朱高倩，王麗，殷子喻，符德歡*

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；

2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111

燈盞細辛（燈盞花）為菊科植物短葶飛蓬Erigeron brevicapus（Vant.）Hand.-Mazz.的干燥全草，是燈盞生脈膠囊等成藥制劑的重要原料[1]。但是由于燈盞花資源的大量利用，其藥材時有混淆物種[2]。這些物種在性味歸經(jīng)、功能主治、化學(xué)成分、藥理活性上有很大的區(qū)別[1,3-4]，從而可能影響中成藥的質(zhì)量控制。目前，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部）記載的含燈盞花中成藥鑒別很難從中成藥追溯到入藥的基原物種[1]。雖然很多植物科屬都已獲得相對穩(wěn)定的DNA條形碼序列[5]，但由于從藥用植物到藥材再到中成藥經(jīng)歷了重重工藝[6]，使DNA 條形碼技術(shù)應(yīng)用受限。目前，中成藥含某一藥味[7-8]或多個藥味[9-11]的分子鑒定技術(shù)逐漸有了新突破。燈盞花植物雖已進行了內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）、matK位點序列分析研究[5,12]，但要將DNA 條形碼綜合應(yīng)用到中成藥的原料物種溯源鑒別尚面臨著如何有效地提取出含燈盞花中成藥DNA 及選擇合適的聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增標記等關(guān)鍵問題。鑒于不同物種組配的中成藥DNA 提取方法及獲取相應(yīng)的DNA 條形碼的序列存在不同程度的差異，本研究基于中藥材DNA提取及PCR擴增的前期文獻報道[7-8]，以燈盞花對照藥材作為對照，對市場上常見含燈盞花的固體劑型（片、分散片、膠囊）中成藥進行不同DNA 提取方法的比較，并采用DNA 條形碼技術(shù)常用ITS、psbA-trnH、matK、rbcL4 個位點通用引物對提取的DNA 進行PCR 擴增，以探索出一套適用于含燈盞花固體劑型中成藥DNA 條形碼技術(shù)鑒定方法，為含燈盞花中成藥的原料藥材物種溯源提供技術(shù)支持，從而對其質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器

6331 型PCR 儀、5424R 型小型臺式冷凍高速離心機均購于Eppendorf 公司；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；ZF-258 型全自動凝膠成像分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；LT1002E 型電子天平（常熟市天量儀器有限責(zé)任公司）；NTT-2000 型恒溫水浴鍋（東京理化器械株式會社）；NanoDrop Lite型超微量核酸定量儀（Thermo 公司）；Advantage A10 Milli-Q型超純水發(fā)生器（默克密理博公司）。

1.2 試劑

2×十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）緩沖液 [含2% CTAB、1.4 mol·L-1NaCl、1 mol·L-1Tris-HCl、0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）]、三氯甲烷-異戊醇（24∶1）、3 mol·L-1乙酸鈉；異丙醇、乙醇均購自利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司；甲醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；β-巰基乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；BIOWEST G-10 瓊脂糖（上海貝晶生物技術(shù)有限公司）；花青素核酸染料 [生工生物工程（上海）股份有限公司]；2×EsTaqMasterMix（Dye）（康為世紀生物科技股份有限公司）；超純水為自制。

1.3 樣品

燈盞細辛（燈盞花）對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121269-201103）；含燈盞花中成藥（包括2種單味中成藥和1種復(fù)方中成藥）具體信息見表1，留樣保存于云南省藥物研究所。

表1 3種含燈盞花中成藥信息

2 方法

2.1 燈盞花對照藥材DNA提取

將燈盞花對照藥材研磨成細粉（過四號篩）。取燈盞花藥材粉末約200 mg 置于2 mL 離心管，加入65 ℃預(yù)熱的2×CTAB 緩沖液1000 μL，振搖混勻，置于恒溫水浴鍋裂解2 h，每隔20 min 振蕩1 次。水浴完成后，10 000 r·min-1（離心半徑為8.5 cm）離心10 min，吸取上清液置于新的2 mL 離心管中。加入等體積三氯甲烷-異戊醇（24∶1）后振搖5 min 并充分混勻，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.5 cm），取上清液置于新的2 mL 離心管中。加入等體積的-20 ℃預(yù)冷異丙醇，置于-20 ℃沉淀2 h 后，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.5 cm），棄上清液。所得的沉淀置于37 ℃干燥箱1 h，使得乙醇充分揮發(fā)；待乙醇充分揮干后，加無菌水500 μL溶解，保存于-20 ℃或4 ℃?zhèn)溆?。以上方法提?個重復(fù)。

2.2 含燈盞花中成藥DNA提取

采用下述4種方法提取含燈盞花中成藥DNA。

方法一在經(jīng)典CTAB 植物總DNA 提取方法的基礎(chǔ)上進行改良，具體步驟：1）片劑去除中成藥的包衣，研細；膠囊直接去除膠囊殼后研細；2）稱取中成藥粉末約200 mg 于2 mL 的離心管內(nèi)，加入65 ℃預(yù)熱的2×CTAB緩沖液1000 μL和β-巰基乙醇20 μL，振搖，置于65 ℃水浴鍋中裂解2 h，期間每隔20 min振蕩1次；3）水浴完成后，10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.5 cm），吸取上清液置于新的2 mL離心管中；4）加入三氯甲烷-異戊醇（24∶1）1000 μL后振搖5 min并充分混勻，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.5 cm），取上清液另置于新的2 mL離心管；5）加入三氯甲烷-異戊醇（24∶1）1000 μL后振搖5 min并充分混勻，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.5 cm），取上清液另置于新的1.5 mL離心管加入同體積-20 ℃下的異丙醇，于-20 ℃下沉淀2 h，置于12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.5 cm），棄上清液；6）沉淀放于37 ℃干燥箱1 h，待乙醇揮發(fā)完畢后加無菌超純水500 μL 溶解，保存于-20 ℃或4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

方法二在方法一的基礎(chǔ)上增加了DNA 純化步驟，具體步驟：方法一的步驟1）至5）完成后，沉淀，用無菌超純水600 μL 溶解，加入乙醇1200 μL及3 mol·L-1乙酸鈉溶液60 μL，在離心管中混勻；于-20 ℃靜置1 h后，置于12 000 r·min-1離心15 min，該步驟重復(fù)2次；沉淀放于37 ℃干燥箱1 h，待乙醇揮發(fā)完畢后加無菌超純水500 μL溶解，保存于-20 ℃或4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

方法三是在CTAB 法的基礎(chǔ)上，參考程春松等[7]的方法，具體步驟：1）片劑去除中成藥的包衣，研細；膠囊直接去除膠囊殼后研細；2）稱取中成藥粉末約50 mg 于2 mL 的離心管內(nèi)（同一個樣取4 份）；3）每份加入65 ℃預(yù)熱的2×CTAB 緩沖液625 μL 和β-巰基乙醇25 μL，振搖，置于65 ℃水浴鍋中裂解2 h，期間每隔15 min 振蕩1 次；在8000 r·min-1離 心5 min（離心半徑為8.5 cm）；4）取上清液600 μL加入70%甲醇溶液1250 μL，振搖，-20 ℃沉淀1 h，8000 r·min-1離心5 min（離心半徑為8.5 cm），取沉淀加CTAB提取緩沖液150 μL及β-巰基乙醇4 μL，于65 ℃裂解20 min，期間振蕩，將4 份合成1 管；5）加入三氯甲烷-異戊醇（24∶1）1000 μL后振搖5 min并充分混勻，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.5 cm），取上清液另置于新的1.5 mL 離心管加入同體積-20 ℃的異丙醇，-20 ℃沉淀2 h，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑8.5 cm），棄上清液；6）沉淀于37 ℃干燥1 h，待乙醇揮發(fā)完畢后加無菌超純水500 μL溶解，保存于-20 ℃或4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

方法四在方法三的基礎(chǔ)上增加了DNA 純化步驟，具體步驟：方法三的步驟1）至5）完成后，沉淀，用無菌超純水600 μL 溶解，加入乙醇1200 μL及3 mol·L-1乙酸鈉溶液60 μL，在離心管中混勻；于-20 ℃靜置1 h后，置于12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.5 cm），該步驟重復(fù)2 次；沉淀放于37 ℃干燥箱1 h，待乙醇揮發(fā)完畢后加無菌超純水500 μL 溶解，保存在-20 ℃或4 ℃的冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

以上每個方法每個樣品12個重復(fù)。提取的DNA質(zhì)量濃度采用SPSS 18.0 的One-way ANOVA 進行方差分析，并用Duncan 多重比較法進行差異顯著性比較，結(jié)果以（±s）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 燈盞花對照藥材及含燈盞花中成藥的PCR擴增

使用ITS2F/ITS2R、ITS4/ITS5、matKXF/matK5R、matK3F/matK1R、psbA/trnH、rbcL1F/rbcL724R 進行燈盞花對照藥材及含燈盞花中成藥DNA 的PCR 擴增，引物序列見表2。上述引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括2×EsTaqMasterMix（Dye）5 μL、正反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、DNA 樣品溶液約100 ng、無菌超純水根據(jù)DNA 樣品添加量進行調(diào)整，補足至最終的PCR 反應(yīng)體系。根據(jù)已設(shè)定的PCR 擴增的程序進行擴增 [ITS 位點：94 ℃預(yù)變性5 min；進入循環(huán)，循環(huán)內(nèi)94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共34個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，10 ℃保存。psbA-trnH位點：95 ℃預(yù)變性4 min；進入循環(huán)，循環(huán)內(nèi)94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，10 ℃保存。matK、rbcL位點：94 ℃預(yù)變性5 min；進入循環(huán)，循環(huán)內(nèi)94 ℃變性1 min，48 ℃退火45 s；72 ℃延伸100 s，共34 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min，10 ℃保存]；PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表2 燈盞花對照藥材及含燈盞花中成藥PCR擴增引物序列

2.4 燈盞花對照藥材及含燈盞花中成藥的DNA 序列分析

將成功獲得的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，PCR 擴增引物作為測序引物，采用BioEdit去除測序結(jié)果兩端信號弱或重疊峰區(qū)域，序列方向與PCR 擴增正向引物方向一致，獲得不同位點相應(yīng)的DNA序列。

2.5 燈盞花對照藥材及含燈盞花中成藥的系統(tǒng)發(fā)育分析

從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載飛蓬屬不同物種的matK序列，對獲得的序列用軟件MEGA 5.0 比對并進行系統(tǒng)發(fā)育等分析。構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap（1000次重復(fù)）檢驗各分支的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取方法的比較

微量紫外-可見分光光度檢測結(jié)果顯示（表3），燈盞花對照藥材所獲得的DNA 質(zhì)量濃度為（205.00±42.14）ng·μL-1，A260nm/A280nm為1.99±0.02，說明DNA 質(zhì)量較佳；含燈盞花中成藥采用4 種方法均能獲得DNA，各樣品所獲得的DNA 質(zhì)量濃度均呈方法一（CTAB+β-巰基乙醇）＞方法二（CTAB+β-巰基乙醇+乙醇/乙酸鈉純化）＞方法三（CTAB+β-巰基乙醇+甲醇沉淀純化）＞方法四（CTAB+β-巰基乙醇+乙醇/乙酸鈉純化+甲醇沉淀純化），其中方法一提取的DNA 質(zhì)量濃度顯著高于其他方法，其A260nm/A280nm均小于1.60，說明存在大量有機物、多糖或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，4 種方法之間的A260nm/A280nm無明顯規(guī)律，說明乙醇/乙酸鈉純化或甲醇沉淀純化對含燈盞花中成藥DNA 純度的提升無明顯影響。在每種DNA 提取方法中，DNA 質(zhì)量濃度又均呈燈盞生脈膠囊＞益脈康分散片＞益脈康片，說明中成藥中的處方和制法也對DNA提取有影響。

表3 燈盞花對照藥材和含燈盞花中成藥的純度和質(zhì)量濃度

3.2 PCR擴增位點的選擇

利用ITS位點（ITS2F/ITS2R、ITS4/ITS5）、matK位點（matKXF/matK5R、matK3F/matK1R）、psbA-trnH位點（psbA/trnH）、rbcL位 點（rbcL1F/rbcL724R）4個位點6對引物對燈盞花對照藥材及不同方法提取的中成藥樣品DNA進行PCR擴增。結(jié)果表明（圖1），燈盞花對照藥材能成功擴增所有位點，除了psbA-trnH位點（psbA/trnH）擴增為有非特異擴增的條帶不適合產(chǎn)物直接測序，其他均為單一條帶可進行產(chǎn)物直接測序；但在中成藥DNA 中4 個位點6 對引物的PCR 擴增則呈現(xiàn)不同程度的差異：總體上以方法一和方法二提取的中成藥樣品DNA 進行PCR 反應(yīng)的成功率和擴增產(chǎn)物濃度相對較高；psbA-trnH位點（psbA/trnH）擴增條帶的帶型在4 個方法提取出的中成藥DNA 中擴增不完全一致，為單一條帶或有非特異擴增條帶，擴增特異性不佳；ITS 位點（ITS4/ITS5）在部分中成藥樣品中未能成功擴增；ITS 位 點（ITS2F/ITS2R）、matK位點（matKXF/matK5R 和matK3F/matK1R）、rbcL位點（rbcL1F/rbcL724R）均能擴增出單一條帶且與燈盞花對照藥材為相同位置，以matK位點2 對引物的PCR產(chǎn)物濃度最適合后續(xù)測序。

圖1 含燈盞花中成藥DNA的PCR擴增（部分）

3.3 matK序列對含燈盞花中成藥的分子鑒定

鑒于有的植物中存在內(nèi)生真菌[13]，中成藥制備、包裝、運輸?shù)冗^程中可能會引入微生物污染[14]，以及復(fù)方DNA 提取存在其他處方藥味DNA 干擾，為了明確含燈盞花中成藥與燈盞花對照藥材的PCR 擴增產(chǎn)物序列是否相同，在保證PCR 擴增成功率和擴增濃度的基礎(chǔ)上，選擇本研究中PCR 擴增成功率和擴增濃度最佳的matK位點制備含燈盞花中成藥分子鑒定所需測序樣品。對各樣品中獲得的matK位點（2 對引物）PCR 產(chǎn)物進行直接測序，進一步分析matK位點對含燈盞花中成藥的分子鑒定效果。結(jié)果表明，所有樣品均測序成功，且在matK片段序列（GGGATAGTCT……GTATACACAG 共 計670 bp）與燈盞花對照藥材及NCBI 燈盞花（GenBank 登錄號：NC043882.1、MN449489.1）相同區(qū)段序列同源性為100%；基于該序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明（圖2），3 個含燈盞花中成藥與燈盞花對照藥材、NCBI中的燈盞花聚為1支，且能與飛蓬屬其他31個種鑒別開，證明matK位點（2 對引物）對含燈盞花中成藥進行分子鑒定是有效的。

圖2 中成藥中燈盞花matK序列與飛蓬屬植物的鑒別

4 討論

4.1 含燈盞花中成藥DNA提取方法比較

中成藥一般是飲片或提取物經(jīng)過特定的工藝加工而成，有原粉末入藥（如丸劑、散劑等）和藥材經(jīng)過深加工（如液體制劑、顆粒劑等）兩大類[15]，在此過程中其DNA 多已降解，并引入了各類輔料，使得中成藥DNA 的提取比新鮮樣品或中藥材干品更困難。雖然常用DNA 提取的方法有CTAB 法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法等[16]，但相較而言，CTAB 法更廣泛地適用于植物類中藥材的DNA 提取，近年來，改良的CTAB 法被應(yīng)用于中藥材不同物種、品種、藥用部位的DNA 提取[17-19]。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中成藥的處方藥味物種溯源過程中，傳統(tǒng)DNA條形碼技術(shù)改良應(yīng)用[7-8,20]和新型技術(shù)應(yīng)用開發(fā)[21-23]均須以獲取高質(zhì)量DNA 為鑒定基礎(chǔ)。目前CTAB法[7-8]、SDS 法[24]、DNA 試劑盒法[9,22]、磁珠試劑盒法[25]常用于固體劑型的中成藥DNA 提取；乙醇沉淀法[26]則多用于液體劑型的中成藥DNA 提取。在含燈盞花中成藥制劑過程中，其制法工藝多將中藥飲片提取浸膏進行制劑（如本研究中采用的燈盞生脈膠囊）或直接以提取自中藥材的有效化合物進行制劑（如燈盞花素片等）[1]，其中，燈盞細辛浸膏工藝一般為醇提[1]，而化合物燈盞花素的制備工藝一般是在醇提浸膏的基礎(chǔ)上進行大孔吸附樹脂洗脫和酸沉工藝純化[27]，可見含燈盞花中成藥制法過程涉及醇、酸等有機試劑，對DNA 的破壞較為嚴重。由于本研究中成藥樣品加工過程中添加的輔料為淀粉等多糖類物質(zhì)，前人在提取此類中成藥DNA 的方法探索中多針對此類物質(zhì)的去除開展，多基于能較好地去除多糖類物質(zhì)的CTAB 法進行改良[28]。因此，本研究基于CTAB 法，結(jié)合文獻報道方法進行比較，結(jié)果表明，4種CTAB改良方法均能獲得不同質(zhì)量濃度的DNA，說明CTAB 法確實適用于提取含燈盞花中成藥的DNA；本研究中4 個方法提取中成藥的純度雖無明顯差異，但A260nm/A280nm均小于1.60，DNA 質(zhì)量與燈盞花對照藥材相差甚遠，其原因可能與本研究的中成藥樣品所涉及的處方藥味和制備工藝有密切關(guān)系，燈盞生脈膠囊涉及4 個藥味（燈盞細辛、人參、五味子、麥冬）、益脈康分散片和益脈康片涉及1 個提取物（燈盞細辛浸膏）均經(jīng)過乙醇提取、添加淀粉等步驟，這些過程同時將有效化學(xué)成分、核酸、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)混合提取，由于本研究采用的DNA 沉淀劑也為乙醇，導(dǎo)致制備工藝過程與DNA 混合的蛋白質(zhì)和多糖很難去除干凈，從而影響了中成藥DNA 的純度。本研究中的CTAB 改良方法一或方法二提取的DNA 質(zhì)量濃度明顯高于采用甲醇沉淀純化的方法三或方法四，甲醇沉淀的純化結(jié)果不如人參類中成藥[7]、當歸類中成藥[8]，其原因可能是甲醇沉淀純化不適用于含燈盞花中成藥的DNA 純度提升。另外，本研究中的每種中成藥DNA 提取方法中，DNA 質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)燈盞生脈膠囊＞益脈康分散片＞益脈康片，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其原因可能與其處方藥味量、劑型差異較大密切相關(guān)，燈盞生脈膠囊處方（1000 個單位）中含燈盞細辛3000 g，燈盞細辛浸膏片處方（1000 個單位）中含燈盞細辛浸膏160 g[1,29]。這說明含燈盞花中成藥的DNA 提取不僅與提取方法有關(guān)，還與中成藥本身的處方、制法、劑型相關(guān)。

4.2 含燈盞花中成藥的分子鑒定位點選擇

根據(jù)《中國藥典》2020 年版（四部）“9107 中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”，分子鑒定步驟包含DNA 提取、PCR 擴增和測序[30]。分子鑒定位點的選擇與該位點PCR 擴增效率、測序效率和鑒別效率有密切關(guān)系。DNA 條形碼鑒定技術(shù)應(yīng)用于植物類中藥材基原物種鑒定中，常用的通用條形碼有ITS、psbA-trnH、matK、rbcL，4 個DNA 候選條形碼片段的引物通用性、序列質(zhì)量和物種分辨率等綜合分析結(jié)果表明，ITS 的物種分辨率顯著高于rbcL+matK條形碼組合，ITS2 也具有較高的鑒定效率[13]。其中ITS/ITS2 和psbA-trnH在《中國藥典》2020 年版（四部）被推薦為藥用植物通用條形碼序列[30]。已有研究者在飛蓬屬植物（一般以植物鮮品為樣品）中獲得ITS、psbA-trnH、matK、rbcL4 個位點的序列，研究表明均有不同程度的鑒別效率[31-33]，而針對燈盞花植物則應(yīng)用ITS2 和matK進行鑒別，明確了這2 個位點對燈盞花有鑒別效果[12,34]。由于ITS、psbA-trnH、matK、rbcL4 個位點均有不同的通用引物，匹配每個位點不同區(qū)段的通用引物通用性各有差異，因此，本研究采用ITS、psbA-trnH、matK、rbcL這4 個位點常用的通用引物首先對DNA 質(zhì)量較佳的燈盞花對照藥材進行PCR 擴增以驗證其通用性，結(jié)果表明燈盞花對照藥材中能成功擴增濃度較高的產(chǎn)物，除了psbA位點（psbA/trnH）擴增有非特異擴增條帶不適合產(chǎn)物直接測序，其他均為單一條帶可進行產(chǎn)物直接測序，說明6 個引物在燈盞花這個物種的PCR 中通用性較好，在本研究的PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，引物psbA/trnH 對燈盞花對照藥材PCR 的特異性可能要比其他3 個位點5 對引物稍弱一些。與燈盞花對照藥材相比，中成藥DNA 純度相對不理想（A260nm/A280nm＜1.60），4 個位點6 對引物對提取DNA 質(zhì)量濃度最佳的方法一獲得的中成藥樣品DNA 中PCR 成功率和擴增產(chǎn)物濃度相對較高；PCR 成功率方面除了ITS 位點的1 對引物ITS4/ITS5存在未擴出PCR 產(chǎn)物的情況，其他引物均獲得PCR產(chǎn)物；特異性方面除了引物psbA/trnH，其他3 個位點5 對引物獲得的條帶均為單一條帶且與燈盞花對照藥材相同位置；擴增產(chǎn)物濃度以matK位點的2 對引物（matKXF/matK5R 和matK3F/matK1R）擴增的產(chǎn)物濃度與燈盞花對照藥材最為接近，最適合直接產(chǎn)物測序，其次是rbcL位點的1 對引物（rbcL1F/rbcL724R）和psbA-trnH位點的1對引物（psbA/trnH），最后是ITS 位點的2 對引物（ITS2F/ITS2R、ITS4/ITS5）。雖然在PCR 擴增過程中，DNA 模板質(zhì)量、PCR 擴增引物及反應(yīng)條件等因素可能會影響PCR 成功率[35]，但本研究中中成藥的PCR 擴增與燈盞花對照藥材在相同反應(yīng)體系、反應(yīng)條件下進行，兩者主要差異在于DNA 模板的質(zhì)量，因此，分析中成藥與燈盞花對照藥材的PCR 擴增產(chǎn)物濃度的差異可能與DNA 模板質(zhì)量密切相關(guān)，即中成藥DNA 中殘留的有機物、多糖或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多，對PCR擴增結(jié)果產(chǎn)生了不同程度的影響，這種影響在不同位點的不同引物之間存在差異，其中對matK位點的2 對引物影響最小，而對ITS 位點2 對引物影響較大，且2對引物之間差異也很大。

由于物種可能存在內(nèi)生真菌[13]，中成藥制備、包裝、運輸?shù)冗^程中也可能引入微生物污染[14]，復(fù)方中還有可能受到其他處方藥味DNA 干擾，加之，與葉綠體位點如matK、psbA-trnH、rbcL相比，ITS現(xiàn)在所用PCR 引物在植物和真菌間具有很高的通用性[36]，結(jié)合本研究中ITS 位點2 對引物在中成藥中PCR 擴增表現(xiàn)不佳，因此選擇葉綠體基因matK位點的2 對引物在保證PCR 擴增成功率和擴增濃度的基礎(chǔ)上開展測序，以明確中成藥的PCR 擴增產(chǎn)物為燈盞花的目的片段，結(jié)果表明含燈盞花中成藥均能測序成功，燈盞生脈膠囊、益脈康片、益脈康分散片擴增的產(chǎn)物序列與對照藥材、NCBI 燈盞花matK序列同源性100%，與飛蓬屬的其他31 個種能通過系統(tǒng)發(fā)育樹鑒別開，其中燈盞生脈膠囊雖為復(fù)方，但其測序結(jié)果依然為燈盞花，而不受其他藥味的影響，其原因可能是，燈盞生脈膠囊處方藥味中燈盞細辛量達3000 g，占處方藥味總量的1/2 以上[30]。進一步也說明傳統(tǒng)DNA 條形碼技術(shù)“DNA 提取+PCR 擴增+測序”方法除了鑒別含燈盞花單方中成藥，也可用于含燈盞花占比較大的復(fù)方中成藥中的燈盞花物種鑒別，該方法步驟已流程化，簡單易操作且耗費低廉，適于推廣應(yīng)用。

含燈盞花中成藥品種、制劑類型、輔料添加多樣，本研究僅對燈盞花單方和含燈盞花大比例的小復(fù)方進行DNA 條形碼分子鑒定法應(yīng)用探索，篩選出提取步驟、耗試劑相對較少且提取效率較高的DNA提取方法（CTAB 改良方法一）提取的含燈盞花中成藥DNA，能夠滿足后續(xù)matK位點通用引物（matK3F/matK1R、matKXF/matK5R）1 次PCR 擴增和測序，從而實現(xiàn)燈盞花原料藥材的鑒別，為建立和完善燈盞花中成藥的質(zhì)量控制、評價標準提供參考。但也需要注意的是，對于含燈盞花中成藥的其他處方，如燈盞花在其處方中的占比遠小于或等于其他藥味，或是采用提取化合物形式制劑如燈盞花素片等。本研究篩選的DNA條形碼技術(shù)“DNA提取+PCR擴增+測序”方法的應(yīng)用也需進一步驗證后方可知其效果。另外，ITS2 作為燈盞花另一個明確具有鑒別效果的位點[22]，在本研究中ITS 位點的引物ITS2F/ITS2R 在燈盞花對照藥材中均能獲得可用于測序的PCR 產(chǎn)物，在相同反應(yīng)體系、反應(yīng)條件下中成藥的1 次PCR 雖能成功擴增但獲得的產(chǎn)物濃度不甚理想，可從優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件、利用二次PCR 擴增以增加產(chǎn)物濃度、重新設(shè)計針對燈盞花ITS/ITS2 位點的特異引物或是繼續(xù)探尋含燈盞花中成藥DNA 純化的方法等方向進行探索，以提升PCR產(chǎn)物濃度，使測序順利進行。