鄭德波, 石 前, 蒙 平, 庾韋花

(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 南寧 530007)

天冬(Asparaguscochinchinensis)是百合科天門冬屬的藤本植物,是我國常用的傳統(tǒng)大宗中藥材之一,以干燥塊根入藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并被歷代本草收錄。天冬性寒、味甘、微苦,具有生津止渴、養(yǎng)陰潤燥、清肺等功效,主治咽干口渴、內(nèi)熱消渴、肺熱燥咳等癥狀[1]。Lei等[2]研究表明,天冬的一些水溶性提取物具有抗氧化延緩衰老的功效。長期以來,天冬以野生塊根入藥為主。隨著市場需求的逐漸加大,過度采挖導(dǎo)致天冬野生資源日漸枯竭[3],天冬已成為國家重點保護(hù)的野生藥材物種之一[4]。野生資源人工栽培是實現(xiàn)天冬資源可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一,雖然天冬人工栽培技術(shù)研究在全國各地有所開展,但其種源以野生種質(zhì)為主且來源混亂,導(dǎo)致天冬的產(chǎn)量和品質(zhì)都無法保障。廣西是我國天冬的重要產(chǎn)地之一,天冬種質(zhì)資源十分豐富,遍布全區(qū)[5]。天冬種質(zhì)資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系和系譜關(guān)系的研究是其資源的搜集保存和利用的理論基礎(chǔ),開展這方面的研究是非常必要和迫切的。

簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)標(biāo)記是廣泛分布于各個物種中的一類標(biāo)記,具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好和操作簡單等優(yōu)點,在動植物分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)資源評估、基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇、品種真實性和種子純度鑒定等領(lǐng)域的研究都有很好的應(yīng)用價值[6]。

熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)是在PCR擴增時使用有熒光標(biāo)記的引物替代普通引物,擴增出來的片段一條鏈帶上熒光標(biāo)記,可直接讀取目標(biāo)片段準(zhǔn)確大小,大大降低了分辨擴增產(chǎn)物的難度,提高了研究的效率和準(zhǔn)確性。目前,該技術(shù)已應(yīng)用于糧食作物(玉米[7]、水稻[8]等)、果樹(桃[9]、杧果[10]、火龍果[11]等)和中藥材(當(dāng)歸[12]、三七[13]、三葉青[14]等)一些物種的分子標(biāo)記研究中。相較于傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,毛細(xì)管自動電泳熒光檢測法[15]是較為先進(jìn)的檢測技術(shù)。該技術(shù)通過不同顏色標(biāo)記熒光引物,檢測結(jié)果可精確到1 bp,能夠?qū)崿F(xiàn)低成本、高效率地檢測多個SSR標(biāo)記、多個位點信息。

天冬的相關(guān)報道以其藥用成分的研究為主,種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究報道較少。目前,國內(nèi)僅有兩篇關(guān)于天門冬種質(zhì)資源ISSR遺傳多樣性的研究報道[16-17]。ISSR標(biāo)記為顯性標(biāo)記,無法區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型,其標(biāo)記數(shù)量有限,PCR擴增時對DNA模板的質(zhì)量要求較高,而且其PCR產(chǎn)物檢測自動化程度不高,這些不足都極大地限制了天冬種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的開展。SSR熒光標(biāo)記則很好解決了這些問題。廣西作為國內(nèi)天冬的重要產(chǎn)地之一,天冬種質(zhì)資源極其豐富,而前人的研究中鮮有廣西天冬材料的報道。因此,開展廣西周邊地區(qū)的天冬種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究,有助于理清現(xiàn)有各種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,發(fā)掘廣西的優(yōu)異天冬資源,為廣西天冬育種和生產(chǎn)提供優(yōu)異種質(zhì),進(jìn)而為廣西的天冬產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。目前,SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)用于天冬種質(zhì)資源遺傳分析的研究筆者尚未見報道。因此,本研究借助該技術(shù)對25份天冬種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,優(yōu)化天冬SSR毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù),為天冬種質(zhì)資源鑒定及雜交育種親本選擇的遺傳分析提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗中所選用的25份天冬材料均為本單位藥用植物利用團隊經(jīng)過多年收集整理,經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所廣西藥用植物園植物分類學(xué)專家鑒定,種植保存于廣西農(nóng)科院生物所大棚及里建基地。經(jīng)鑒定,這些天冬材料均為百合科天門冬屬天門冬種[Asparaguscochinchinensis( Lour. ) Merr.],采集地不同,植株性狀稍有不同。主要包括廣西及其周邊省份、鄰國越南等地的野生種及栽培種,詳情如表1所示(共取樣27份,其中樣品18由于樣品量太少而棄用,樣品17由于在與其他25份樣品多樣性分析時數(shù)值異常而剔除)。取這些材料的葉片用于提取總DNA。主要儀器設(shè)備及試劑:PCR 儀(杭州晶格K960);水平電泳儀(北京君意 JY300C);凝膠成像儀(北京科創(chuàng)K8160 );測序儀(美國應(yīng)用生物ABI 3730XL);Taq酶、dNTP、DL2000(寶生物TaKaRa)。

表1 25份天冬材料編號及來源

1.2 天冬基因組DNA提取

天冬葉片中多糖多酚等次生代謝物較多,DNA提取較困難,故參照韋榮昌等[18]的改良CTAB法進(jìn)行DNA提取。

1.3 SSR引物篩選

普通引物參照Manish Kapoor等[19]報道的SSR 引物序列,由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。用17,24,25,26 這4個樣本對24對引物進(jìn)行篩選。多態(tài)性引物篩選PCR反應(yīng)體系參考曾桂萍等[20]采用的20 μL體系稍作優(yōu)化:dNTP 0.4 μL,Buffer 2 μL, SSR引物0.6 μL[其中,F鏈 0.3 μL(20 μmol/L),R鏈0.3 μL(20 μmol/L)],DNA模板2 μL,Taq0.2 μL,ddH2O 14.8 μL。擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,46～52 ℃復(fù)性35 s,72 ℃延伸40 s,共 35個循環(huán);最終72 ℃延伸3 min。

1.4 SSR-PCR擴增及毛細(xì)管電泳檢測

所有參試樣品熒光引物PCR擴增時所采用的反應(yīng)體系和擴增程序與多態(tài)性引物篩選完全相同,只是將之前的普通引物的F鏈換成加注FAM(藍(lán))熒光染料的F鏈。擴增產(chǎn)物在 3730 測序儀(ABI3730XL)進(jìn)行毛細(xì)管電泳,篩選出多態(tài)性較好的位點。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Convert1.31軟件要求,將每個樣品在各個等位基因位點的片段大小按格式錄入到Excel軟件中,然后用Convert1.31軟件轉(zhuǎn)化成POPGENE軟件所要求格式。使用POPGENE1.32軟件分別進(jìn)行各引物及各種群的遺傳多樣性分析。用Nei(1972)的遺傳一致度I(Genetic Identity)和遺傳距離GD(Genetic Distance)來衡量各種群之間的遺傳分化大小?；谶z傳相似系數(shù),使用NTSYS Version2.10e軟件中UPGMA法對各樣品進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的多態(tài)性分析

24 條 SSR 引物中,共篩選出 8條多態(tài)性好且條帶清晰的 SSR 引物(表2)。

表2 多態(tài)性SSR引物信息

通過8對引物檢測,25個天冬樣本共檢測出48個等位基因位點。等位基因數(shù)目中,最小為引物P8,多態(tài)性比率為100%;最大等位基因數(shù)目為12(引物P15),多態(tài)性比率為83%,平均每個位點等位基因數(shù)目為4.1。遺傳多樣性參數(shù)結(jié)果表明:觀測等位基因數(shù)(Na)平均為6.0個,有效等位基因數(shù)平均為3.81;期望雜合度平均為0.66,PIC平均為0.60。以上結(jié)果表明,25份天冬種質(zhì)資源間具有較為豐富的遺傳多樣性,部分引物對供試樣品的檢測結(jié)果(圖1)。Shannon指數(shù)和基因多樣性指數(shù)平均值分別為1.33和0.64,表明供試樣品具有較高的遺傳多樣性(表3)。

注:左為P15,右為P23;上為樣品7,中為樣品19,下為樣品25。

表3 SSR多態(tài)引物相關(guān)指標(biāo)

2.2 25份天冬種質(zhì)資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用Evanno 等[21]的方法計算得到的最適 deltaK值為4(表4),表明 25 份樣品來自 4 個基因庫。由表4可知,當(dāng)K=4時,樣品2、樣品10、樣品11、樣品15、樣品16、樣品21和樣品27的基因主要來自基因庫1,樣品4、樣品5、樣品8和樣品12的基因主要來自基因庫2,樣品,1、樣品3、樣品6、樣品13、樣品14、樣品20、樣品24和樣品26的基因主要來自基因庫3,樣品7、樣品19、樣品23和樣品25的基因主要來自基因庫4,樣品9的基因主要來自基因庫3,基因庫4,樣品22的基因主要來自基因庫1,基因庫2,基因庫3。說明這些天冬材料非均質(zhì)、具有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)。

2.3 25份天冬種質(zhì)資源的遺傳相似性分析

利用 8對SSR引物標(biāo)記,用 NTSYS 軟件計算得到 25 份天冬樣本的遺傳相似性系數(shù)。結(jié)果(表5)表明,25份材料的遺傳相似性系數(shù)為0.08～1.00,平均為0.44。其中遺傳相似性系數(shù)最小的為樣品16(LL,隆林)和樣品20(野2-1),說明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn),遺傳差異相對大;遺傳相似性系數(shù)最大為樣品7(南普-12)、樣品19(NM,寧明)和樣品25(玉普-1),說明三者遺傳差異相對較小,親緣關(guān)系比較相近。遺傳相似性結(jié)果分析表明,測試的 25份天冬種質(zhì)遺傳多樣性豐富。值得關(guān)注的是,樣品16與樣品4,5,8,9,12,14,20,26這8個樣品的遺傳相似系數(shù)均較小,遺傳差異明顯,在資源創(chuàng)制和新品種選育時,可以重點關(guān)注這個材料。

表5 25份天冬種質(zhì)資源的遺傳距離與遺傳相似系數(shù)

2.4 25份天冬種質(zhì)資源的聚類結(jié)果分析

利用 NTSYS V2.1 軟件對 25份供試材料進(jìn)行聚類分析,得到相應(yīng)的聚類圖(圖2),在遺傳相似系數(shù)0.32處,25份供試天冬材料可分為類群Ⅰ和類群Ⅱ兩大類。其中, 21 份天冬樣品在類群Ⅰ中, 剩余4 份天冬樣品(長優(yōu)1、XZ、海南和LL(隆林))歸入類群Ⅱ中。在遺傳相似系數(shù)0.52處,類群Ⅰ又可分為4個亞群,第一個亞群(ⅰ)包括:TDD組培苗、Vietnam(越南)、BS-1(不結(jié)薯)、桂冬1號、野2-1(雄株)、YL-分1、玉桂冬T、野2-1(雌株)和野2-1 9個樣品;第二個亞群(ⅱ)包括:BS-3(結(jié)薯)、LS-1、QZ、南DTD和野長-1;第三個亞群(ⅲ)包含:南普-12、NM、玉普-1、野長-2和TL-2;第四個亞群(ⅳ)包含:忻優(yōu)1和HS。

圖2 25份天冬種質(zhì)資源的聚類結(jié)果

3 討 論

SSR引物具有數(shù)量多、多態(tài)性好、共顯性和易于PCR操作等特點,因而被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中。對于已測序完成的物種,其基因組序列可以在NCBI等數(shù)據(jù)庫上查詢到,廣大科研工作者可以根據(jù)基因組序列開發(fā)大量的SSR引物,廣泛應(yīng)用到各研究領(lǐng)域。對于一些尚未完成全基因組測序的物種,由于沒有已知的基因組序列,無法開發(fā)SSR引物。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步,可以通過簡化基因組測序等手段獲得部分基因組片段序列,用于SSR引物的設(shè)計。另外,還可以根據(jù)近似物種已開發(fā)的SSR引物來篩選目標(biāo)物種的多態(tài)性SSR引物。本研究中,由于天冬分子生物學(xué)研究起步較晚,沒有參考基因組的數(shù)據(jù),無法直接開發(fā)SSR引物,筆者通過查閱相關(guān)文獻(xiàn),根據(jù)Manish Kapoor等[19]在天門冬屬植物研究中采用的24對SSR引物,篩選出8對多態(tài)性SSR引物用于天冬種質(zhì)資源遺傳多樣性研究,取得了較好的效果。

所篩選的8對SSR引物中,其中5對的PIC值高于0.6,表明它們在本試驗材料中有很好的多樣性,與實際的結(jié)果相符。這個結(jié)果很好地驗證了Caruso等[22]、Li等[23]、斯欽畢力格和包文泉[24]、白冬梅等[25]通過已知近緣物種開發(fā)SSR引物的可行性。

熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)以其準(zhǔn)確度高、易于自動化檢測的特點,已被廣泛應(yīng)用于許多物種的遺傳多樣性研究中。如何準(zhǔn)確地將不同批次、不同膠塊的數(shù)據(jù)整合在一起進(jìn)行比較分析,一直是SSR標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法的一個難題。在SSR標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測過程中,雖然每塊膠上都設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)帶型對照,待檢樣品的等位基因類型可以通過與標(biāo)準(zhǔn)帶型對照比較確定的辦法加以解決,但聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率有限,當(dāng)待檢樣品在凝膠泳道上的位置與標(biāo)準(zhǔn)帶型對照較遠(yuǎn),且標(biāo)準(zhǔn)帶型對照相鄰等位基因片段差異較小時,待檢樣品的等位基因類型難以確定,對數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性有很大的影響。而SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測方法,則用內(nèi)標(biāo)代替標(biāo)準(zhǔn)帶型對照,依據(jù)待檢樣品目標(biāo)峰的位置,與同一毛細(xì)管泳道的內(nèi)標(biāo)比較,直接讀出目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小。與常規(guī)的凝膠電泳檢測方法相比,熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測數(shù)據(jù)顯然更為精確,同時很好地解決了大規(guī)模不同批次數(shù)據(jù)有效整合和準(zhǔn)確比較的問題?；跓晒鈽?biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)自身的特性,多年多點的數(shù)據(jù)可有效整合在一起,并可以準(zhǔn)確比較。因此,熒光SSR毛細(xì)管電泳為今后天冬的跨年份、跨地域的協(xié)作研究提供了技術(shù)保障。

25份天冬種質(zhì)資源的聚類結(jié)果與真實的分布有較大的出入,其地理來源出現(xiàn)明顯的分化。自育品種“桂冬1號”與BS-1(不結(jié)薯)間的遺傳關(guān)系最近,其遺傳相似系數(shù)達(dá)0.80,遺傳距離僅為0.22。種植在里建基地的野2-1(雌株)和野2-1(雄株)是從生物所大棚野2-1這個種質(zhì)資源的種子實生苗人工選擇的后代,可能是人工選擇的緣故,其與原種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)分別為0.84,0.80,相應(yīng)的遺傳距離分別為0.18,0.22。而野2-1(雌株)和野2-1(雄株)也由于人工選擇的原因發(fā)生較大的遺傳分化,雖然聚類到一個大群但變異稍大,兩者的遺傳相似系數(shù)為0.696,遺傳距離則為0.362。南普-12、NM和玉普-1三個樣品的遺傳相似系數(shù)為1,遺傳距離為0,這就表明三者在所篩選的8對引物中的多樣性表現(xiàn)完全相同。要想把這3個種質(zhì)資源完全區(qū)分開,需要開發(fā)更多的SSR引物。在排除人為操作失誤(取樣混雜)的情況下,最可能的原因就是天冬在人工栽培的過程中由于三地間長期的相互引種造成了種質(zhì)資源的混亂。值得進(jìn)一步關(guān)注的是,來自云南的17號種質(zhì)表型上與其他種質(zhì)有較大的差異,且在本試驗中8個多態(tài)性標(biāo)記的電泳結(jié)果中也表現(xiàn)出極高的多態(tài)性,但在聚類分析中卻不能與其他25個種質(zhì)中的任何一個聚類在一起,具體原因有待進(jìn)一步研究。