武報佳,邢慧敏,郭 華,趙 睿,孫 波,李 燕

急性心肌梗死(AMI)是心血管系統(tǒng)常見疾病,多指冠狀動脈損傷導(dǎo)致血流減少或中斷,心肌組織長時間缺血導(dǎo)致,是一種急性冠脈綜合征[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,AMI病人發(fā)病主要集中在歐美國家,美國發(fā)病率為508/10萬且逐年升高,我國AMI發(fā)病率為45/10萬～55/10萬,臨床表現(xiàn)為心前區(qū)疼痛或出現(xiàn)憋悶,發(fā)病人群存在年輕化趨勢,45歲以下為高發(fā)人群[2]。以往研究表明,成熟的心肌細(xì)胞不會發(fā)生凋亡,缺血缺氧是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的主要原因[3]。近些年相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí),AMI疾病出現(xiàn)再灌注損傷時會導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,其產(chǎn)生機(jī)制是由多種信號通路共同參與導(dǎo)致。Toll樣受體(TLRs)是一種重要模式識別受體家族,TLR4是其家族成員之一,在心肌細(xì)胞中表達(dá)[4]。髓樣分化因子(MyD88)聯(lián)合TLR4后能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)而發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),心肌缺血再灌注大鼠NF-κB能夠激活JNK1/2導(dǎo)致NF-κBp65核轉(zhuǎn)位而加快心肌細(xì)胞凋亡[5-6]。葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)是一種天然植物多酚,其活性成分包含酚酸類物質(zhì)茶兒素及黃烷醇類。GSP在食品和保健品的研究較廣泛,已經(jīng)證實(shí)GSP在心血管疾病中具有保護(hù)作用[7]。本研究觀察GSP對心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡及TLR4/NF-κB蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體(SPF)級SD雌性大鼠,鼠齡6周,共60只,均購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,體質(zhì)量200～300 g,動物許可證號:SCXK(浙)2019-000l。飼養(yǎng)在濕度55%、溫度25 ℃的環(huán)境下,模擬黑白交替無菌飲食2周,定時清洗、消毒鼠籠,實(shí)驗(yàn)要求符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》管理規(guī)定。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

GSP購自中國西安雙德生物;阿托伐他汀購自中國北京嘉林藥業(yè);戊巴比妥鈉、阿托品、氯胺酮、地西泮(安定)及注射用青霉素鈉均購自中國廣州粵豐公司;TLR4、NF-κB抗體均購自Abcam;封閉用正常山羊血清購自中國北京百奧萊公司;蘇木精-伊紅(HE)試劑盒購自西安永屹生物技術(shù);FlexiWash全自動蛋白質(zhì)免疫印跡系統(tǒng)購自環(huán)亞生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AMI建模方法

測量60只大鼠體質(zhì)量,清除氣管分泌物,腹腔注射60 mg/kg的阿托品、5 mg/kg的地西泮及30 mg/kg的氯胺酮麻醉,將大鼠仰臥位后固定于操作臺上,暴露胸部連接小動物呼吸機(jī),剔除左側(cè)胸腔毛發(fā)消毒后,在第4肋、第5肋間切開皮膚,置入開胸器暴露心臟,剪開心包,于肺動脈及左側(cè)心耳距離主動脈根部0.2 cm分別用4號線及8號手術(shù)針結(jié)扎左冠狀動脈前降支,建立心肌梗死模型,撤離開胸器,青霉素沖洗胸腔后用2號線縫合皮膚,大鼠清醒后拔出呼吸機(jī)。假手術(shù)大鼠除不結(jié)扎左冠狀動脈前降支外其余同上。

1.3.2 分組及干預(yù)方法

將60只大鼠分為假手術(shù)組、AMI組、低GSP組、中GSP組、高GSP組及藥物對照組,每組10只,低GSP組、中GSP組、高GSP組分別采用100、200、300 mg/kg的GSP溶液灌胃,藥物對照組采用20 mg/kg的阿托伐他汀灌胃,假手術(shù)組大鼠灌胃同體積的生理鹽水。每日1次,連續(xù)灌胃1周。

1.3.3 心肌梗死體積和含水量檢測

末次灌胃后,各組隨機(jī)選取3只大鼠頸部脫臼處死大鼠,提取心臟的心肌組織,低溫保存。30 min后沿著房室溝方向平行切片,放入2%的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液后避光孵育30 min,6 min反轉(zhuǎn)1次,采用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算心肌梗死體積(白色為梗死區(qū))。另每組隨機(jī)選取3只大鼠脫臼處死后,提取左側(cè)心臟組織,生理鹽水沖洗后拭干水分,采用電子天平稱量濕度,95 ℃烘干后稱量干度,含水量(%)=(濕度-干度)/濕度。

1.3.4 心肌組織HE染色

剩余各組大鼠脫臼處死,提取心臟,石蠟包埋心肌組織,5 μm切片,脫蠟10 min后利用95%乙醇水化,采用堿性蘇木精染色15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次,蒸餾水清洗,再利用0.5伊紅染色3 min,PBS透明,在200倍的顯微鏡觀察心肌組織病理改變。

1.3.5 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡

石蠟切片進(jìn)行TUNEL染色,檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況,方法步驟按TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行。每張切片隨機(jī)選取不交叉重復(fù)的5個視野在光學(xué)高倍顯微鏡下進(jìn)行觀察,出現(xiàn)棕黃色顆粒狀為細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測心肌組織TLR4/NF-κB蛋白表達(dá)

心肌組織加入0.125%胰蛋白裂解液,4 000 r/min離心后,在血清樣品中加入樣孔。進(jìn)行電泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)浸泡10 min,反復(fù)PBS沖洗,每次5 min,分別加入TLR4/NF-κB及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶500)、過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000),雜交處理4 h后,沖洗,將膜浸入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)工作液,檢測獲取圖像。

1.3.7 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測心肌組織TLR4/NF-κB mRNA表達(dá)

心肌組織經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化,沖洗后放于無菌試管管中,提取其RNA,75%乙醇離心,-80 ℃保存。將RNA轉(zhuǎn)化DNA,加入TLR4及NF-κB抗體,內(nèi)參采用GAPDH,60 ℃預(yù)變性,10 min,95 ℃變性,72 ℃退火,各30 s,95 ℃延伸,5 min,循環(huán)次數(shù)以40次為準(zhǔn),用2-ΔΔCt的方法計(jì)算相對表達(dá)水平,引物序列見表1。

表1 基因名稱及引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死體積及心肌組織含水量比較

與假手術(shù)組比較,AMI組心肌梗死體積增大(P<0.05);與AMI組比較,低GSP組、中GSP組、高GSP組和藥物對照組心肌梗死體積減小(P<0.05);與假手術(shù)組比較,AMI組心肌組織含水量升高(P<0.05),與AMI組比較,高GSP組和藥物對照組心肌組織含水量降低(P<0.05)。詳見表2、圖1。

圖1 各組大鼠心肌梗死體積比較

表2 各組大鼠心肌梗死體積及心肌組織含水量比較 單位:%

2.2 HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,無炎癥浸潤;AMI組大鼠心肌細(xì)胞紊亂及數(shù)目減少,排列紊亂出現(xiàn)大量肌肉絲溶解及炎癥浸潤,與AMI組比較,低GSP組、中GSP組、高GSP組和藥物對照組心肌細(xì)胞紊亂有效改善,炎癥浸潤逐漸降低。詳見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理形態(tài)(×200)

2.3 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

AMI組心肌細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組(P<0.05),與AMI組比較,低GSP組、中GSP組、高GSP組和藥物對照組心肌細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05),且高GSP組和藥物對照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率低于低GSP組、中GSP組(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組大鼠心肌組織中TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)比較

AMI組TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05),與AMI組比較,低GSP組、中GSP組、高GSP組和藥物對照組TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),且與低GSP組、中GSP組比較,高GSP組和藥物對照組大鼠心肌組織中TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見表3、圖5、圖6。

圖5 各組大鼠心肌組織中TLR4蛋白表達(dá)條帶圖

圖6 各組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)條帶圖

表3 各組大鼠心肌組織中TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)比較

2.5 qRT-PCR檢測各組心肌組織TLR4及NF-κB mRNA相對表達(dá)

AMI組TLR4及NF-κB mRNA高于假手術(shù)組(P<0.05),與AMI組比較,低GSP組、中GSP組、高GSP組和藥物對照組TLR4及NF-κB mRNA相對表達(dá)均降低(P<0.05),且與低GSP組、中GSP組比較,高GSP組和藥物對照組大鼠心肌組織中TLR4及NF-κB mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組心肌組織TLR4及NF-κB mRNA表達(dá)比較

3 討 論

AMI發(fā)病急驟,發(fā)病機(jī)制為冠狀動脈阻塞導(dǎo)致血流阻斷,引起心肌組織供血氧不足,加快心肌細(xì)胞凋亡。心肌梗死病人臨床治療多采用藥物干預(yù)為主,他汀類藥物具有抑制心肌梗死后心室重構(gòu)、保護(hù)心室功能的作用。阿托伐他汀能夠通過抑制甲氰戊酸通路活化降低對小分子G蛋白異戊二烯化修飾,有利于減少心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌組織纖維化[8]。但是心肌梗死病人多數(shù)存在免疫功能低下,長時間服用他汀類藥物會加大機(jī)體毒性作用。

TTC染色是檢測心肌梗死大鼠梗死體積的主要方法,心肌梗死大鼠心肌組織會出現(xiàn)磚紅色危險梗死區(qū)域及灰白色梗死區(qū)域,隨著心肌梗死疾病加重而白色梗死區(qū)域增大[9]。心肌梗死缺血再灌注后中性粒細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增加后會釋放大量的氧自由基等細(xì)胞毒性因子,細(xì)胞毒性因子可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞及抑制血管擴(kuò)張,加快細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損傷增加血管通透性而增加心肌組織水腫[10]。本研究結(jié)果表明,不同濃度的GSP均能夠縮小心肌梗死體積,降低心肌組織含水量。GSP是在葡萄籽中提取的天然多酚類化合物,能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)、氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。在以往實(shí)驗(yàn)研究中GSP常被作為抗氧化劑,能夠減少心肌缺血再灌注家兔氧化應(yīng)激從而減輕心肌損傷[11]。GSP抗心肌梗死大鼠梗死免疫主要是通過抑制心肌損傷的心肌酶表達(dá)而減輕心肌組織損傷,縮小梗死體積,恢復(fù)血管通透性而減少細(xì)胞水腫。武報佳[12]研究證實(shí),葡萄籽原花青素(GSPE)能夠通過抑制多聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(PRAP-1)表達(dá)而縮小心肌梗死體積。

心肌梗死大鼠HE染色發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)紊亂,TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生與鈣離子及線粒體發(fā)生異常相關(guān)。研究證實(shí),心肌梗死大鼠心肌組織存在氧化損傷,產(chǎn)生大量超氧負(fù)離子而增加細(xì)胞色素合成及釋放,能夠激活Caspase等信號通路而增加p53過表達(dá)啟動細(xì)胞凋亡程序[13-14]。GSP主要活性成分之一兒茶素能夠清除自由基,提高心肌細(xì)胞抗氧化能力,從而減少心肌細(xì)胞凋亡。戴順妮等[15]研究證實(shí)GSP活性物質(zhì)兒茶酸能夠通過增加DNA修復(fù)酶表達(dá)而減少體外實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí),GSP對心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用并呈現(xiàn)濃度依賴性,作用機(jī)制與抑制TLR4及NF-κB表達(dá)相關(guān)。

TLR4是一類天然免疫受體,是人類首個發(fā)現(xiàn)的TLR相關(guān)蛋白,當(dāng)發(fā)生內(nèi)源性損傷時可被特異性激活。體外實(shí)驗(yàn)表明,在心肌細(xì)胞中采用TLR4激動劑能夠增加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)活性,加快心肌細(xì)胞凋亡[16-17]。TLR4信號能夠通過兩種不同途徑加快心肌細(xì)胞凋亡,能夠激活髓樣分化因子88(MyD88)信號及非MyD88通路表達(dá),配體與TLR4形成復(fù)合物后增加MyD88活性而介導(dǎo)TNF-α相關(guān)因子激活NF-κB增加心肌細(xì)胞凋亡[18-19]。以往研究表明,葡萄籽原花青素能夠通過抑制PRAP-1活性而阻遏線粒體相關(guān)通路Caspase-3及Bax蛋白水平,進(jìn)一步減少心肌損傷,抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)心臟作用[20]。本研究證實(shí),GSP能夠通過抑制TLR4及NF-κB表達(dá)而減少心肌損傷,作用機(jī)制在于GSP活性成分兒茶酸能夠通過減少NF-κB表達(dá)而抑制其活性,降低p53的磷酸化而改善細(xì)胞存活周期,促進(jìn)心肌細(xì)胞存活。

綜上所述,GSP能夠顯著縮小心肌梗死大鼠梗死體積,降低心肌組織含水量,抑制心肌細(xì)胞凋亡,呈現(xiàn)濃度依賴性,研究機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB表達(dá)相關(guān)。