互花米草調(diào)動了該通路應對脅迫。ECM-受體相互作用在HG組與CG組和LG組與CG組都明顯富集到，可能與柳樹、白刺等（武香等, 2012）滲透調(diào)節(jié)的生理相應相似，互花米草為應對NaCl脅迫可能調(diào)動了細胞外基質(zhì)受體的應對機制，調(diào)節(jié)K+/Na+比例及其他可以調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)以適應鹽度脅迫。以上途徑的正常運作都需要大量能量供給，而且需要大量的能量來轉(zhuǎn)運離子以維持滲透壓（梁書榮等, 2021; Ikram et al, 2022）。本研究發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化通路在鹽度為24（LG）和32（HG）時被大量富集，而且與CG組相比，處于高鹽度環(huán)境中的LG與HG組中，NADH脫氫酶（ND4）與細胞色素C氧化酶（COX1、COX3）也顯著上調(diào)，這表明鹽脅迫下互花米草通過激活氧化磷酸化通路來響應鹽脅迫，驅(qū)動ATP合成增加來供給各高抗途徑。此外，還有大量與鹽脅迫相關(guān)的代謝通路，如脯氨酸（湯華等, 2007）、糖代謝（許興等, 2006） 、氰基氨酸代謝（Xu et al, 2023）等，在本研究的轉(zhuǎn)錄組中也被富集到。湯華等（2007）研究玉米苗期耐鹽性發(fā)現(xiàn)游離脯氨酸隨著鹽度增高而增高（湯華等, 2007），在本實驗中與脯氨酸合成代謝有關(guān)的基因SaP5CS2被富集到。氰化物是一種抑制細胞呼吸的有毒化學物質(zhì)，Xu等在擬南芥耐鹽性研究中發(fā)現(xiàn)與氰基氨酸代謝有關(guān)的氰基丙氨酸合酶和氧化酶相互作用對于提高植物耐鹽性是必不可少的，與本實驗氰基氨酸代謝途徑上調(diào)相符。

4 結(jié)語

互花米草作為一種鹽沼植物，其在我國濱海濕地地區(qū)的大量入侵及擴散與其對環(huán)境的適應性機制有重要的聯(lián)系，因此對互花米草的防治要從其關(guān)鍵的入侵機制進行研究。本文主要通過對10（CG）、24（LG）和32（HG）三種不同鹽度處理的互花米草進行轉(zhuǎn)錄組學測序及分析，挖掘到互花米草響應鹽度脅迫的多個關(guān)鍵耐鹽基因（如SaP5CS2、HKT7、NHX2等）及代謝通路（如脯氨酸代謝通路、氮代謝通路等），這些基因及代謝通路通過調(diào)控互花米草體內(nèi)脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、角質(zhì)和蠟等抗脅迫物質(zhì)、調(diào)控Na+/K+平衡、激活P13K-Akt等信號通路等多種途徑共同影響互花米草的入侵及擴散能力。本研究在分子水平上揭示了互花米草對高鹽度脅迫的響應機制，并初步探討了與其在生物入侵及擴散過程中的重要作用，為互花米草等鹽生入侵物種防控手段提供新的啟示。

附 錄