張苗，高甜，杜曉鸝，岳鑫，張微，王芳，曹曉東，韓秀麗

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥物安全評價中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046）

動物自發(fā)性背景病變與供應(yīng)商、遺傳和飲食以及飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。 將致病因素作用于動物，導(dǎo)致動物組織、器官或全身發(fā)生一定改變，出現(xiàn)某些類似人類發(fā)生疾病時表現(xiàn)的功能、代謝或形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的變化，被稱為誘發(fā)性病變。 飲食結(jié)構(gòu)和采食頻率會影響身體健康。 機體自身的代謝能力決定了發(fā)育所需的能量攝入是否符合或超過身體需求。 過去30 多年來，我國兒童肥胖發(fā)生率不斷攀升，究其原因與人們的飲食習(xí)慣有較大關(guān)系。 食物的攝入量和消耗量不均衡，是造成肥胖的主要原因。 不健康的飲食習(xí)慣會加重身體組織器官的負擔(dān)， 引起慢性疾病的發(fā)生。因此，在本試驗中筆者將高能量飲食作為主要影響因素，給予實驗動物自由采食生活中低齡兒童經(jīng)常攝入的高能量食物奶酪及蛋黃，觀察動物自發(fā)性疾病的發(fā)病情況及高能量食物對動物生長發(fā)育的影響，旨在為提高實驗動物質(zhì)量和進一步開展醫(yī)藥科學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠20 只，6～8 周齡，雌、雄各半。 購自北京斯貝福生物有限公司，許可證號為SCXK（京）2019—0010。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)。 將SD 大鼠隨機分為正常采食組和自由采食組，于普通環(huán)境中飼養(yǎng)3 個月。 正常采食組飼喂生長期鼠糧；自由采食組飼喂生長期鼠糧混合奶酪及蛋黃[采食標準為平均生長期鼠糧15 g/（只·d）混合15 g 高能量飲食（奶酪和蛋黃）]，自由飲水。

1.2.2 動物處理。 過夜禁食禁水10 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg 誘導(dǎo)麻醉，腹主動脈放血。 按試驗要求，分別摘取腎臟（膀胱）、肝臟、心血管、小腸、肺、氣管、胸腺、大腸、脾臟、胃和生殖器官（雌性：子宮、卵巢；雄性：睪丸、附睪、前列腺、精囊）、胰腺。 10%中性甲醛溶液固定。

1.2.3 病理檢查。 按照動物標本處理程序進行脫水、石蠟包埋、4.0 μm 切片、蘇木素-伊紅（HE）染色及中性樹膠封片。 光學(xué)顯微鏡下觀察病變。

1.2.4 儀器和試劑。Leica Auto Strainer XL 自動染色機、Leica EG 1150H 包埋機、Leica EG 1150C 制冷機、Leica RM 2235 全能型手動切片機、Leica ASP 200S 組織脫水機、DM 2000 熒光顯微鏡，均為徠卡生物系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；ZMN-6802 Water Bath-slide Drier，東莞市廈臺大電子設(shè)備廠公司產(chǎn)品；病理級顯微鏡載玻片；二甲苯，購自天津市富宇精細化有限公司；無水乙醇，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司； 中性樹膠， 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；0.01 mol/L PBS，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；石蠟，購自徠卡生物系統(tǒng)里士滿有限公司；蘇木色精，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2.5 病理診斷標準。 根據(jù)實驗動物組織病變半定量分析的非線性分級方案[1]見表1。

表1 用于實驗動物組織非腫瘤性病變半定量分析的非線性分級方案

2 結(jié)果與分析

2.1 正常采食組臟器病理變化鏡檢特點

正常采食組病變（n=10）情況如表2 所示。腎小管刷狀緣缺失、上皮細胞空泡變性、細胞腫脹、腎小管上皮細胞脫落極輕度（1/10），輕度（4/10）（圖2A）；肝細胞點狀壞死，小葉中心帶肝細胞缺失，炎細胞浸潤極輕度（1/10），輕度（1/10）；肝臟組織中可見微小肉芽腫極輕度（1/10），輕度（1/10）（圖2B）；心肌間質(zhì)少量炎細胞浸潤極輕度（1/10）（圖2C）；大腸黏膜下炎細胞浸潤極輕度（2/10），輕度（3/10），中度（1/10）（圖2D），黏膜下淋巴相關(guān)組織增生；小腸黏膜下淋巴相關(guān)組織增生極輕度（3/10），輕度（1/10） （圖2E）；支氣管及血管周圍炎細胞浸潤、膿腫；支氣管相關(guān)淋巴組織增生極輕度（8/10）（圖2F）；肺間質(zhì)充血，水腫極輕度（1/10），輕度（1/10）（圖2G）；胰腺無可記錄的變化（圖2H 和2I）。

圖2 正常采食組病變（HE 染色）

表2 SD 大鼠正常采食組病變發(fā)生例數(shù)（非線性分級方案，n=10）

2.2 自由采食組臟器病理變化鏡檢特點

自由采食組病變（n=10）情況如表3 所示。腎小管間質(zhì)炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹、變性脫落極輕度（3/10），輕度（3/10）（圖3A）；腎臟皮質(zhì)髓質(zhì)均可見蛋白管型輕度（2/10）（圖3B）； 肝細胞腫大極輕度（1/10）， 輕度（1/10）（圖3C）； 肝細胞變性極輕度（3/10），輕度（2/10）；心肌細胞片狀壞死，局部心肌纖維斷裂，伴有大量淋巴細胞浸潤，極輕度（1/10）（圖3D）；大腸黏膜下相關(guān)淋巴組織增生，黏膜變厚，正常黏膜結(jié)構(gòu)損失，黏膜細胞肥大增生極輕度（1/10），輕度（1/10），中度（1/10）（圖3E）；支氣管相關(guān)淋巴組織增生，肺泡腔可見大量泡沫細胞、膿腫極輕度（2/10），輕度（1/10）（圖3F），間質(zhì)性肺炎極輕度（1/10），輕度（2/10）（圖3G）；胰腺外分泌部萎縮，極輕度（1/10）；胰島炎細胞浸潤、纖維化，間質(zhì)單個核細胞浸潤，伴有極輕度損傷（1/10）（圖3H）；小腸黏膜下相關(guān)淋巴組織增生極輕度（1/10），輕度（1/10）（圖3I）。

圖3 自由采食組病變（HE 染色）

表3 SD 大鼠自由采食組病變發(fā)生例數(shù)（非線性分級方案，n=10）

3 討論

大鼠是嚙齒類動物，包括Wister、Sprague Dawley和Fischer 344 在內(nèi)的多個品系。 SD 大鼠個體差異小，數(shù)據(jù)比較準確，已經(jīng)在國際生物醫(yī)藥領(lǐng)域中得到廣泛認可，是藥物安全性評價和科研工作中經(jīng)常使用的動物[2]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，自由采食組和正常采食組中腎臟病變發(fā)生率最高，其次是肝臟和肺臟。 肝臟和肺臟的自發(fā)性疾病通常是炎癥，其特征為單核細胞浸潤；大腸和小腸病變發(fā)生率最高的是黏膜下淋巴組織增生；心肌病發(fā)生率均較低。

3.1 肝臟

正常采食組中，肝細胞點狀壞死（2/10），微小肉芽腫（2/10）；自由采食組中肝細胞腫大（2/10），肝細胞變性（5/10）。 自由采食組的病變數(shù)量及程度都高于正常采食組。 在本試驗中，自由采食組在剖檢及取材時發(fā)現(xiàn)肝臟體積偏大、顏色發(fā)黃、表面滑膩、邊緣鈍圓。 鏡檢時觀察到部分區(qū)域肝板結(jié)構(gòu)消失，肝細胞出現(xiàn)不同程度的肥大、腫大、變性和壞死等現(xiàn)象。 肥大的肝細胞通常呈小葉中心性分布，胞質(zhì)增多，對細胞核的大小幾乎沒有影響[3]。 試驗中觀察到的肝臟脂肪變性有2種情況，即大泡性脂肪病變和小泡性脂肪病變。 大泡性脂肪病變是常見病變，屬于不嚴重的病變，常與飼養(yǎng)條件和自身代謝機能相關(guān)。 小泡性脂肪病變被視為嚴重性病變， 肝細胞胞質(zhì)充滿大量的小脂質(zhì)空泡，常呈現(xiàn)泡沫狀外觀，胞核位于細胞中央。 肝細胞空泡化，出現(xiàn)小泡性肝細胞變性； 肝細胞肥大呈灰白色顆粒狀，肝細胞的核/胞漿比值較小，胞漿肉眼可見更明亮[4]。嚙齒類動物過度飼養(yǎng)是產(chǎn)生肝脂肪變性[5]的原因之一， 而肝細胞脂肪變性通常發(fā)生于肝內(nèi)脂肪≥5%肝臟重量時[6]。非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是指在并未飲酒的情況下出現(xiàn)肝細胞脂肪變性。 這也是很多發(fā)達國家/地區(qū)慢性肝病的常見病因， 被認為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，與肥胖、血脂異常和糖尿病等相關(guān)。 改變生活方式（如減重、增加體力活動和改變飲食）是緩解該類疾病的治療方案。

3.2 腎臟

在正常采食組中，腎小管上皮細胞腫脹、變性、脫落（5/10）；自由采食組中蛋白管型（2/10），腎小管上皮細胞腫脹、變性脫落（6/10）。 自由采食組在剖解及取材時可見腎臟體積與正常相比偏大，呈色黃。 鏡檢時觀察到部分腎小管擴大、上皮細胞空泡變性，皮質(zhì)、髓質(zhì)均可見蛋白管型。 腎小管擴張可能是由單個腎小管上皮細胞壞死或缺失引起。 腎小管上皮缺失時，相鄰的上皮細胞延伸填充缺損并覆蓋裸露的基底膜。 腎小管上皮空泡的形成很大程度上是一種可逆的退行性改變[3]?？张菪纬梢部赡苁菈乃狼暗囊环N早期表現(xiàn)，但常常伴隨特定類型的腎小管損傷，如液體蓄積[7]。正常腎臟含有適量的脂肪和類脂，不同種屬的動物含量各異。 在腎小球系膜中，脂質(zhì)還可以聚集成微小的空泡，從而產(chǎn)生“泡沫細胞”[8]。 透明管型HE 染色鏡下呈粉紅淺染，主要是腎小球通透性增加，血中蛋白漏出，腎小管重吸收障礙引起的。 各種類型的腎小球損傷及蛋白漏出均可以在腎小管內(nèi)形成管型。 一般來說，各種腎損傷的急性期或早期，管型不明顯，到慢性期管型明顯加重， 大鼠自發(fā)性慢性進行性腎?。╟hronic progressive nephropathy，CPN）與其他因素引起的腎小管管型有很大不同。 慢性進行性腎病引起的病變特征表現(xiàn)為基底膜增厚、 腎小管嗜堿性和腎小管擴張，蛋白管型、間質(zhì)纖維化等。 慢性進行性腎病是老齡大鼠發(fā)生的常見自發(fā)性疾病[9]，該病更多見于雄性大鼠，直接受高蛋白、高熱及高鹽飲食日糧影響。 這種飲食結(jié)構(gòu)會使更多的蛋白通過腎小球沉積在腎小管內(nèi)。

3.3 肺臟

在正常采食組中，肺間質(zhì)充血、水腫（2/10），支氣管旁血管周圍炎細胞浸潤、淋巴濾泡增生（8/10）；在自由采食組中，支氣管旁血管周圍炎細胞浸潤、淋巴相關(guān)組織增生（3/10），肺泡腔可見異物及大量泡沫細胞、并出現(xiàn)膿腫現(xiàn)象（3/10）。 在剖檢及取材時，肉眼可見肺部表面呈現(xiàn)多處片狀或點狀的灰白色和灰黃色斑塊。 鏡下可見支氣管相關(guān)淋巴組織增生、間質(zhì)充血水腫；肺泡內(nèi)可見大量的泡狀細胞。 這些細胞在肺泡內(nèi)一般分布在肺的邊緣。 當(dāng)肺組織發(fā)生纖維化時，會出現(xiàn)大量的細胞堆積，這些細胞可能是由于炎癥引起的[10]。 正常情況下肺泡壁有巨噬細胞的存在，通過吞噬吸入肺內(nèi)的異物或其他雜質(zhì)， 變成泡沫樣細胞，長期吞噬吸入會出現(xiàn)泡沫狀巨噬細胞蓄積的現(xiàn)象[11]。 肺泡巨噬細胞作為呼吸道的第一道防線，除了具有巨噬作用之外，更重要的是它利用其分泌的多種介質(zhì)參與到肺內(nèi)細胞間的相互作用和信息傳遞中，并對肺內(nèi)生理過程展開經(jīng)常性的細胞保護和細胞調(diào)節(jié)[12]。 巨噬細胞功能的變化可以反映肺部防御功能的改變，同時這也是細顆粒物與肺部疾病之間存在密切關(guān)系的可能原因之一[13]。圖3F 中出現(xiàn)的異物可導(dǎo)致由多核巨細胞和其他炎癥細胞組成的肉芽腫性反應(yīng)。 肺部出現(xiàn)病變大多與炎癥有關(guān)，比如肺炎、肺膿腫等癥狀，也與生存環(huán)境、外部感染、遺傳等原因有關(guān)。

3.4 心臟

在正常采食組中， 心肌間質(zhì)有少量炎細胞浸潤（1/10）；在自由采食組中，心肌細胞壞死（1/10）。 心肌細胞壞死通常是由冠狀動脈堵塞導(dǎo)致血流中斷，從而引發(fā)心肌組織細胞出現(xiàn)缺血、壞死等情況。 壞死伴隨著不同程度的炎癥。 炎癥程度取決于有害因子，也與感染或飲食失調(diào)有關(guān)。 自發(fā)性心肌病是一種常見的疾病，多見于雄性大鼠。 這種疾病的病因并不清楚，但其發(fā)病程度和發(fā)病時間與飲食、環(huán)境和應(yīng)激等因素有關(guān)[14]。自發(fā)性心肌病隨著年齡的增加而增加，更多出現(xiàn)于易患血管病變的高血壓大鼠[15]。由于該病變是進行性發(fā)展，所以早期病變中可見心肌纖維變性、壞死，并伴炎細胞浸潤。 一般3～4 個月齡可見其早期病變，24 月齡大鼠發(fā)病率接近100%[16]。 不良的生活環(huán)境以及不健康的生活習(xí)慣都會對心臟產(chǎn)生很大的影響。 高強度的噪聲及嚴重的環(huán)境污染是誘發(fā)各類型心臟病的常見因素。 改善生活環(huán)境和多運動是預(yù)防該類疾病的有效方式。

3.5 大腸和小腸

大腸和小腸的病變均為黏膜下相關(guān)淋巴組織增生。 正常采食組大腸黏膜下淋巴組織增生（6/10），小腸（4/10）；自由采食組黏膜下淋巴組織增生（3/10），小腸（2/10）。 大腸小腸剖檢及取材時可見組織表面有黃白色大小不一的明顯突起。 大腸黏膜含有隱窩，其基底部偶有分支。 表面上皮含有腸上皮細胞，而大部分隱窩被產(chǎn)生黏膜的杯狀細胞占據(jù)。 結(jié)腸黏膜含有黏膜皺襞，在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中有明顯體現(xiàn)[17]。 大腸和小腸黏膜細胞增生由各種不同因子的刺激引起[18]。 在本試驗中，大腸和小腸黏膜的組織學(xué)改變表現(xiàn)為黏膜腺體變深，杯狀細胞數(shù)目增多。 杯狀細胞增生是一種結(jié)腸和小腸都可以發(fā)生的自發(fā)性病變， 但是病因不明。 食物纖維與腸道菌群的互動也會影響腸道的發(fā)育[19]。 結(jié)腸黏膜發(fā)炎，一般并無明確的組織病理學(xué)特點。 在較早或病變較輕微時，腺體和表皮的黏膜仍然完好，但是有明顯的黏液缺失。 該病變的特點是杯狀細胞內(nèi)黏液減少，胞漿嗜堿度增加[20]。 炎癥現(xiàn)象通常出現(xiàn)在攝入了特別刺激的食物，或者是有細菌、病毒等微生物感染的時候，所以飲食習(xí)慣尤為重要。

3.6 胰腺

胰腺病變只出現(xiàn)在自由采食組中，表現(xiàn)為外分泌部萎縮（1/10），胰島炎細胞浸潤、纖維化（1/10）。 胰腺腺泡萎縮可見于幼齡和老齡大鼠。 該病變包括帶有殘存導(dǎo)管的腺泡萎縮、輕度炎癥反應(yīng)。 胰島中偶爾可見炎癥細胞，纖維化被認為是血細胞從血循環(huán)漏出到胰島內(nèi)導(dǎo)致的。 受影響的組織表現(xiàn)出腺泡數(shù)量減少，且由于腺泡細胞萎縮和失去分化，小管狀的結(jié)構(gòu)明顯增多。 大鼠自發(fā)性胰腺萎縮的原因尚不清楚。 胰腺外分泌部萎縮會引起慢性胰腺炎，病因與胰腺導(dǎo)管阻塞有關(guān)。 慢性胰腺炎早期病變的組織學(xué)特點是間質(zhì)單核細胞浸潤，伴有實質(zhì)不同程度的輕度損傷。 在晚期的病例中，腺泡組織逐漸消失。