劉玲玲, 李政升, 劉 穎

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海省高寒草地適應(yīng)性管理重點實驗室/青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點實驗室, 西寧 810016)

青海省是我國生態(tài)大省,亦是國家首批生態(tài)文明先行區(qū)試點省份,但隨著全球氣候變化、降水錯位、草原退化加劇等問題的出現(xiàn),對青海省內(nèi)生態(tài)發(fā)展提出了重大挑戰(zhàn)[1]。眾多研究者在生態(tài)恢復(fù)發(fā)展重點及建議中提及優(yōu)質(zhì)鄉(xiāng)土草種的馴化選育是當(dāng)前工作中的重難點,也是目前青海省生態(tài)發(fā)展及退化恢復(fù)工作的必經(jīng)之路[2-3]。

地梢瓜(Cynanchumthesioides)、鵝絨藤(Cynanchumchinense)和華北白前(Cynanchumhancockianum)均為蘿藦科鵝絨藤屬植物,廣泛分布于青海、內(nèi)蒙古、山西、陜西、甘肅等半干旱地區(qū)。地梢瓜為飼藥食兼用的多年生直立半灌木,多生長于山坡、沙丘或干旱山谷、荒地等處[4]。鵝絨藤為多年生纏繞草本植物,多生長于灌木叢、河畔或田梗邊[5]。華北白前為多年生直立草本植物,生長于山坡、草甸、溝谷及林緣等地。地梢瓜、鵝絨藤和華北白前以其廣泛的適應(yīng)性和強(qiáng)勁的生命力為生態(tài)恢復(fù)中優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的馴化培育提供了選擇,但目前對這3種植物的研究主要集中在化學(xué)成分提取和藥理活性探索方面[6-8],對其原生生態(tài)適應(yīng)性和栽培技術(shù)的相關(guān)研究尚屬空白,這直接或間接限制了3種優(yōu)質(zhì)植物資源巨大生態(tài)價值的挖掘和利用。但野生種質(zhì)由于種種原因,其自然萌發(fā)率通常較低,而優(yōu)質(zhì)草種的成功建植取決于快速整齊的種子萌發(fā)[9]。故此,對上述3種優(yōu)質(zhì)鵝絨藤屬植物資源進(jìn)行萌發(fā)測定及引發(fā)劑篩選等基礎(chǔ)性研究工作迫在眉睫。

種子萌發(fā)及幼苗生長是植物生命周期的第一階段,也是對外界環(huán)境最為敏感的階段之一[10]。在生產(chǎn)中,種子萌發(fā)和幼苗生長受到多種環(huán)境條件制約,干旱是主要制約因素之一。在此階段,干旱脅迫會通過產(chǎn)生低滲透勢阻止植物對水分的吸收從而抑制種子萌發(fā)和幼苗生長,進(jìn)而使植物的整個生命周期受到影響,最終導(dǎo)致低產(chǎn)和劣質(zhì)[11]。因此,技術(shù)性解決干旱造成的種子萌發(fā)受限是亟待探索的問題。

種子引發(fā)已被證實是一種可行的播前種子處理技術(shù),可改善不利環(huán)境條件下種子萌發(fā)和幼苗生長性能[12-13]。引發(fā)的種子在生理上接近萌發(fā)階段,其種子活力、種苗外觀形態(tài)和種苗質(zhì)量都有所提高,從而彌補(bǔ)了不同種子由于自身差異而導(dǎo)致的萌發(fā)不整齊和生長不一致的缺陷[14]。目前,多種引發(fā)劑已應(yīng)用于實際生產(chǎn)中,其中以H2O、KMnO4、H3BO3、H2O2、PEG等引發(fā)劑應(yīng)用最為廣泛[15]。此外,引發(fā)劑的引發(fā)效果亦受到植物種類的影響,相同引發(fā)劑在不同植物中的引發(fā)效應(yīng)因植物種類的不同而有差異[16]。鑒于此,本研究以3種鵝絨藤屬植物野生種子為供試材料,經(jīng)過引發(fā)處理篩選能優(yōu)化其萌發(fā)的引發(fā)劑,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行干旱逆境下的引發(fā)檢驗,以期為后續(xù)地梢瓜、鵝絨藤和華北白前的人工引種栽培研究及實踐生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為野生地梢瓜、鵝絨藤和華北白前種子,均采自青海省海南藏族自治州貴德國家地質(zhì)公園月亮灣內(nèi)(東經(jīng)101°53′,北緯36°09′,海拔2 050 m),該地屬高原大陸性氣候,無霜期258 d,年降水量400 mm左右,蒸發(fā)量1 500 mm左右,年平均氣溫7.2 ℃,年平均日照時數(shù)2 928 h,為典型的黃土高原與青藏高原過渡溝壑縱橫干旱區(qū)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗分為兩個階段,第一階段為3種鵝絨藤屬植物有效引發(fā)劑篩選試驗。選用生產(chǎn)上常用的5種引發(fā)劑為試驗因素(表1),以未處理過的干種子作為對照,篩選3種引發(fā)效果最優(yōu)的引發(fā)劑作為第二階段的引發(fā)因素。第二階段為引發(fā)劑處理后種子對干旱脅迫的響應(yīng)效果研究。設(shè)引發(fā)劑和干旱兩個處理因素,其中引發(fā)劑為第一階段篩選出的3種引發(fā)效果最好的溶液,干旱設(shè)兩個水平,即N0和N1,用PEG-6000模擬(表1)。

1.3 試驗方法

試驗采用紙上發(fā)芽法,選取籽粒飽滿,大小均勻一致、無損傷的野生地梢瓜、鵝絨藤和華北白前種子,用5%次氯酸鈉溶液消毒15 min,用蒸餾水沖洗表面殘留化學(xué)物質(zhì)后吸干表面水分,將其放入盛有不同引發(fā)劑的小燒杯中,浸泡24 h后,用蒸餾水反復(fù)漂洗種子4～5次,吸干表面水分。在每個鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中均勻鋪放50粒處理過的種子,加水或15% PEG(第一階段加水,第二階段加15% PEG)7 mL,并做好標(biāo)記,每個處理3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱(MGC-250,上海)中,萌發(fā)條件設(shè)為25 ℃/20 ℃(晝溫/夜溫),光周期12 h/12 h(光照/黑暗),光照強(qiáng)度1 250 lx。試驗期間每天補(bǔ)充適量水分(或15% PEG),并觀察、記錄發(fā)芽種子數(shù)量。試驗以幼根伸出種皮0.2 cm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 測定指標(biāo)

試驗結(jié)束后,從各處理的培養(yǎng)皿中選取10株具有代表性且生長一致的植株,用電子游標(biāo)卡尺測量根長和芽長,隨后計算各處理下萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間和萌發(fā)整齊性指數(shù)[17-19],計算公式如下:

萌發(fā)率/%=(7 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

(1)

發(fā)芽勢/%=(5 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

(2)

(3)

活力指數(shù)=GI×S

(4)

(5)

(6)

式中,GI為發(fā)芽指數(shù),Ni表示在第i天萌發(fā)的種子數(shù)量,Ti表示從試驗開始到第i天的時間,S為平均根長+平均芽長。

采用隸屬函數(shù)法對幾種引發(fā)劑引發(fā)效果進(jìn)行綜合評價[20-21]。當(dāng)測定指標(biāo)為正向指標(biāo)時,采用公式(7),當(dāng)測定指標(biāo)為負(fù)向指標(biāo)時,采用公式(8),隸屬度的計算采用公式(9),代表種子萌發(fā)參數(shù)的平均隸屬值,其值越大代表該處理下引發(fā)效果越好。

X(μi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)

(7)

X(μi)=1-(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)

(8)

隸屬度=∑(X(μ1)+X(μ2)+…+X(μn))/n

(9)

式中:Xi為鵝絨藤屬植物中i指標(biāo)的測定值;i=1,2,3…n,Ximin為該指標(biāo)測定值的最小值;Ximax為該指標(biāo)測定值的最大值,n為測定指標(biāo)數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0、Microsoft Excel2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析,采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性多重比較,采用Origin Pro2018軟件繪圖。每次試驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,差異顯著性水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種鵝絨藤屬植物有效引發(fā)劑篩選

2.1.1不同引發(fā)劑對3種鵝絨藤屬植物萌發(fā)的影響

不同引發(fā)劑處理后,種子萌發(fā)效果不同(表2)。地梢瓜種子的自然萌發(fā)率僅為52.67%,除S3外,其余引發(fā)處理均顯著提高其萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),其中S4的引發(fā)效果最好,與S0相比,可使萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別上升77.20%,101.48%,111.36%和206.28%,S1、S2、S3、S4處理能顯著縮短地梢瓜種子的平均發(fā)芽時間,而S5處理能顯著提高其萌發(fā)整齊性指數(shù)。鵝絨藤種子的自然萌發(fā)率為93.33%,S3處理對其萌發(fā)有顯著抑制作用,而S2、S4、S5處理對其萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用,經(jīng)過S2、S4和S5的引發(fā)處理,鵝絨藤種子的萌發(fā)率可達(dá)100%,尤其在S4處理下,其平均發(fā)芽時間縮短了1.07 d。華北白前種子的自然發(fā)芽率為90.00%,S3處理顯著降低其萌發(fā)率,但對其發(fā)芽勢沒有顯著影響,所有引發(fā)處理均顯著提高了其發(fā)芽指數(shù),縮短了平均發(fā)芽時間,S2和S5處理顯著降低了種子的活力指數(shù),但只有S2處理后種子的萌發(fā)整齊性指數(shù)顯著降低。

表2 引發(fā)劑處理后3種鵝絨藤屬植物的萌發(fā)參數(shù)

2.1.2不同引發(fā)劑對3種鵝絨藤屬植物根長和芽長的影響

不同引發(fā)劑處理對種子萌發(fā)后根長和芽長的影響不同,不同種子對同一引發(fā)劑的響應(yīng)效果也不同(圖1)。于地梢瓜種子而言,S4處理能顯著促進(jìn)芽的生長,與對照相比,可使芽長增加43.19%,而S2處理能顯著促進(jìn)根的生長,可使根長增加132.01%,S3處理則對芽和根的生長均有顯著抑制作用,根長和芽長分別下降38.79%和39.07%,其余處理與對照之間差異不顯著。S1和S3處理對鵝絨藤種子萌發(fā)后芽和根的抑制作用顯著,S4處理既有利于芽的生長,又對根的生長有顯著促進(jìn)作用,另外,S2處理也可顯著促進(jìn)鵝絨藤根的生長。于華北白前而言,S1處理最有利于芽和根的生長,S3和S4處理對華北白前根的影響不顯著,但S3處理可顯著促進(jìn)其芽的生長,S5處理對芽和根的生長均有顯著抑制作用。

圖1 引發(fā)劑處理對根長和芽長的影響

2.1.3隸屬函數(shù)綜合評價

對地梢瓜、鵝絨藤和華北白前的萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間、萌發(fā)整齊性指數(shù)6項萌發(fā)指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評價,發(fā)現(xiàn)不同植物對引發(fā)劑的響應(yīng)效果不同(表3)。對地梢瓜的引發(fā)效果S4>S5>S1>S2>S0>S3,對鵝絨藤的引發(fā)效果S4>S2>S5>S1>S0>S3,對華北白前的引發(fā)效果S1>S4>S5>S0>S3>S2?？梢钥闯?對地梢瓜和華北白前引發(fā)效果最好的3種引發(fā)劑分別是H2O、0.3% H2O2和5% PEG,對鵝絨藤引發(fā)效果最好的3種引發(fā)劑分別是0.5% KMnO4、0.3% H2O2和5%PEG,將其分別作為后續(xù)3種鵝絨藤屬植物干旱脅迫試驗的引發(fā)劑。

表3 3種鵝絨藤屬植物萌發(fā)的隸屬函數(shù)綜合評價

2.2 3種鵝絨藤屬植物種子引發(fā)后對干旱脅迫的響應(yīng)效果

2.2.1干旱脅迫下引發(fā)劑對3種鵝絨藤屬植物萌發(fā)的影響

干旱脅迫影響種子萌發(fā),引發(fā)劑處理可改善干旱條件下種子萌發(fā)狀況(表4)。干旱脅迫對地梢瓜的萌發(fā)率和平均發(fā)芽時間沒有顯著影響,說明地梢瓜種子在干旱脅迫下能正常萌發(fā)。S1、S4和S5處理能顯著提高干旱脅迫下地梢瓜萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),且S4處理能顯著縮短其平均發(fā)芽時間并提高萌發(fā)整齊性指數(shù)。干旱脅迫對鵝絨藤和華北白前的萌發(fā)均產(chǎn)生顯著影響,具體表現(xiàn)在萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等萌發(fā)參數(shù)的降低,而引發(fā)劑處理可改善鵝絨藤和華北白前在干旱脅迫下的種子萌發(fā)受限情況,S2、S4和S5處理均能提高干旱脅迫下鵝絨藤的萌發(fā)率和發(fā)芽勢,縮短平均發(fā)芽時間,但S5處理的效果未達(dá)顯著水平。S1和S4能顯著改善華北白前在干旱逆境下的萌發(fā)狀況,使之與未引發(fā)相比,其萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著上升,平均發(fā)芽時間明顯縮短,而S5則對其萌發(fā)產(chǎn)生不利影響,限制種子萌發(fā)生長。

表4 干旱脅迫下3種鵝絨藤屬植物種子引發(fā)后的萌發(fā)參數(shù)

2.2.2干旱脅迫下引發(fā)劑對3種鵝絨藤屬植物根長和芽長的影響

干旱脅迫對3種鵝絨藤屬植物根和芽的生長均有顯著抑制作用,而適當(dāng)?shù)囊l(fā)劑處理可在一定程度上緩解這種抑制(圖2)。干旱脅迫下,地梢瓜、鵝絨藤和華北白前的根長分別下降32.36%,26.60%和73.52%,芽長分別下降46.93%,32.84%和75.50%。S1、S4和S5處理均可緩解干旱脅迫對地梢瓜根和芽生長的抑制,交互作用,其他同理。

圖2 干旱脅迫下引發(fā)劑處理對根長和芽長的影響

并且S1和S4的緩解效果達(dá)到顯著水平。S2和S4處理可緩解干旱脅迫對鵝絨藤根和芽生長的抑制作用,且S4的緩解效果達(dá)到顯著水平,能使鵝絨藤的根長和芽長分別增加25.05%和51.00%,而S5處理則抑制了其根和芽的生長,且對芽的抑制作用顯著。S1和S4處理均能促進(jìn)干旱脅迫下華北白前根和芽的生長,并均達(dá)到顯著水平,S5則抑制了根和芽的生長,但與對照(S0N1)相比抑制作用不顯著。

2.3 物種、干旱脅迫、引發(fā)劑及其互作效應(yīng)對種子萌發(fā)的影響

三因素方差分析表明,物種、干旱脅迫、引發(fā)劑及其互作效應(yīng)對種子萌發(fā)和幼苗生長均有影響(表5)。物種、干旱脅迫和引發(fā)劑三因素交互作用對3種鵝絨藤屬植物萌發(fā)率和萌發(fā)整齊性指數(shù)的影響不顯著,其余因素及其交互作用對萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間和萌發(fā)整齊性指數(shù)的影響均達(dá)到極顯著水平。

表5 物種、干旱脅迫、引發(fā)劑及其互作效應(yīng)對種子萌發(fā)的影響

3 討 論

種子引發(fā)主要是通過控制種子緩慢吸水,激活種子生理生化代謝和修復(fù)作用,使種子的細(xì)胞膜、細(xì)胞器酶活化處于預(yù)發(fā)芽狀態(tài)[22]。種子引發(fā)可縮短種子萌發(fā)時間,提高抗氧化酶活性,阻止或減少活性氧的不利影響,進(jìn)而促進(jìn)植物生長[23]。本研究發(fā)現(xiàn),不同引發(fā)劑對地梢瓜種子萌發(fā)的促進(jìn)效果為S4>S5>S1>S2>S0>S3,對鵝絨藤種子的引發(fā)效果S4>S2>S5>S1>S0>S3,對華北白前種子的引發(fā)效果S1>S4>S5>S0>S3>S2?？梢钥闯?0.2 g/L H3BO3處理抑制了3種鵝絨藤屬植物的萌發(fā)生長,而王少平等[24]研究表明,0.2 g/L H3BO3對蜀葵(Althaearosea(Linn.) Cavan.)種子萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用,這與本研究的結(jié)果相反,說明不同植物對同一引發(fā)劑的響應(yīng)效果不同,0.2 g/L H3BO3并不適合作為地梢瓜、鵝絨藤和華北白前的引發(fā)劑使用。0.5% KMnO4對華北白前有負(fù)向引發(fā)作用,但能顯著促進(jìn)地梢瓜和鵝絨藤的萌發(fā),這也說明了同一引發(fā)劑對不同植物的引發(fā)效果存在差異。H2O作為引發(fā)劑在生產(chǎn)中使用較廣,均能提高3種鵝絨藤屬植物萌發(fā)率和活力指數(shù),縮短發(fā)芽時間,是一種低耗有效的引發(fā)劑。5% PEG可顯著促進(jìn)3種植物種子萌發(fā),肖爽等[25]的研究也得出了這一結(jié)論,PEG引發(fā)可增強(qiáng)種子內(nèi)部抗氧化酶活性,降低脂質(zhì)過氧化水平,進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā);但5% PEG對華北白前根和芽的生長有顯著抑制作用,可能是華北白前的干旱耐受性較差,雖然PEG引發(fā)激活了種子生理生化代謝過程,提高了萌發(fā)率,縮短了發(fā)芽時間,但抑制了種子活力,從而減慢了生長發(fā)育的速度。0.3% H2O2對3種鵝絨藤屬植物均有很好的引發(fā)效果,有研究推測H2O2作為信號分子可通過增強(qiáng)α-淀粉酶活性來改善種子萌發(fā)和活力[26]。

干旱是限制植物生長發(fā)育的主要非生物脅迫之一,缺水會增加細(xì)胞膜的通透性,引起K+外流,擾亂植物代謝,從而影響植物生長[27]。關(guān)正等[28]對苘麻的研究表明,低濃度干旱脅迫能促進(jìn)種子萌發(fā),而高濃度脅迫則會抑制或完全抑制萌發(fā),原因可能是當(dāng)水分充足時,種子會通過“積極回應(yīng)”策略來促進(jìn)自身萌發(fā),相反種子則會通過“規(guī)避”策略來推遲自身萌發(fā)。本研究表明,15% PEG干旱脅迫顯著抑制了鵝絨藤和華北白前種子的萌發(fā),具體表現(xiàn)在萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等萌發(fā)參數(shù)的降低。15% PEG干旱脅迫對地梢瓜萌發(fā)率、平均發(fā)芽時間和萌發(fā)整齊性指數(shù)的影響不顯著,但其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯受到抑制,說明地梢瓜對干旱逆境具有較強(qiáng)抵抗能力,在15% PEG干旱逆境下可正常萌發(fā),但種子活力受到抑制,影響其后期生長。另外,干旱脅迫下3種鵝絨藤屬植物根和芽的生長均受到顯著抑制,可能是干旱脅迫減少了植物對水分的利用,抑制了根和芽頂端分生組織細(xì)胞的生長和分裂所致。

適宜的引發(fā)劑處理可改善植物在逆境脅迫下的生長狀況[29-30]。而種子引發(fā)可通過調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)來緩解干旱誘導(dǎo)的氧化損傷。Mazhar等[31]研究表明,SA、AsA和NaCl引發(fā)小麥種子,可通過上調(diào)抗氧化防御和乙二醛酶系統(tǒng)來提高小麥種子干旱耐受性,從而保證更好的幼苗建成。Akash等[32]研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖處理可改善綠豆幼苗的基本形態(tài)和生理特性,從而緩解不同水勢水平對綠豆種子的不利影響。本研究發(fā)現(xiàn),5% PEG處理對干旱脅迫下華北白前種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生抑制作用,對鵝絨藤的萌發(fā)無顯著影響,但抑制了其根和芽的生長,可能是干旱疊加超出了植物耐受范圍,從而不能有效發(fā)揮其引發(fā)價值。其余引發(fā)劑均能在不同程度上緩解干旱脅迫對3種鵝絨藤屬植物種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制,其中以0.3% H2O2的緩解效果最佳。H2O2可以通過激活干旱脅迫下植物體內(nèi)的細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)來抵制過多ROS對機(jī)體的傷害[33],但H2O2具有濃度效應(yīng),低濃度會促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長,高濃度H2O2浸種會腐蝕種皮,減弱其通透性,最終抑制種子萌發(fā)和植株生長[34]。故此,在生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)植物種類選擇適宜引發(fā)濃度,發(fā)揮其最大引發(fā)價值。由于本試驗于室內(nèi)完成,與自然生境存在較大差異,故引發(fā)劑對干旱逆境下野外栽培植物生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響還需深入研究。

4 結(jié) 論

適宜的引發(fā)劑能顯著促進(jìn)3種鵝絨藤屬植物種子萌發(fā)和幼苗生長,對地梢瓜和華北白前種子萌發(fā)促進(jìn)效應(yīng)最優(yōu)的3種引發(fā)劑分別為H2O、0.3% H2O2和5% PEG,于鵝絨藤而言,最優(yōu)的引發(fā)劑為0.5% KMnO4、0.3% H2O2和5% PEG。此外,適宜的引發(fā)劑處理能緩解干旱脅迫所導(dǎo)致的種子萌發(fā)受限,其中以0.3% H2O2的效果最佳,可將其作為實踐生產(chǎn)中的有效引發(fā)劑,具有廣闊應(yīng)用前景。