馬瑛潔，王淑婷，周蘭蘭，牛蓉，孫志文

（1.河南宏信檢測(cè)技術(shù)有限公司農(nóng)產(chǎn)食品檢測(cè)中心，河南南陽 473000； 2.牧原食品股份有限公司品控部，河南南陽 473000； 3.北京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，北京 102629）

乙酰異戊酰泰樂菌素（泰萬菌素）屬于第3 代大環(huán)內(nèi)酯類動(dòng)物專用抗生素，是泰樂菌素經(jīng)化學(xué)改造而生成的一種衍生物[1]，在泰樂菌素的羥基位置乙?；?-羥基位置異戊酰基化而得， 由英國(guó)伊科動(dòng)物保健品有限公司開發(fā)，其藥效是紅霉素、泰樂菌素的5～10 倍，是替米考星、阿奇霉素的2～5 倍[2-5]。 目前制劑常使用的是酒石酸鹽。 泰萬菌素對(duì)比泰樂菌素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物而言，對(duì)豬痢疾、豬氣喘病、豬增生性腸炎和雞支原體感染等疾病具有很好的防治效果[6-9]。 泰萬菌素也具有高效、低毒、低殘留、與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不存在交叉耐藥現(xiàn)象及對(duì)畜禽支原體病有治療作用等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)良的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和飼料添加劑[10-14]。

由于目前抗生素在養(yǎng)殖企業(yè)常存在超劑量使用、不該用時(shí)亂用或者無規(guī)律服用抗生素等抗生素濫用現(xiàn)象， 導(dǎo)致抗生素耐藥性以及環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，致使人們?cè)絹碓街匾暱股氐氖褂脝栴}[15-16]。2019年7 月，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194 號(hào)公告要求飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。該公告自2020 年7月1 日起開始執(zhí)行[17-19]。政府加強(qiáng)對(duì)飼料加藥的管控，減抗、禁抗已是大勢(shì)所趨。 這就需要我們盡快建立飼料中的抗生素質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為企業(yè)、政府的管控提供檢測(cè)方法。

目前， 泰萬菌素制劑產(chǎn)品在 《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017 年版中使用的檢測(cè)方法是抗生素微生物鑒定法，但該方法存在前處理復(fù)雜、靈敏度低、準(zhǔn)確度低及檢測(cè)種類受限等缺點(diǎn)，且飼料中泰萬菌素的檢測(cè)方法仍是空白[20-21]。 本文研究了用高效液相色譜法測(cè)定飼料中泰萬菌素含量的方法，參考獸藥典中對(duì)泰萬菌素組分的檢查方法，以泰萬菌素組分A 外標(biāo)法定量。 該方法重復(fù)性好，靈敏度高，檢測(cè)速度快，可以為飼料中泰萬菌素含量的檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購置批號(hào)，K0692108，含量80.0%，CAS 號(hào)：63409-12-1，分子式：C53H87NO19）；甲醇、乙腈（美國(guó)天地有限公司；4 L）；醋酸銨（分析純；國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)技術(shù)有限公司）；醋酸（色譜純；國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)技術(shù)有限公司）；C18 色譜柱（安捷倫）；試驗(yàn)用水為超純水；0.22 μm 微孔濾膜：通用型。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器（Alliance E2695-2489）， 美國(guó)Waters 公司； 電子天平（MS105DU），Mettler-Toledo；離心機(jī)（DD5000），四川蜀科儀器有限公司；多管混勻儀（MVM-200），南京祥中生物科技有限公司；超聲波清洗器（UC-4480），深圳市朗杰超聲電器有限公司。

1.3 泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）

取泰萬菌素對(duì)照品適量（相當(dāng)于泰萬菌素10 mg）于10 mL 容量瓶中，精密測(cè)定。 用乙腈溶解并稀釋成濃度為1 000 μg/mL 的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。 置于-20 ℃冰箱中避光保存，有效期為12 個(gè)月。

1.4 泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 μg/mL）

精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用70%甲醇水稀釋并定容，混勻。置于4 ℃冰箱中避光保存，有效期為3 個(gè)月。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確移取適量泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)中間液， 用0.15 mol/L醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）稀釋定容，配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液， 濃度為1、5、10、20、50 及100 μg/mL，上機(jī)前過濾，待測(cè)。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 樣品制備。 取無藥物添加的豬用配合飼料樣品500 g 左右， 粉碎至可通過1 mm 孔徑篩后， 充分混勻，存儲(chǔ)于廣口瓶?jī)?nèi)密封備用。

1.6.2 樣品提取。 稱取試樣約5 g（精確至0.01 g）于50 mL 容量瓶?jī)?nèi)中， 加0.15 mol/L 醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）20 mL，多管混勻儀2 500 r/min混合1 min，超聲提取15 min，4 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后作為試樣溶液，供上機(jī)使用。

1.6.3 色譜條件。色譜柱：250 mm×4.6 mm，5-Micron，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。流速：1.2 mL/min。 檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相：0.15 mol/L。醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取溶劑選擇。 泰萬菌素分子式是C53H87H9·x（C4H6O6），分子量1 192.343 7，易溶于甲醇，可溶于水、丙酮或氯仿，微溶于乙酸乙酯和乙醚，幾乎不溶于乙烷。2017 版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)泰萬菌素相關(guān)制劑檢查組分時(shí)選擇的稀釋溶液是流動(dòng)相0.15 M 醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）。本研究選取超純水、70%甲醇、 醋酸銨-醋酸-乙腈溶液3 種提取液，取空白飼料樣品5 g，加標(biāo)至100 mg/kg，分別加入以上3 種不同提取液20 mL，振蕩混勻1 min，超聲提取20 min，4 000 r/min 離心5 min，每種提取液重復(fù)試驗(yàn)3 次， 取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后上機(jī)。 結(jié)果顯示，當(dāng)提取液為0.15 M 醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）時(shí)，平均回收率最高，為112.9%（表1），最終選取醋酸銨-醋酸-乙腈溶液為提取溶液。

表1 不同提取溶劑對(duì)泰萬菌素提取率的影響

2.1.2 樣品提取方式、提取時(shí)間選擇。 使用同一份制備好的樣品，稱取5 g，分別使用振蕩提取法和超聲提取法2 種提取方式，每種提取方式提取時(shí)間分別為5、10、20 及30 min，4 000 r/min 離心5 min， 每種提取液重復(fù)試驗(yàn)3 次，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后上機(jī)。 結(jié)果顯示，振蕩和超聲2 種方式對(duì)泰萬菌素的提取無明顯影響，當(dāng)提取時(shí)間超過10 min 后，回收率有所下降（表2）。為保證提取效果，本文選擇提取方式為超聲提取，提取時(shí)間為10 min。

表2 提取方式、提取時(shí)間對(duì)泰萬菌素提取率的影響

2.1.3 提取溫度、提取次數(shù)選擇。 本方法考查了不同提取溫度（25、40 及60 ℃），使用醋酸銨-醋酸-乙腈溶液為提取液，加入20 mL 提取1 次、每次加入10 mL提取2 次、每次分別加入7、7 和6 mL 提取3 次，確定提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響，每組重復(fù)3 次。 結(jié)果顯示，提取溫度為25 ℃、提取1 次，即可達(dá)到提取效果（表3）。 隨著提取溫度的升高，回收率逐漸降低，且回收率不會(huì)隨著提取次數(shù)的增加而升高。 綜合提取效率和時(shí)間成本，最終選擇提取溫度為25 ℃，提取次數(shù)為1 次（20 mL）。

表3 提取溫度、提取次數(shù)對(duì)泰萬菌素提取率的影響

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 柱溫及流速的選擇。 本方法考查了不同柱溫（25、35 和45 ℃），不同流速（1.0、1.2 和2.0 mL/min）對(duì)泰萬菌素的分離情況、保留時(shí)間和峰型的影響。 結(jié)果顯示，柱溫升高泰萬菌素保留時(shí)間逐漸縮短，但無明顯變化；流速增大時(shí)泰萬菌素峰形逐漸變窄，但同時(shí)儀器系統(tǒng)壓力逐漸增高，綜合考慮最終選擇色譜柱柱溫為25 ℃、流速為1.2 mL/min，在該條件下泰萬菌素的保留時(shí)間為10.9 min（圖1）。

圖1 泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（280 nm）

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。2017 年版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中泰萬菌素檢測(cè)波長(zhǎng)是280 nm， 為驗(yàn)證該波長(zhǎng)是否為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，本研究配制了100 μg/mL 泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試其在260～300 nm 的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)泰萬菌素在280 nm 處響應(yīng)最大（圖2），因此確定280 nm 為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μg/mL 在不同波長(zhǎng)下的響應(yīng)值

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 方法的線性范圍。 配制的1、5、10、20、50 和100 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下，從低濃度到高濃度分別進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣2 針，按其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 結(jié)果表明，泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1～100 μg/mL 時(shí)呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為y=7 917.8x-478.68，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9（圖3）。

圖3 泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.2 方法的穩(wěn)定性。 將同一飼料樣品提取液混合均勻后分成兩份分別于室溫和4 ℃密閉冷藏放置24、48 和72 h，每種方案做3 個(gè)平行，取以上時(shí)間點(diǎn)的提取液，試驗(yàn)泰萬菌素色譜峰面積及RSD 均沒有明顯變化（表4），說明該方法的穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.3.3 方法的檢出限和定量限。 根據(jù)2017 年版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的允許用量折算泰萬菌素制劑在飼料匯總的最低允許用量，其中酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑最低允許用量為50 mg/kg。選擇無藥物添加的豬混合飼料為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)范圍為0.05～50 mg/kg，在上述色譜條件下每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2 次，按3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果顯示，泰萬菌素檢出限為2 mg/kg，定量限為4 mg/kg。

2.3.4 方法的精密度及回收率。 利用本研究建立的方法，對(duì)空白飼料進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，5 g 空白飼料中分別添加不同濃度的泰萬菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)水平為4、10、20、50 和100 mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平做6 個(gè)平行樣品，進(jìn)行回收率測(cè)定試驗(yàn)。 結(jié)果顯示，平均回收率為94.6%～101.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.3%～6.0%（表5）。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確性和精密度均較為理想，滿足飼料中泰萬菌素定量分析要求。

表5 泰萬菌素的平均回收率（n=6）

2.4 實(shí)際應(yīng)用

本研究從市場(chǎng)上購買了5 種共20 批次飼料，其中豬用配合飼料2 種、禽用配合飼料3 種，不同種類飼料各4 批，使用上述方法進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果顯示，僅有1 批次禽用配合飼料中檢出泰萬菌素。 含量為2.318 mg/kg，低于本方法定量限，剩余樣品均無檢出。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究建立了用高效液相色譜法測(cè)定飼料中泰萬菌素含量的方法， 該方法線性范圍廣、前處理簡(jiǎn)單且檢測(cè)速度快，適用于測(cè)定飼料中泰萬菌素的含量，同時(shí)為飼料中泰萬菌素檢測(cè)提供了方法參考和借鑒。