杜 玥,李 莎,梅齊建,肖 鳴

心肌缺血/再灌注(myocardial ischemic/reperfusion,MI/R)損傷的誘因主要是心肌梗死、心肌缺血等,其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,是臨床治療的難題[1]。細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是MI/R損傷的重要原因。研究表明,高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)/Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)/核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信號(hào)通路與MI/R損傷的發(fā)生聯(lián)系密切[2]。HMGB1在幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型中都有表達(dá),抑制HMGB1表達(dá)可使其受體TLR4表達(dá)下降,導(dǎo)致下游NF-κB轉(zhuǎn)錄活性降低,從而起到減輕細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的效果[3]。藍(lán)萼甲素(glaucocalyxin A,GLA)提取自藍(lán)萼香茶菜,是一種具有廣泛生物活性的二萜類(lèi)化合物。GLA已被證實(shí)在氧化應(yīng)激、免疫、抗炎等方面起作用[4]。同時(shí),在乳腺癌中,GLA不僅能通過(guò)激活p53蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程[5],還能通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6];另外,GLA可通過(guò)下調(diào)糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)從而明顯抑制肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[7]。研究發(fā)現(xiàn),GLA通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路不僅能減輕卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠呼吸道炎癥[8],也能調(diào)節(jié)人滋養(yǎng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[9],還能減輕肥大細(xì)胞脫顆粒導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)[10]。然而,GLA是否通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路影響心肌細(xì)胞損傷還未可知。因此,本研究將通過(guò)構(gòu)建H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型,觀察GLA對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的影響,并探討GLA是否通過(guò)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路干預(yù)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑、儀器

H9c2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);GLA購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制劑甘草酸(glycyrrhizin)購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;兔抗HMGB1、TLR4、NF-κB p65抗體(anti-HMGB1、anti-TLR4、anti-NF-κB p65、anti-p-NF-κB p65)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;三氣培養(yǎng)箱、恒溫CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;倒置熒光顯微鏡購(gòu)自基恩士(中國(guó))有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與模型構(gòu)建

對(duì)冷凍保存的H9c2細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇,將其置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,在恒溫(37 ℃)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞先在三氣培養(yǎng)箱缺氧環(huán)境中(1%O2、94%N2、5%CO2)培養(yǎng)24 h,然后移至恒溫CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)復(fù)氧2 h,模型構(gòu)建完成。

1.3 細(xì)胞分組

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞分成對(duì)照組(正常培養(yǎng))、模型組(構(gòu)建H/R細(xì)胞模型)、GLA-L組(細(xì)胞中加入5 μmol/L的GLA后構(gòu)建H/R細(xì)胞模型)、GLA-M組(細(xì)胞中加入10 μmol/L的GLA后構(gòu)建H/R細(xì)胞模型)、GLA-H組(細(xì)胞中加入20 μmol/L的GLA構(gòu)建H/R細(xì)胞模型)、GLA-H+甘草素組(細(xì)胞中加入20 μmol/L的GLA和100 μg/mL的甘草素[11]后構(gòu)建H/R細(xì)胞模型)。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率

將各組H9c2細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞板上,分別滴入10 μL的CCK-8溶液,2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在450 nm處的光密度值,評(píng)估細(xì)胞的存活率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

分別在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組H9c2細(xì)胞中依次加入10 μL的V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide,PI),避光反應(yīng)30 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞中ROS、LDH、抗氧化酶及炎性因子水平測(cè)定

收集經(jīng)過(guò)處理的各組H9c2細(xì)胞,使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗,然后在37 ℃下,使用10 μmol/L的2′-7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)避光處理30 min。接著,使用流式細(xì)胞儀分析各組H9c2細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度,反映ROS水平。按照LDH、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒的方法對(duì)各組細(xì)胞上清液進(jìn)行LDH活性及SOD、MDA含量測(cè)定。利用ELISA方法檢測(cè)炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)

利用TRIzol試劑提取各組H9c2細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照qRT-PCR儀器的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行程序設(shè)定和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。HMGB1、TLR4、NF-κB p65引物序列見(jiàn)表1。

表1 HMGB1、TLR4、NF-κB p65、GAPDH引物序列

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)HMGB1、TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)

提取各組H2c9細(xì)胞總蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,然后進(jìn)行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉處理后,加入anti-HMGB1、anti-TLR4、anti-NF-κB p65和anti-p-NF-κB p65一抗,次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,繼續(xù)孵育1 h,使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)試劑進(jìn)行顯影,并分析其蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組H9c2細(xì)胞存活率比較

與對(duì)照組比較,模型組H9c2細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05);GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細(xì)胞存活率均明顯高于模型組,呈劑量依賴性(P<0.05);而與GLA-H組比較,GLA-H+甘草素組H9c2細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組H9c2細(xì)胞存活率比較 單位:%

2.2 各組H9c2細(xì)胞凋亡率比較

模型組H9c2細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05);與模型組相比,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細(xì)胞凋亡率依次降低(P<0.05);而與GLA-H組比較,GLA-H+甘草素組H9c2細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表3。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡情況

表3 各組H9c2細(xì)胞凋亡率比較 單位:%

2.3 各組H9c2細(xì)胞毒性和抗氧化酶比較

與對(duì)照組相比,模型組H9c2細(xì)胞中LDH活性和MDA含量明顯上升,ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),SOD含量明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細(xì)胞中LDH活性和MDA含量明顯下降,ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯減弱,SOD含量明顯升高,均呈現(xiàn)劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而與GLA-H組比較,GLA-H+甘草素組H9c2細(xì)胞中LDH活性和MDA含量明顯降低,ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯減弱,SOD含量明顯上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組H9c2細(xì)胞毒性和抗氧化酶比較

2.4 各組H9c2細(xì)胞炎性因子表達(dá)比較

與對(duì)照組比較,模型組H9c2細(xì)胞中TNF-α、IL-6含量明顯增加(P<0.05);與模型組比較,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細(xì)胞中TNF-α、IL-6含量明顯降低,且均表現(xiàn)為GLA-L組>GLA-M組>GLA-H組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而GLA-H+甘草素組H9c2細(xì)胞中TNF-α、IL-6含量明顯低于GLA-H組(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 各組H9c2細(xì)胞炎性因子表達(dá)比較 單位:ng/L

2.5 各組H9c2細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平比較

模型組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05);與模型組相比,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平依次降低(P<0.05);而GLA-H+甘草素組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平明顯低于GLA-H組(P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 各組H9c2細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平比較

2.6 各組H9c2細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較,模型組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平與磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)/NF-κB p65值明顯升高(P<0.05);與模型組相比,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65值呈劑量依賴性降低(P<0.05);而GLA-H+甘草素組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65值明顯低于GLA-H組(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表7。

圖2 各組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)條帶圖

表7 各組H9c2細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

3 討 論

MI/R損傷是伴隨心臟疾病介入治療、搭橋手術(shù)出現(xiàn)的一種機(jī)體損傷[12]。研究發(fā)現(xiàn),從傳統(tǒng)中藥里提取的活性物質(zhì)可對(duì)MI/R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用,如黃芪甲苷[13]、原花青素[14]、黃連素[15]等均可抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷。GLA是藍(lán)萼香菜的主要活性成分,其已被證實(shí)能夠激活A(yù)KT/Nrf2/血紅素加氧酶-1 (HO-1)通路抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞活力,從而使H9c2細(xì)胞免受H/R誘導(dǎo)的損傷[16]。本研究通過(guò)H9c2細(xì)胞H/R損傷模型構(gòu)建研究GLA對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的作用。LDH、MDA、ROS和SOD是檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物。細(xì)胞在受外界刺激發(fā)生損傷時(shí),炎性因子(TNF-α、IL-6)水平會(huì)明顯增加。本研究結(jié)果顯示,模型組H9c2細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞凋亡率升高,抗氧化酶MDA和ROS水平上升,SOD含量降低,炎性因子TNF-α、IL-6含量增加,揭示H/R誘導(dǎo)可使H9c2細(xì)胞活性和氧化應(yīng)激能力降低,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。而模型組H9c2細(xì)胞中LDH活性明顯提高,說(shuō)明H9c2細(xì)胞H/R損傷模型構(gòu)建成功。在H9c2細(xì)胞H/R損傷模型細(xì)胞中分別加入低、中、高劑量的GLA后,細(xì)胞存活率明顯升高,凋亡率明顯降低,LDH活性、ROS水平和MDA含量明顯下降,SOD含量明顯升高,TNF-α、IL-6含量明顯下降,均呈劑量依賴性。表明GLA能修復(fù)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷,增強(qiáng)細(xì)胞活性并抑制凋亡。

研究顯示,H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷與HMGB1/TLR4/NF-κB通路關(guān)系密切[17]。在MI/R等細(xì)胞損傷情況下,產(chǎn)生炎癥的重要介質(zhì)是HMGB1。而HMGB1可與多種受體結(jié)合進(jìn)而參與心肌細(xì)胞的增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)過(guò)程[18]。TLR4是HMGB1的關(guān)鍵受體之一,兩者相互作用能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí),激活TLR4后,下游NF-κB轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá),促使細(xì)胞中產(chǎn)生更多的炎性因子,進(jìn)而加重細(xì)胞損傷程度[19]。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR-708可靶向下調(diào)HMGB1的表達(dá)抑制TLR4/NF-κB通路的激活,進(jìn)而降低凋亡和炎癥反應(yīng)并保護(hù)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。然而,在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷中,GLA與HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系及其作用機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示,模型組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4表達(dá)與NF-κB p65磷酸化水平均明顯升高;GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細(xì)胞中HMGB1、TLR4表達(dá)與NF-κB p65磷酸化水平依次降低,揭示GLA能逆轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞H/R損傷模型中HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65的高表達(dá)。此外,甘草素是HMGB1的抑制劑,能夠通過(guò)抑制HMGB、TLR4、NF-κB表達(dá)從而減輕放射性肺損傷。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),抑制HMGB1表達(dá)后,GLA-H+甘草素組H9c2細(xì)胞HMGB1、TLR4表達(dá)與p-NF-κB p65水平降低;同時(shí),細(xì)胞存活率升高、凋亡率降低,LDH活性、ROS水平和MDA含量明顯下降,SOD含量明顯升高,TNF-α、IL-6含量明顯減少,提示GLA和HMGB1/TLR4/NF-κB通路抑制劑甘草素可能存在協(xié)同作用,對(duì)保護(hù)H9c2細(xì)胞的作用更佳。說(shuō)明GLA可能通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路增加細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞凋亡,對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述,GLA可能通過(guò)阻滯HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路,降低細(xì)胞凋亡率,減少炎性因子表達(dá),進(jìn)而保護(hù)H9c2細(xì)胞免受H/R誘導(dǎo)的損傷。