吳林，楊蘇渝，楊陽，廖喜梅，朱學(xué)棟，朱菲菲，梁峰銘，李勇，呂典秋

1.西南大學(xué) 西部(重慶)科學(xué)城種質(zhì)創(chuàng)制大科學(xué)中心，重慶 400715；2.西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715；3.重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 涪陵 408099；4.巫溪縣署光農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，重慶 巫溪 405899；5.安順學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，貴州 安順 561000；6.薯類生物學(xué)與遺傳育種重慶市重點實驗室，重慶 400715

馬鈴薯是種植面積僅次于小麥、水稻和玉米的第4大糧食作物[1]．中國是全球馬鈴薯第一大生產(chǎn)國．據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù),2021年我國馬鈴薯種植面積約460.6萬hm2,產(chǎn)量達1 830.9萬t．馬鈴薯塊莖采后發(fā)芽不僅顯著降低商品價值,而且還嚴重威脅種薯的質(zhì)量安全,造成巨大的經(jīng)濟損失[2]．

為抑制馬鈴薯塊莖采后發(fā)芽,國內(nèi)外已開發(fā)出多種方法[3]．如使用化學(xué)抑芽劑,包括氯苯胺靈(Chlorpropham,CIPC)[4]、過氧化氫(Hydrogen Peroxide Plus,HPP)[5]、精油[6]等．其中,CIPC應(yīng)用最為廣泛[4]．但是,CIPC的抑芽作用不可逆,會嚴重影響種薯芽的活性;加之CIPC具有致癌性和毒性,2020年起歐盟已撤銷其產(chǎn)品登記[7]．此外,紫外(Ultraviolet,UV)輻射處理也可以有效降低馬鈴薯采后發(fā)芽率[8]．

以往的研究發(fā)現(xiàn),馬鈴薯塊莖從休眠到發(fā)芽過程受植物激素嚴格調(diào)控．脫落酸(Abscisic acid,ABA)是促進馬鈴薯塊莖休眠的主要物質(zhì),通過抑制細胞分裂及降低塊莖中能量代謝抑制發(fā)芽[9]．與ABA作用相反,赤霉素(Gibberellins,GAs)促進馬鈴薯塊莖發(fā)芽[10]．此外,細胞分裂素、生長素、茉莉酸等植物激素也具有調(diào)控馬鈴薯塊莖采后休眠的作用[11]．

近年來,隨著測序技術(shù)和高通量篩選技術(shù)的發(fā)展,部分馬鈴薯休眠調(diào)節(jié)相關(guān)基因已被挖掘．Faivre-Rampant等[12]利用休眠和休眠解除的馬鈴薯塊莖構(gòu)建抑制性消減雜交文庫(Suppression Subtractive Hybridization,SSH),篩選到385個差異表達基因;功能富集分析表明參與轉(zhuǎn)錄的相關(guān)基因表達發(fā)生顯著變化．Liu等[13]利用休眠與發(fā)芽塊莖構(gòu)建SSH文庫,鑒定到300個差異基因;與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在馬鈴薯解除休眠時顯著上調(diào)表達．Li等[14]利用轉(zhuǎn)錄組測序分析了樟腦抑制馬鈴薯采后休眠的差異基因和蛋白,鑒定到約4 000個差異表達轉(zhuǎn)錄本;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)分析表明,樟腦可能通過調(diào)控馬鈴薯塊莖中內(nèi)源植物激素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制發(fā)芽．

馬鈴薯塊莖休眠和發(fā)芽的分子調(diào)控機制已有少量報道．Farre等[15]利用馬鈴薯塊莖特異表達基因Patatin的啟動子,在塊莖中特異表達大腸桿菌無機焦磷酸酶基因PPase,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖較野生型提前6～7周發(fā)芽．Carrera等[16]發(fā)現(xiàn)超表達馬鈴薯赤霉素合成酶關(guān)鍵基因GA20-oxidasse,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖出現(xiàn)提前發(fā)芽表型．Pasare等[17]證明,抑制馬鈴薯獨腳金內(nèi)脂(Strigolactone,SLs)生物合成關(guān)鍵酶基因CCD8會顯著縮短轉(zhuǎn)基因馬鈴薯休眠期．Li等[18]發(fā)現(xiàn)異源過表達馬鈴薯StHSP26.5基因,轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽被顯著提前．相反,在馬鈴薯中沉默alpha-amylase基因StAmy23則會顯著抑制塊莖發(fā)芽[19]．最近的研究證明,轉(zhuǎn)錄因子基因StTCP15通過介導(dǎo)ABA與GA的動態(tài)平衡調(diào)控馬鈴薯塊莖發(fā)芽[20]．

本研究通過馬鈴薯塊莖采后發(fā)芽過程中的表型觀察、細胞學(xué)特性分析、生理生化指標檢測及發(fā)芽marker基因(dUTPase)表達變化等,明確了塊莖休眠期、休眠解除期及芽生長期3個關(guān)鍵時間點．通過Illumina測序平臺對3個時期的塊莖進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,挖掘馬鈴薯采后發(fā)芽關(guān)鍵基因,并從植物激素合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)角度系統(tǒng)分析了植物激素在調(diào)控馬鈴薯塊莖發(fā)芽中的功能,為馬鈴薯塊莖發(fā)芽關(guān)鍵基因功能解析和作用機制研究奠定了分子學(xué)基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2022年秋季將馬鈴薯短休眠期栽培品種‘費烏瑞它’種植于重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗基地,常規(guī)田間管理,成熟時挑選300個大小均勻(約40 g/個)、健康、無損傷的塊莖,洗凈、自然干燥后,置于暗黑環(huán)境(室溫22 ℃±2 ℃、相對濕度75%)中愈合1周,開始進行發(fā)芽統(tǒng)計．期間,每隔15 d進行拍照記錄,并參考Li等[14]的取樣方法進行取樣,每個時間點設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)．樣品經(jīng)液氮速凍后,置于-80 ℃保存,用于后續(xù)試驗．

1.2 塊莖發(fā)芽過程的細胞學(xué)觀察

塊莖發(fā)芽過程的細胞學(xué)觀察主要參考Liu等[13]的取樣和切片制作方法．以塊莖頂芽為中心,用直徑5 mm的打孔器取樣,樣品置于福爾馬林-醋酸-酒精固定液(FAA)(70%酒精∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5)中,真空處理10 min,于4 ℃保存．切片采用萊卡RM2016切片機,成像采用尼康Eclipse E100光學(xué)顯微鏡+尼康DS-U3成像系統(tǒng)．

1.3 塊莖發(fā)芽過程的ABA和GA3檢測

ABA和GA3檢測分別采用江蘇酶免實業(yè)有限公司(http：//www.mmbio.cn/)的植物脫落酸(ABA)ELISA試劑盒(MM1185-01)與植物赤霉素(GA3)ELISA試劑盒(MM-3587201),參照說明書進行檢測．

1.4 塊莖發(fā)芽過程中的淀粉、可溶性糖、蛋白檢測

淀粉、可溶性糖、蛋白含量檢測分別采用蘇州格銳思生物科技有限公司(http：//www.geruisi-bio.com/)的淀粉含量測定試劑盒(蒽酮比色法,G0507W)、可溶性糖含量(SS)測定試劑盒(蒽酮比色法,G0501W)、蛋白含量(SP)測定試劑盒(雙縮脲法,G0432W),參照說明書進行檢測．

1.5 Total RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測序

馬鈴薯塊莖Total RNA提取采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN,德國)．Total RNA純度檢測采用NanoDrop 2000((Invitrogen,美國);完整性檢測采用Agient2100(Agilent Technologies,美國)．核糖體RNA去除采用Epicenter Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit (Epicenter,Madison,美國)．cDNA文庫構(gòu)建采用NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit(NEB,美國)．轉(zhuǎn)錄組測序在百邁客生物科技有限公司Illumina Novaseq6000測序平臺進行．為提高分析質(zhì)量,帶接頭和低質(zhì)量序列被去除．利用HISAT2軟件將Clean Reads與馬鈴薯DM參考基因組(http：//spuddb.uga.edu/dm_v6_1_download.shtml)進行精確比對,再利用String Tie軟件對比對上的Reads進行組裝,用于后續(xù)分析[21-22]．轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(Accession number：PRJNA1003271)．

1.6 差異表達基因篩選與KEGG富集分析

利用DESeq2軟件對測序數(shù)據(jù)進行差異表達基因分析,篩選標準設(shè)置為|Fold Chang|≥2且p-value<0.01．將KOBAS 2.0(https：//www.biostars.org/p/200126/)用于KEGG富集分析,顯著富集篩選標準為p-value<0.05．

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,隨機挑選8條差異表達基因,利用NCBI網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)設(shè)計特異引物(表1)．采用FastPure? Plant Total RNA Isolation Kit (Polysaccharides &Polyphenolics-rich)(Vazyme,中國)提取馬鈴薯發(fā)芽樣品總RNA．利用HiScritpt? III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) (Vazyme,中國)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA．Quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR-PCR) 采用Bio-Rad CFX Connect Real-Time System with iTaq Universal SYBR?Green Supermix(Bio-Rad,美國)進行處理．程序設(shè)置為95 ℃變性3 min,(95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s)× 40循環(huán),并進行溶解曲線分析．相對表達計算采用2-ΔΔCt[1]．馬鈴薯Ef1α為內(nèi)參基因[19-20]．

表1 定量引物序列

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯塊莖貯藏過程中頂芽形態(tài)和細胞特性分析

為明確馬鈴薯塊莖發(fā)芽過程中頂芽形態(tài)和細胞特性變化,本研究對馬鈴薯貯藏過程中的頂芽形態(tài)和細胞變化進行了持續(xù)觀察．如圖1所示,貯藏初期(0～15 d),馬鈴薯頂芽頂端分生組織(Apical meristem,AM)細胞處于停止分裂狀態(tài),未見白色的芽生長．貯藏30 d時,隨著休眠解除,頂芽AM細胞與葉原基(leaf primordia,LP)細胞開始活化并快速分裂,可見白色芽點．貯藏45 d時,頂芽繼續(xù)生長,白色的頂芽長至2 mm．貯藏60 d時,白色頂芽長至5 mm,LP持續(xù)分裂形成可見的葉,同時原形成層(Procambial,PC)和早期維管組織出現(xiàn)．

2.2 馬鈴薯塊莖貯藏過程中頂芽的生理生化與內(nèi)源植物激素變化

為分析馬鈴薯塊莖貯藏過程中頂芽的生理生化與內(nèi)源植物激素變化,作者分別檢測了貯藏0～45 d內(nèi)的頂芽中可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)、ABA、GA3含量及dUTPase基因表達變化．結(jié)果如圖2所示,在貯藏過程中,頂芽組織中的淀粉含量和蛋白質(zhì)含量顯著降低,可溶性糖含量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢．ABA含量呈顯著下降趨勢;與之相反,GA3含量呈顯著上升趨勢,但第30 d與第45 d并無顯著變化．qRT-PCR結(jié)果表明,馬鈴薯發(fā)芽相關(guān)marker基因dUTPase的表達趨勢與發(fā)芽表型一致,在貯藏后30 d(休眠解除)開始顯著上調(diào)表達,在芽生長過程中(30～60 d)呈先顯著升高再下調(diào)的趨勢．因此,本研究結(jié)合發(fā)芽表型與細胞學(xué)分析結(jié)果,最終明確了馬鈴薯貯藏發(fā)芽的3個關(guān)鍵時期,即30 d為芽休眠解除期,45 d為芽生長期．

A為馬鈴薯塊莖貯藏過程中(0～60 d)頂芽形態(tài)變化,標尺為1 cm;B為馬鈴薯貯藏過程中(0～60 d)頂芽細胞切片觀察,D0,D15與D30標尺為50 μm,D45標尺為100 μm,D60標尺為200 μm;P表示周皮、E表示表皮、AM表示頂端分生組織、LP表示葉原基、PC表示原形成層．圖1 馬鈴薯貯藏過程中頂芽形態(tài)與細胞特性

2.3 馬鈴薯塊莖發(fā)芽轉(zhuǎn)錄組測序分析

為挖掘調(diào)控馬鈴薯塊莖發(fā)芽的關(guān)鍵基因,本研究利用RNA-seq技術(shù)對馬鈴薯塊莖發(fā)芽3個關(guān)鍵時期(D0：休眠期;D30：休眠解除期;D45：芽生長期)樣本進行了分析．如表2所示,9個測序樣品Q30(堿基測序正確率為99.99%)均在92.76%以上．各樣品比對參考基因組的效率在79.67%～84.33%之間,說明所得到的有效數(shù)據(jù)質(zhì)量和準確度較高,可以滿足后期數(shù)據(jù)分析．

2.4 馬鈴薯塊莖發(fā)芽過程中的差異表達基因篩選及KEGG富集分析

差異表達基因篩選結(jié)果如圖3所示,從休眠期(D0)到休眠解除期(D30)總共有1 008個基因表達量發(fā)生顯著變化,其中上調(diào)表達的基因為252個,下調(diào)表達的基因為756個．從休眠解除期(D30)到芽生長期(D45)共有4 576個基因表達量發(fā)生顯著變化,其中上調(diào)表達的基因為2 800個,下調(diào)表達的基因基因為1 696個．在這些基因中,總共有355個基因持續(xù)地發(fā)生顯著變化．

圖3 馬鈴薯貯藏過程中表達差異基因篩選

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)(圖4),這些差異表達基因主要富集在苯丙烷生物合成通路(Phenylpropanoid biosynthesis,ko00940)、苯丙氨酸代謝通路(Phenylalanine metabolism,ko00360)、類胡蘿卜素生物合成通路(Carotenoid biosynthesis,ko00100)、DNA復(fù)制(DNA replication,ko03030)和糖代謝通路(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism,ko00520)等．

q-value<0.05．圖4 馬鈴薯貯藏過程中差異表達基因KEGG富集分析

2.5 馬鈴薯塊莖發(fā)芽關(guān)鍵基因挖掘

植物激素ABA與GA是調(diào)控馬鈴薯采后發(fā)芽的關(guān)鍵因素[9-10]．本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在馬鈴薯塊莖發(fā)芽過程中ABA含量顯著下調(diào),而GA3含量顯著上升(圖2D,圖2E)．如圖5所示,在馬鈴薯塊莖發(fā)芽過程中,ABA生物合成酶基因NCED4,ZEP,ABA受體基因PYL8-like及ABA信號通路正調(diào)控基因ABI5,ABI5-like均顯著下調(diào)表達;ABA代謝相關(guān)基因CYP707A2與ABA信號通路負調(diào)控基因PP2C卻顯著上調(diào)表達．與之相反,GA生物合成酶基因KS,KO2顯著上調(diào)表達;GA信號通路抑制基因SCL1/3/8顯著下調(diào)表達．有趣的是,本研究發(fā)現(xiàn)GA合成酶基因GA20ox1顯著上調(diào)表達,而GA受體基因GID1B-like顯著下調(diào)表達．

此外,本研究還系統(tǒng)挖掘了馬鈴薯采后發(fā)芽過程中顯著差異表達的轉(zhuǎn)錄因子基因．結(jié)果如表3所示,在馬鈴薯休眠期(D0)到休眠解除期(D30),共有46個轉(zhuǎn)錄因子基因表達發(fā)生顯著變化,其中AP2轉(zhuǎn)錄因子家族與MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員最多,分別有11個．在休眠解除期(D30)到芽生長期(D45),共有156個轉(zhuǎn)錄因子基因表達發(fā)生顯著變化,其中MYB,bHLH和AP2轉(zhuǎn)錄因子家族成員最多,分別為38,26和22個．

表3 馬鈴薯發(fā)芽過程中顯著差異表達的轉(zhuǎn)錄因子基因

2.6 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性,本研究隨機挑選了8個顯著差異表達基因,并利用qRT-PCR技術(shù)對其在馬鈴薯發(fā)芽樣本中的表達量進行了檢測．如圖6所示,qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的趨勢完全一致,表明獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性較高．

FPKM為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù);相對表達量為qRT-PCR數(shù)據(jù)．圖6 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

3 討論

為明確‘費烏瑞它’馬鈴薯采后發(fā)芽過程的關(guān)鍵變化時期,本研究對采后貯藏過程中的塊莖頂芽表型及細胞學(xué)特性進行了分析．結(jié)果表明,‘費烏瑞它’馬鈴薯采后發(fā)芽可分為3個關(guān)鍵時期,分別為休眠期(0 d),休眠解除期(30 d)和芽生長期(45 d),該結(jié)果與Li等[14]的報道相一致．Li等發(fā)現(xiàn),采后貯藏30～70 d,‘費烏瑞它’馬鈴薯的芽可長至2～10 mm．然而,Liu等[13]報道,‘費烏瑞它’馬鈴薯采后第8周為休眠解除期,第9周芽長才長至2 mm．引起這種差異的主要原因可能是Liu等[13]發(fā)芽試驗采用的是試管薯(0.5 g/個),而本研究與Li等[14]均采用大田收獲的馬鈴薯(約40 g/個)．Ebrahim等[23]證明,馬鈴薯休眠期與塊莖大小成反比,通常更小的薯采后發(fā)芽更慢．

在馬鈴薯采后發(fā)芽過程中,可溶性糖含量顯著增加、蛋白與淀粉含量顯著減少．本研究結(jié)果與張路[24]的結(jié)果一致．在貯藏過程中,馬鈴薯塊莖內(nèi)淀粉和還原性糖相互轉(zhuǎn)化,為馬鈴薯塊莖發(fā)芽提供能量．而鞏慧玲等[25]研究發(fā)現(xiàn),馬鈴薯塊莖中蛋白含量在貯藏期間比較穩(wěn)定,變化不大．同時,本研究發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯塊莖發(fā)芽過程中,內(nèi)源植物激素ABA含量顯著減少,GA3含量顯著增加．結(jié)果與前人的報道一致[9-10]．

RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn),‘費烏瑞它’馬鈴薯塊莖從休眠期(D0)到休眠解除期(D30)共有1 008個基因表達發(fā)生顯著變化．休眠解除期(D30)到芽生長期(D45)共有4 576個基因表達發(fā)生顯著變化．其中,355個基因表達在貯藏過程中持續(xù)地發(fā)生顯著變化．差異變化基因數(shù)量較之前Li等[14]的報道更多,Li等[14]發(fā)現(xiàn),‘費烏瑞它’馬鈴薯塊莖休眠期到芽生長期共有3925個基因表達發(fā)生顯著變化．因此,本研究的數(shù)據(jù)進一步補充了馬鈴薯塊莖發(fā)芽相關(guān)基因．

馬鈴薯塊莖發(fā)芽過程顯著變化基因被富集到苯丙烷生物合成通路(ko00940)、苯丙氨酸代謝通路(ko00360)、類胡蘿卜素生物合成通路(ko00100)、DNA復(fù)制(ko03030)和糖代謝通路(ko00520)等．研究結(jié)果表明,苯丙烷生物合成通路、苯丙氨酸代謝、類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因可能參與馬鈴薯塊莖發(fā)芽調(diào)控,這與前人的報道一致．例如,Conrad等[26]發(fā)現(xiàn)杏樹的芽休眠解除可能與苯丙氨酸代謝高度相關(guān)．Deng等[27]報道,馬鈴薯的Snakin-2(SN2)基因通過負調(diào)控木質(zhì)素生物合成,顯著抑制塊莖采后發(fā)芽．

本研究還發(fā)現(xiàn)從馬鈴薯休眠期(D0)到休眠解除期(D30),共有46個轉(zhuǎn)錄因子基因表達發(fā)生顯著變化;從休眠解除期(D30)到芽生長期(D45)共有156個轉(zhuǎn)錄因子基因表達發(fā)生顯著變化．這些轉(zhuǎn)錄因子基因主要屬于AP2轉(zhuǎn)錄因子家族、MYB轉(zhuǎn)錄因子家族及bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族．同時,ABA與GA生物合成、代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達也發(fā)現(xiàn)了顯著變化,說明AP2,MYB,bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因,ABA與GA合成、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因可能在調(diào)控馬鈴薯采后發(fā)芽過程中發(fā)揮了重要作用,與前人報道一致．例如,Wang等[28]發(fā)現(xiàn),大豆的一個AP2轉(zhuǎn)錄因子基因GmSGR通過減少ABA的敏感性顯著促進種子發(fā)芽．Himi等[29]發(fā)現(xiàn),大麥的一個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因Ant28通過調(diào)節(jié)花青苷合成顯著抑制種子萌發(fā)．Liu等[30]報道,擬南芥中過表達ABA代謝酶基因CYP707A導(dǎo)致ABA含量顯著減少,種子發(fā)芽顯著提前．

4 結(jié)論

馬鈴薯‘費烏瑞它’塊莖貯藏30 d時芽休眠解除;貯藏45 d時芽開始生長．在貯藏過程中,可溶性糖含量顯著增加、淀粉和蛋白含量顯著減少．從芽休眠到休眠解除,休眠解除到芽生長分別有1 008個、4 576個基因表達發(fā)生顯著變化,其中355個基因持續(xù)地發(fā)生顯著變化．在這些差異表達基因中,包括156個轉(zhuǎn)錄因子基因,大多屬于AP2,MYB,bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族．這些差異表達基因被富集到苯丙烷生物合成通路、苯丙氨酸代謝通路、類胡蘿卜素生物合成通路、DNA復(fù)制和糖代謝通路．