李宣儒　夏玉　王麗　余思云　劉曉慶　付金榮

【摘要】目的：采用夾尾聯(lián)合自體移植的方法，建立氣滯血瘀型內(nèi)異癥（EM）大鼠模型，探討盆痛靈方對(duì)其的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制。方法：EM造模后隨機(jī)分組，A組（EM造模1周后夾尾），B組（EM造模不夾尾），C組（EM造模1周后夾尾加中藥盆痛靈干預(yù)），另設(shè)假手術(shù)組：D組（假手術(shù)1周后夾尾），E組（假手術(shù)不夾尾）。通過(guò)觀(guān)察大鼠的日常行為特征，測(cè)量大鼠不同時(shí)間點(diǎn)痛閾，檢測(cè)大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)，對(duì)氣滯血瘀型EM疼痛模型的模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)量大鼠給藥前后內(nèi)異灶體積。ELISA檢測(cè)大鼠雌二醇（E2）與前列腺素E2（PGE2）水平，免疫組化、RT-qPCR檢測(cè)大鼠環(huán)氧合酶-2（COX-2）蛋白和COX-2mRNA的表達(dá)。結(jié)果：A組（EM+夾尾）、D組（假手術(shù)+夾尾）夾尾造模后舌色瘀紫，暴躁易怒。A組（EM+夾尾）與B組（EM不夾尾）比較， D組（假手術(shù)+夾尾）與E組（假手術(shù)不夾尾）比較：其他條件相同時(shí)，進(jìn)行夾尾造模的組痛閾更低（P<0.05），血液流變學(xué)水平上升（P<0.05）， COX-2蛋白，COX-2mRNA和E2，PGE2表達(dá)增高（A：P<0.05，P<0.001，P<0.001，P<0.01/ D：P<0.01，P<0.01， P<0.001，P<0.001）。C組（EM+夾尾+中藥）治療后舌色淡粉，性格溫和。與A組（EM+夾尾+生理鹽水）比較，其內(nèi)異灶縮?。≒<0.001）；給藥4周后痛閾升高（P<0.001）；血液流變學(xué)水平下降（P＜0.05）；COX-2蛋白，COX-2mRNA和E2，PGE2表達(dá)降低（P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.001）。結(jié)論：采用夾尾聯(lián)合自體移植可成功制造氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型，通過(guò)大鼠行為學(xué)特征，血液流變學(xué)，痛閾三方面對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。盆痛靈方能改變大鼠行為學(xué)特征，縮小內(nèi)異灶體積，改善血液流變學(xué)水平，提高痛閾值，其作用機(jī)理為通過(guò)抑制大鼠體內(nèi)COX-2，PGE2和E2的表達(dá)水平，從而起到鎮(zhèn)痛作用。

【關(guān)鍵詞】盆痛靈方；氣滯血瘀；E2；COX-2；PGE2

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）18-0012-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.18.zgmzmjyyzz202318004

Study on the Analgesic Effect of Pentongling Formula on Rats with EM of Qi Stagnation and

Blood Stasis Syndrome Based on COX2-PGE2 PathwayLI Xuanru XIA Yu WANG Li YU Siyun LIU Xiaoqing FU Jinrong

1.Longhua Clinical Medical College，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China;

2.Shanghai Ninth Peoples Hospital，Shanghai JiaoTong Univesity School of Medicine，Shanghai 200011，China;

3.Department of Gynecology，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，ChinaAbstract：Objective The rat model of endometriosis （EM） with qi stagnation and blood stasis was established by tail clamping combined with autotransplantation， and the analgesic effect and mechanism of Pentongling Recipe were discussed. Methods After EM modeling， they were randomly divided into A group （EM modeling with tail clamping after one week）， B group （EM modeling without tail clamping） and C group （tail clipping after one week of EM modeling，and treat with traditional Chinese medicine）. Set up sham operation group： D group （sham operation with tail clipping） and E group （sham operation without tail clipping）. By observing the daily behavior characteristics of rats， measuring the pain threshold of rats at different time points， and detecting the hemorheology indexes of rats， the model quality of endometriosis pain model with qi stagnation and blood stasis was evaluated. The volume of endometriosis foci in rats was measured before and after administration.The levels of estradiol （E2） and prostaglandin E2（PGE2） in rats were detected by ELISA， and the expressions of cyclooxygenase-2（COX-2） protein and COX-2mRNA in rats were detected by immunohistochemistry and RT-qPCR.Results Group A （EM+tail clipping） and group D （sham operation+tail clipping） had purple tongue color and irritability after tail clipping. Compared with group A （EM+tail clipping）and group B（EM without tail clipping），group D （sham operation+tail clipping） and group E （sham operation without tail clipping），the pain threshold of the model group with tail clipping was lower when other conditions were the same （P<0.05），the level of hemorheology increased（P<0.05）， the expression of COX-2 protein，COX-2mRNA，E2 and PGE2 increased （A： P<0.05， P<0.001，P<0.001， P<0.01/ D：P<0.01， P<0.01， P<0.001， P<0.001）.Group C （EM+tail clipping+traditional Chinese medicine） had light pink tongue and mild personality after treatment. Compared with group A （EM+tail clipping+normal saline），its ectopic focus volume were smaller（P<0.001）;Pain threshold increased after 4 weeks （P<0.001）.The level of hemorheology decreased （P<0.05）;The expression of COX-2 protein，COX-2mRNA，E2 and PGE2 decreased（P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.001）.Conclusion The pain model of EM rats with qi stagnation and blood stasis can be successfully made by autologous intimal transplantation combined with tail clamping method. The model quality was evaluated by behavioral characteristics， hemorheology and pain threshold of rats. Pentongling recipe can change the behavioral characteristics of rats， reduce the volume of endometriosis foci， improve the level of hemorheology， and increase the pain threshold. Its mechanism is to relieve pain by inhibiting the expression levels of COX-2， PGE2 and E2 in rats.

Keywords：Pentongling Formula;Qi Stagnation and Blood Stasis;E2;COX-2;PGE2

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）是婦科常見(jiàn)的疑難雜癥，在全世界育齡期婦女中占10％，是導(dǎo)致痛經(jīng)和慢性盆腔疼痛的主要原因之一［1］。其反復(fù)發(fā)作的疼痛嚴(yán)重影響女性的身心健康，使部分患者出現(xiàn)抑郁焦慮傾向，故如何緩解患者的疼痛，提高患者生活質(zhì)量已成為臨床治療EM的關(guān)鍵。課題組前期研究［2］證實(shí)盆痛靈可以緩解EM大鼠的疼痛，本研究在前期EM造模的基礎(chǔ)上加入夾尾，建立病證結(jié)合的氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型，以進(jìn)一步探究盆痛靈對(duì)氣滯血瘀型EM大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物9周齡清潔級(jí)SD雌性大鼠，規(guī)格為（180±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求（No.PZSHUTCM201106008）。

1.2藥物盆痛靈顆粒劑（三棱，莪術(shù)，延胡索，川楝子，虎杖），龍華醫(yī)院中藥房提供，符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。按成年人體重為50 kg計(jì)算，每日生藥量為51 g，SD大鼠按人體每日用藥量的6.25倍進(jìn)行換算，故每日給藥量為6.375 g·kg·d。

1.3主要試劑和儀器試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit（批號(hào)：RR037A，TaKaRa公司），熒光定量PCR試劑盒 TB Green? Premix Ex Taq（批號(hào)：RR420A，TaKaRa公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號(hào)：A0208，碧云天）， Cox2（D5H5）XP? Rabbit mAb#12282（批號(hào)：12282S，CST），Trizol（批號(hào)：G8011-100mL，Adamas life），大鼠前列腺素E2（PGE2）酶聯(lián)免疫分析（批號(hào)：MM-0068R1，酶免），大鼠雌二醇（E2）酶聯(lián)免疫（批號(hào)：MM-0575R1，酶免）。儀器：VonFrey纖維絲（型號(hào)：NC12775-99，NorthCoast），全自動(dòng)血流變測(cè)試儀（型號(hào)：ZL9100C，北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司），PCR基因擴(kuò)增儀（型號(hào)：PROFLEX，賽默飛），實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀（型號(hào)：7500，賽默飛），低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：Centrifuge 5810 R，Eppendorf），酶標(biāo)儀（型號(hào)：Synergy H1，BioTek Instruments，Inc.）等。

1.4分組、造模和給藥方法通過(guò)自體內(nèi)膜種植法［3］對(duì)大鼠進(jìn)行EM造模，取造模成功的30只大鼠，隨機(jī)分成A組（EM造模1周后夾尾），B組（EM造模不夾尾）和C組（EM造模1周后夾尾加中藥盆痛靈干預(yù)）。另設(shè)假手術(shù)組（結(jié)扎后剪下單側(cè)的一段子宮，不進(jìn)行內(nèi)膜種植）20只：隨機(jī)抽取10只作為D組（假手術(shù)1周后夾尾），剩余10只為E組（假手術(shù)不夾尾）。

在開(kāi)腹造模1周后，大鼠腹部傷口基本愈合，開(kāi)始對(duì)A組、C組和D組進(jìn)行夾尾造模：用紗布包裹書(shū)夾（紗布是為了控制書(shū)夾力度，防止大鼠尾部皮膚受損），夾住大鼠的尾部，大鼠被夾后情緒暴躁，會(huì)與其他大鼠發(fā)生打斗，此時(shí)可以把書(shū)夾松開(kāi)，每次刺激30 min，每日2次，持續(xù)刺激3周［4］。

2周后各組大鼠進(jìn)行二次開(kāi)腹，EM模型大鼠內(nèi)異灶向上凸起且內(nèi)含透亮液體視為造模成功。夾尾造模的大鼠通過(guò)觀(guān)察其行為學(xué)特征（舌紫，暴躁等氣滯血瘀之象），血液流變學(xué)（升高）和痛閾（變?。┑淖兓袛嗥淠Ｐ唾|(zhì)量。

所有大鼠均采用直腸給藥，A組、B組、D組、E組給予1 mL 0.9%生理鹽水。C組給予盆痛靈，按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［5］換算，劑量為每日6.375 g·kg（臨床等效量），配成1 mL藥液。各組大鼠灌腸均每次1 mL，每日1次，持續(xù)4周。末次給藥后，采集大鼠血液、腹腔液、子宮內(nèi)膜組織。

2檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.1痛閾測(cè)量搭建老鼠足底觸覺(jué)痛覺(jué)測(cè)試鑿孔臺(tái)，該設(shè)備分為鑿孔臺(tái)和鼠籠。大鼠放于鼠籠適應(yīng)環(huán)境30 min，按照Dixon的“up&down”法，使用VonFrey纖維絲從2.0 g的力度開(kāi)始刺激大鼠腳掌中部的皮膚，觀(guān)察大鼠是否有縮足舔爪等躲避反應(yīng)，并進(jìn)行記錄［6］。如大鼠無(wú)反應(yīng)為陰性反應(yīng)（記為“o”），使用大一級(jí)的纖維絲繼續(xù)刺激。大鼠出現(xiàn)縮足為陽(yáng)性反應(yīng)（記為“x”），使用小一級(jí)力度的纖維繼續(xù)刺激。當(dāng)大鼠陰性反應(yīng)和陽(yáng)性反應(yīng)（“ox”或“xo”）交替出現(xiàn)時(shí)，再連續(xù)往后測(cè) 4 次，得到一串以“o”和“x”組合而成的序列，以該序列和最后一根纖維絲的刺激力規(guī)格，計(jì)算得出痛閾。測(cè)量時(shí)間為各組大鼠造模前（術(shù)前痛閾，術(shù)D0），以及二次開(kāi)腹術(shù)后第 1天、第 3天、第 5天 、第 7天 、第14天、第21天和第28天（術(shù)D1、術(shù)D3、術(shù)D5、術(shù)D7、術(shù)D14、術(shù)D21、術(shù)D28）。

2.2內(nèi)異灶體積測(cè)量游標(biāo)卡尺測(cè)量?jī)?nèi)異灶的最大橫徑，和與之垂直的縱徑，計(jì)算體積。

2.3血液流變學(xué)檢測(cè)腹主動(dòng)脈取血4 mL，放入肝素抗凝負(fù)壓采血管中，采用全自動(dòng)血流變測(cè)試儀檢測(cè)凝血四項(xiàng)。

2.4免疫組化檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行包埋，切片，脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，血清封閉。加一抗，濕盒4 ℃孵育過(guò)夜。加二抗，濕盒37 ℃內(nèi)孵育45 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀(guān)察及拍片，每張切片拍攝5個(gè)視野（x200），使用Image-pro軟件對(duì)COX-2蛋白進(jìn)行積分光密度（IOD）的計(jì)算。

2.5ELISA檢測(cè)腹腔液中E2、PGE2的水平取大鼠腹腔液，配置試劑備用。在待測(cè)樣品孔中加樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10 μL?；靹颍瞻卓淄饷靠准尤朊笜?biāo)試劑100 μL，貼封板膜，37 ℃孵育60 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，加洗滌液洗滌5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，混勻，37 ℃避光顯色15 min。加終止液50 μL，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值。

2.6RT-qPCR檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中COX-2mRNA的表達(dá)50 mg大鼠組織加入1 mLTrizol，冰上靜置，加入氯仿，離心，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，離心，加入等體積乙醇洗滌，離心，溶解于DEPC水中，以紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度和OD260/OD280、OD260/OD230。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptT RT reagent Kit合成cDNA，β-actin作為內(nèi)參，擴(kuò)增引物由生工生物工程合成，引物序列見(jiàn)表1，使用熒光定量PCR試劑盒TB Green? Premix Ex TaqTM進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-的方法計(jì)算其COX-2mRNA表達(dá)量。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 26.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料時(shí)，如滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性，以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行描述，兩組間比較使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較使用SNK檢驗(yàn)。滿(mǎn)足正態(tài)分布但方差不齊時(shí)，使用校正t檢驗(yàn)。不滿(mǎn)足正態(tài)分布且方差不齊時(shí)，使用非參數(shù)檢驗(yàn)。雙變量均滿(mǎn)足正態(tài)分布時(shí)，相關(guān)性分析采用Pearson法檢驗(yàn)，雙變量不符合正態(tài)分布時(shí)，相關(guān)性分析采用Spearman法檢驗(yàn)。均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)P≤0.05時(shí)，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1氣滯血瘀型疼痛模型大鼠的行為學(xué)特征A組與D組爪甲舌色瘀紫，耳緣發(fā)紫，尾部有暗紫色瘀斑，眼睛突出，暴躁易怒，攻擊性強(qiáng)，易激惹［7］，體型偏瘦，食少，飲水多。C組用藥后4周爪甲舌色呈粉紅色，性情溫和，體型圓潤(rùn)，B組與E組無(wú)明顯特征。

3.2大鼠不同時(shí)間段的痛閾變化各組大鼠術(shù)D痛閾無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.10）。E組術(shù)D、術(shù)D與術(shù)D的痛閾無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），可證明假手術(shù)造模和生理鹽水灌腸對(duì)痛閾無(wú)影響。B組術(shù)D痛閾小于E組（P＜0.05），可證明EM造?？山档痛笫笸撮摚勾笫蟮奶弁疵舾卸壬?。D組術(shù)D痛閾小于E組（P＜0.05），提示單純夾尾也可以降低大鼠痛閾，提高大鼠疼痛敏感度。D組術(shù)D痛閾大于B組（P＜0.05），說(shuō)明EM造模降低痛閾的效果高于夾尾。A組術(shù)D痛閾小于D組（P＜0.01）與B組（P＜0.05），提示相較于單純的夾尾或EM造模，夾尾聯(lián)合EM造模降低大鼠痛閾的效果最好。A組術(shù)D痛閾與術(shù)D無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.50），小于B組術(shù)D（P＜0.05）；D組術(shù)D痛閾與術(shù)D無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），小于E組術(shù)D（P＜0.001），術(shù)D時(shí)夾尾造模已停止2周，痛閾仍持續(xù)下降，說(shuō)明該造模具有持續(xù)性。C組術(shù)D大于A組術(shù)D（P＜0.001），提示盆痛靈可治療氣滯血瘀型EM。見(jiàn)表2。

如圖1，E組和C組在術(shù)后先下降，后逐漸上升，高于其他3組。D組在術(shù)后先下降，后緩慢上升，又在氣滯血瘀的造模過(guò)程中下降。A組和B組術(shù)后基本呈下降趨勢(shì)，前者整體較后者更低。

3.3盆痛靈對(duì)大鼠異位灶體積的影響如表3，A組、B組在二次開(kāi)腹時(shí)的異位灶體積小于其取材時(shí)（P＜0.01），提示此兩組異位灶體積隨著時(shí)間變化逐漸增大，生理鹽水灌腸無(wú)治療作用。C組在二次開(kāi)腹時(shí)的異位灶體積大于其取材時(shí)（P＜0.001），小于A組取材時(shí)（P＜0.001），提示盆痛靈可縮小異位灶體積。

3.4大鼠血液流變學(xué)變化如表4，B組全血黏度低、中、高切大于E組（P＜0.05），提示大鼠經(jīng)EM造模后血液黏度變高。A組全血黏度低切大于B組（P＜0.05），D組全血黏度低、中切大于E組（P＜0.05），提示大鼠經(jīng)過(guò)夾尾造模后，紅細(xì)胞聚集性變高，血液黏度變高。D組全血黏度低、中、高切小于A組（P＜0.05），與B組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示夾尾聯(lián)合EM造模相較于單純的EM造?；驃A尾，可以進(jìn)一步提高大鼠血液黏度。C組全血黏度低、中、高切小于A組（P＜0.05），全血黏度低、中、高切和血漿黏度均與E組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.10），提示盆痛靈可以改善氣滯血瘀型EM大鼠的血液黏滯程度。

3.5免疫組化檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)COX-2主要在大鼠異位子宮內(nèi)膜組織的腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中進(jìn)行表達(dá)，在正常子宮內(nèi)膜上表達(dá)較弱。它在A組表達(dá)最為明顯，B組其次，在D組的陽(yáng)性表達(dá)較前兩者減弱，在C組和E組里基本無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)，如圖2所示。

如表5，A組的COX-2蛋白表達(dá)高于B組（P＜0.05），D組高于E組（P＜0.01），提示經(jīng)過(guò)夾尾造模后，大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)水平升高。C組和E組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），低于A組（P＜0.001），提示盆痛靈可以降低COX-2蛋白表達(dá)水平。

3.6ELISA檢測(cè)大鼠腹腔液中E2，PGE2的水平如表6與表7，A組高于B組（E2：P＜0.001；PGE2：P＜0.01），D組高于E組（P＜0.001），提示經(jīng)過(guò)夾尾造模后，大鼠E2，PGE2水平增高。C組和E組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（E2：P＞0.05；PGE2：P＞0.5），低于A組（P＜0.001），提示盆痛靈可降低氣滯血瘀型EM大鼠的E2，PGE2水平。

3.7RT-qPCR檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜組織中COX-2mRNA的表達(dá)見(jiàn)表8，A組的COX-2 mRNA大于B組（P＜0.001），D組的COX-2 mRNA高于E組（P＜0.01），提示經(jīng)過(guò)夾尾造模后，大鼠COX-2 mRNA表達(dá)升高。C組與E組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），低于A組（P＜0.01），證明盆痛靈可降低氣滯血瘀型EM大鼠COX-2 mRNA表達(dá)水平。

3.8各檢測(cè)指標(biāo)與痛閾的相關(guān)性分析見(jiàn)表9，COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表達(dá)水平與痛閾之間均存在顯著相關(guān)及負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表達(dá)水平越高，大鼠痛閾越低，疼痛越嚴(yán)重。

4討論

目前臨床上尚無(wú)能徹底治愈EM的藥物，故人們一直致力于新藥物的研發(fā)。疼痛是EM最主要的癥狀，構(gòu)建符合EM臨床發(fā)病特點(diǎn)的動(dòng)物模型是藥物研發(fā)的基礎(chǔ)，所以創(chuàng)建理想的EM疼痛動(dòng)物模型是值得關(guān)注的問(wèn)題。

當(dāng)前EM模型多著重于EM疾病本身，尚未見(jiàn)有針對(duì)EM疼痛的模型報(bào)道。課題組前期研究［2］已證實(shí)通過(guò)自體內(nèi)膜移植可成功建造EM模型大鼠。本研究在前期研究基礎(chǔ)上首次加入夾尾，建立病證結(jié)合的氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型， 通過(guò)機(jī)械測(cè)痛，檢測(cè)血液流變和觀(guān)察行為學(xué)特征對(duì)該模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。該疼痛模型在西醫(yī)理論復(fù)制疾病模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用中醫(yī)理論構(gòu)建證候模型的方法加重大鼠疼痛度，旨在為EM疼痛防治研究提供穩(wěn)定性高，重復(fù)性好且與臨床實(shí)際更吻合的動(dòng)物模型。

本研究中，夾尾后的大鼠爪、甲、舌、耳，尾部的顏色發(fā)紫，且伴有眼突，暴躁易激，是持續(xù)疼痛導(dǎo)致的氣滯血瘀之象；比較各組痛閾，與單純夾尾或EM造模相比，夾尾聯(lián)合EM造模的大鼠痛閾最低，說(shuō)明夾尾作為一種輔助手段，聯(lián)合EM造?？勺畲蟪潭冉档痛笫笸撮?，增高其痛覺(jué)敏感度；比較各組血液流變學(xué)，夾尾聯(lián)合EM造模的大鼠全血黏度上升程度最高，提示大鼠紅細(xì)胞聚集性變高，紅細(xì)胞積聚形成血瘀，使血液黏度變高［9］，符合氣滯血瘀狀態(tài)。該模型夾尾造模結(jié)束于術(shù)D14，血液流變水平和痛閾（術(shù)D28）的結(jié)果均是在夾尾造模停止2周后測(cè)得的，說(shuō)明其氣滯血瘀狀態(tài)具有持續(xù)性，不會(huì)隨物理刺激的停止而消失，故具有一定推廣性。

有研究證實(shí)，COX-2與PGE2在EM中與疼痛呈正相關(guān)。COX-2通過(guò)生成PGE2，參與炎癥反應(yīng)，加重EM的疼痛［10-11］。PGE2升高可加速E2的合成［12］，E2可介導(dǎo)ERβ上調(diào)COX-2表達(dá)，而COX-2又刺激炎性介質(zhì)PGE2產(chǎn)生［13-14］，三者相互作用，使EM患者感到疼痛。

觀(guān)察各組COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2表達(dá)水平及各指標(biāo)與痛閾的相關(guān)性分析可發(fā)現(xiàn)：夾尾后大鼠各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)皆有上升，痛閾變低，疼痛程度加重，其中夾尾聯(lián)合EM造模的大鼠各指標(biāo)表達(dá)水平最高，痛閾最低。使用盆痛靈治療后，大鼠各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)皆下降，痛閾變高，疼痛得到緩解。

盆痛靈方由三棱、莪術(shù)、虎杖、延胡索和川楝子組成，具活血行氣、祛濕止痛之功［15-16］。前期研究［17］表明盆痛靈可緩解EM盆腔疼痛，本實(shí)驗(yàn)大鼠治療后，爪甲舌色呈粉紅，性溫體圓；血液流變水平下降；內(nèi)異灶縮??；痛閾升高，大鼠疼痛得到緩解，盆痛靈方的作用機(jī)理可能是通過(guò)COX2-PGE2信號(hào)通路，抑制PGE2的表達(dá)水平，從而起到鎮(zhèn)痛作用。參考文獻(xiàn)

［1］中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)婦產(chǎn)科醫(yī)師分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)子宮內(nèi)膜異位癥協(xié)作組.子宮內(nèi)膜異位癥診治指南（第三版）［J］. 中華婦產(chǎn)科雜志，2021，56（12）：812-824.

［2］付金榮，朱姍，徐英，等.盆痛靈灌腸對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠疼痛行為的影響及其機(jī)理探討［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2020，48（1）：17-21.

［3］BERKLEY K J，DMITRIEVA N，CURTIS K S，et al. Innervation of ectopic endometrium in a rat model of endometriosis［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（30）：11094-11098.

［4］王婷婷，賈乘，陳宇，等.大鼠氣滯血瘀證模型的建立及影響因素分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37（11）：1629-1633.

［5］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：202-203.

［6］范成雷. BoNT/A關(guān)節(jié)腔注射對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1表達(dá)的影響［D］.青島：青島大學(xué)，2017.

［7］鄭躍，劉麗，劉建秋.氣滯血瘀型慢性輸卵管炎癥大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2019，29（2）：58-65，83.

［8］劉楠，姜云耀，李瑩，等.氣滯血瘀證動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（1）：217-226.

［9］凌爽，畢悅，李孟，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)氣虛血瘀模型大鼠血液流變學(xué)的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2021，38（4）：29-32.

［10］汪逸純，張真真，萬(wàn)貴平.子宮內(nèi)膜異位癥致疼痛的發(fā)生機(jī)制及治療方法研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2021，11（4）：39-42.

［11］ZIDAN H E， REZK N A， ALNEMR A A， et al. COX-2 gene promoter DNAmethylation status in eutopic and ectopic endometrium of Egyptianwomen with endometriosis［J］. J Reprod Immunol，2015（112）：63-67.

［12］齊之迎，尹利榮.子宮內(nèi)膜異位癥盆腔痛患者血清雌二醇與TNF-α水平變化的研究［J］.天津醫(yī)藥，2014，42（2）：138-140.

［13］GONALVES R M，DELGOBO M，AGNES J P，et al. COX-2 promotes mammary adipose tissue inflammation， local estrogen biosynthesis， and carcinogenesis in high-sugar/fat diet treated mice［J］.Cancer Lett，2021（502）：44-57.

［14］ZHEN L Z，LI Y H，YAO H S， et al. Cyclooxygenase-2 in Endometriosis［J］.Int J Biol Sci，2019，15：2783-2797.

［15］徐英，付金榮，沈宇鳳，等.盆痛靈方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體表達(dá)的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，33（6）：44-49.

［16］章仕雯，付金榮，徐英，等.盆痛靈方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2021，41（12）：1461-1467.

［17］徐英.基于神經(jīng)生長(zhǎng)因子探討盆痛靈方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠疼痛的鎮(zhèn)痛作用機(jī)理［D］.上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2020.

（收稿日期：2023-01-12編輯：劉斌）