舒啟瓊, 羅小波, 李 飛, 羅 充, 馮文豪, 陳明俊, 曹貞菊

(1.貴州省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所/國家馬鈴薯改良中心貴州分中心/貴州省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心, 貴陽 550006;2. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 貴陽 550001; 3.貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站, 貴陽 550001)

低溫對植物造成的傷害分為冷害(Chilling injury)和凍害(Freezing injury)。冷害是指0～10 ℃溫度對植物造成的傷害,植物出現(xiàn)暫時的新陳代謝功能紊亂和活性氧等有毒物質(zhì)的積累,但能夠在環(huán)境適宜的情況下恢復(fù)。凍害則是指0 ℃以下低溫對植物造成的傷害,凍害使植物體內(nèi)的水形成冰晶,破壞細胞結(jié)構(gòu),同時造成細胞內(nèi)容物濃度增高而引起有毒物質(zhì)的積累,造成不可恢復(fù)的傷害[1]。在長期的自然選擇中,植物為應(yīng)對低溫脅迫而進化出了非馴化抗寒能力(Non-acclinmated freezing tolerance,NFT)和馴化抗寒能力(Acclimation capacity,ACC)[2]。植物不經(jīng)過低溫馴化就具有抗低溫霜凍能力稱為NFT,經(jīng)過一定周期冷馴化而具有的抗低溫霜凍的能力稱為ACC。在植物抵御低溫脅迫的過程中,伴隨著植物膜中的分子和生理修飾,胞漿Ca2+的積累,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的增加和ROS清除系統(tǒng)的激活,抗冷相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子表達的變化,蛋白質(zhì)和糖合成的改變,脯氨酸的積累,以及影響光合作用的生化變化等[1,3]。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)一年生草本植物,明代傳入中國,而后被廣泛種植,是食用國家最多的作物,也是全球四大經(jīng)濟作物之一,營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強和生育期短等優(yōu)點使得馬鈴薯的需求量逐年增高,中國是世界當(dāng)前馬鈴薯種植第一大國[5-6]。馬鈴薯富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等,具有糧菜兼用和綜合加工等廣泛用途[4]。馬鈴薯是喜冷涼但不耐低溫作物,中國馬鈴薯主產(chǎn)地北方一作區(qū)、中原二作區(qū)、西南混作區(qū)和南方冬作區(qū)幾乎都會遭受低溫霜凍災(zāi)害。2008年的冰雪災(zāi)害使得中國南方各地的馬鈴薯受災(zāi)面積達40.93萬hm2,造成經(jīng)濟損失高達10億元[7]。2016年江西鄱陽湖地區(qū)的寒潮天氣導(dǎo)致當(dāng)?shù)伛R鈴薯幼苗凍死率高達75%～95%,造成當(dāng)?shù)伛R鈴薯嚴重減產(chǎn)[8]。2018年廣西玉林市馬鈴薯因遭受低溫凍害無法達到商品薯標(biāo)準(100 g以上),造成嚴重經(jīng)濟損失[9]。低溫霜凍制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,鑒定篩選較為抗寒的馬鈴薯材料,改良馬鈴薯耐凍性尤為重要。

植物抗寒性表型鑒定的方法有露地栽培鑒評法、寒凍災(zāi)害調(diào)查法、人工模擬低溫法和數(shù)學(xué)建模預(yù)測法、電解質(zhì)滲出率法等[10]。馬鈴薯抗寒性鑒定的方法主要有田間自然霜凍法、生理生化指標(biāo)測定法、電解質(zhì)滲漏法。電解質(zhì)滲漏法結(jié)合Logistic方程以及隸屬函數(shù)和聚類分析法被廣泛應(yīng)用于植物抗寒性鑒定,在馬鈴薯抗寒性鑒定中被認為是較為可靠的方法[10-12]。本研究采用電導(dǎo)率滲漏法對82份馬鈴薯材料進行抗寒性鑒定,評價并篩選較為抗寒的馬鈴薯材料,以期為貴州馬鈴薯生產(chǎn)、品種推廣以及抗寒育種親本的選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所選用的材料均來源于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所,包括2份野生種、66份普通栽培種和14份后代品系。于2020年4月種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所大棚,大棚室溫20～25 ℃。挑選薯型大小均勻(50 g左右)、健康無病薯塊播種于10 cm×10 cm的塑料缽內(nèi)(V泥炭土∶V蛭石=1∶1),每份材料播種7盆。出苗后生長40 d,取大小一致的功能葉片進行電導(dǎo)率測定。

1.2 實驗方法

1.2.1低溫處理及電導(dǎo)率測定

馬鈴薯抗寒性鑒定參照李飛[13]、鄧高峰[14]的方法,略有改動。

實驗儀器:取樣袋、剪刀、冰盒、低溫水浴鍋、試管(25 cm×15 cm)、試管架、高壓蒸汽滅菌鍋、電導(dǎo)率儀、刀片、鑷子、加樣器等。

取樣:實驗設(shè)置5個溫度點(0 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-6 ℃、-7 ℃),每個溫度點設(shè)置3個重復(fù)。按照低溫水浴鍋的容量每次最宜處理15個材料,每個材料應(yīng)選擇大小、葉齡相似的功能葉片,每個材料可多取幾片備用,不要剪傷葉片,取完后放入冰盒,快速進行下一步實驗處理。

樣品清洗:用蒸餾水將葉片清洗干凈,后置于吸水紙上將水分吸干。

樣品放置:用鑷子輕輕將葉片置于試管底部,葉柄面朝下,使葉背面貼住試管壁,然后將試管依次放置于標(biāo)記好處理溫度的試管架。

低溫處理:低溫水浴鍋液體媒介為蒸餾水和酒精,0 ℃的試管架直接置于冰上并放在4 ℃冰箱過夜,其余的都放置于低溫水浴鍋,待水浴鍋顯示溫度降到0 ℃時開始計時,30 min后調(diào)節(jié)溫度為-0.5 ℃再保持30 min,溫度從-0.5 ℃降到-1 ℃并保持30 min后在每只試管中加入小塊冰,再保持30 min后將溫度降為-1.5 ℃,保持1 h,后降溫至-2 ℃保持30 min,取樣。依次按0.5 ℃/30 min速度降溫,溫度達到目標(biāo)溫度時,取樣,盡快置于冰上,放入4 ℃冰箱中解凍過夜。

電導(dǎo)率測定:將完全解凍的樣品用鋒利的刀片切成5 mm的小條裝入試管,同時加入25 mL蒸餾水。用真空泵以0.1 MPa的真空度抽氣6 min,置于搖床中以220 r/min的速度振動1 h,靜置后用電導(dǎo)率儀測定煮沸前電導(dǎo)率R1,然后將每個試管蓋上蓋子,放置于高壓蒸汽滅菌鍋中煮沸10 min,冷卻至室溫測煮沸后電導(dǎo)率R2。計算電解質(zhì)滲出率。

電解質(zhì)滲出率/%=(R1/R2)×100%。

1.2.2LT50值的計算

將每個溫度點對應(yīng)的電解質(zhì)滲出率3次重復(fù)結(jié)果的平均值結(jié)合Logistic方程計算樣品半致死溫度(LT50)。

Logistic方程y=1/[1+eB(c-x)],式中:y、x分別表示相對電導(dǎo)率和處理溫度;B、C分別表示方程拐點斜率和樣品LT50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖采用Excel2019軟件,抗寒性Logistic回歸模型建立采用DPS v7.5軟件,聚類分析采用統(tǒng)計分析軟件SPSS25.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫后馬鈴薯電導(dǎo)率變化情況

抗寒性差的馬鈴薯葉片在低溫處理后變癱軟,葉片顏色逐漸變黑。以Cip43和云薯902號的離體葉片為對照(表1),經(jīng)低溫梯度處理后對應(yīng)的電導(dǎo)率擬合Logistic方程為代表,使植物電導(dǎo)率達到50%時的低溫處理溫度即為該材料的半致死溫度(LT50)。-4 ℃低溫處理Cip43,電解質(zhì)滲出率為33.78%,電解質(zhì)滲出率還未達到50%,顯現(xiàn)出較強的抗寒能力。云薯902號經(jīng)低溫處理到-2 ℃時,電解質(zhì)滲出率為53.98%,說明其半致死溫度大于-2 ℃,抗寒性較差。植物電解質(zhì)滲出率結(jié)合Logistic方程擬合計算得出的半致死溫度能較為準確地反映植物抗寒性。

表1 Cip43和云薯902號電解質(zhì)滲出率

相對電導(dǎo)率隨處理溫度變化呈“S”型曲線變化,較直觀地反映了植物抗寒能力[13]。Cip43與云薯902號在經(jīng)低溫處理后,相對電導(dǎo)率與處理溫度呈“S”型曲線變化(圖1),電導(dǎo)率達50%時,經(jīng)Logistic方程擬合計算得出Cip43和云薯902號半致死溫度分別為-4.6 ℃和-1.6 ℃。Cip43半致死溫度比云薯902號低3 ℃,抵御低溫脅迫的能力顯著較強。

圖1 低溫處理Cip43和云薯902號離體葉片后電導(dǎo)率擬合Logistic回歸方程曲線

2.2 馬鈴薯電導(dǎo)率Logistic回歸方程及抗寒性鑒定

分別以Cip43和云薯902號作抗寒性對照,參照李華偉等[15]、魏亮等[16]的分析方法進行抗寒性鑒定。對82份馬鈴薯材料進行低溫處理,測定電導(dǎo)率并進行Logistic線性回歸分析,建立Logistic回歸模型求出方程和LT50,而后進行抗寒性鑒定,結(jié)果見表2。LT50值與抗寒性呈負相關(guān),LT50值越小則抗寒性越強。Cip43擬合方程為:y=106.653/[1+e(3.463-0.749x)],LT50值為-4.6 ℃,R2=0.974,擬合度達極顯著水平。云薯902號擬合方程為y=78.296/[1+e(1.174-0.879x)],LT50值為-1.6 ℃,R2=0.986,達極顯著水平。

表2 82份馬鈴薯材料電導(dǎo)率擬合Logistic回歸方程及半致死溫度

根據(jù)電導(dǎo)率與Logistic回歸方程擬合求出的半致死溫度(LT50)對82份馬鈴薯材料進行抗寒性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),82份材料的半致死溫度為-4.8 ℃～-1.6 ℃,其中云薯902號、宣薯6號和Q5等11份馬鈴薯材料LT50>-2.5 ℃,占比13.41%,抗寒性最差;LT50在-4.0 ℃～-2.5 ℃之間的材料有64份,占比78.05%,抗寒性介于抗寒和霜凍敏感之間;Cip43、大同20和BF004等7份馬鈴薯材料LT50≤-4.0 ℃,占比8.53%,抗寒能力強,其中大同20抗寒性最強,半致死溫度達-4.8 ℃(圖2)。

圖2 82份馬鈴薯材料抗寒性分布

2.3 82份馬鈴薯材料抗寒性聚類分析

根據(jù)表2對82份馬鈴薯材料抗寒性進行聚類分析(圖3),在平均歐氏距離為18時,可將82份材料分為三類:第一類為抗寒能力較強的大同20、Cip43等7份材料,LT50值在-4.0 ℃～-4.8 ℃之間,平均值為-4.3 ℃,在82份抗寒性材料中屬于強抗寒性品種;第二類材料抗寒性處于中間位置,LT50值在-4.4 ℃～-2.5 ℃之間,包括宣薯2號、中薯5號、東農(nóng)310和費烏瑞它等64份材料;第三類材料屬于低溫敏感材料,半致死溫度均高于-2.5 ℃,其中抗寒性最差的為云薯902、Q5和Cph12。

圖3 82份馬鈴薯材料抗寒性聚類分析

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯作為世界第四大糧食作物,對促進地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展、消除地區(qū)貧困以及保障糧食安全起著重要作用[17]。我國作為馬鈴薯生產(chǎn)第一大國,幾乎每個種植區(qū)域都存在低溫霜凍脅迫的風(fēng)險。低溫霜凍輕則影響馬鈴薯光合作用以及生理生化功能和塊莖的形成,重則使得馬鈴薯萎蔫甚至死亡,導(dǎo)致減產(chǎn)造成嚴重經(jīng)濟損失。自然界中存在豐富的野生馬鈴薯抗寒資源,已經(jīng)證實,S.commersonii、S.boliviense、S.demissum、S.chomatophilum等35個野生種中均存在抗寒株系[16-17]。目前廣泛種植的馬鈴薯栽培種大部分不具抗寒性,將野生抗寒性資源應(yīng)用于栽培種的選育,對推進馬鈴薯抗寒性育種進程具有重要意義。對現(xiàn)有栽培品種(系)及野生種進行抗寒性鑒定,篩選出優(yōu)質(zhì)抗寒材料,能夠為后續(xù)利用常規(guī)雜交育種及分子技術(shù)育種提供種質(zhì)資源及參考。

馬鈴薯抗寒性研究最常用的方法為田間自然霜凍法和電導(dǎo)率測定法,自然霜凍法最先由Vega和Bamberg[20],趙喜娟等[21]通過對田間自然霜凍后的馬鈴薯植株損傷程度進行評級來直觀評價馬鈴薯抗寒性,依賴于田間自然霜凍天氣,存在一定的限制因素;電導(dǎo)率測定法主要利用離體葉片在室內(nèi)進行實驗,能夠打破自然環(huán)境的限制,其原理是通過測定離體葉片在不同低溫脅迫下的電解質(zhì)滲出率差異來反映葉片受傷程度和抗寒性強弱,當(dāng)葉片電解質(zhì)滲出率達到50%時的溫度即為測定材料的半致死溫度,電導(dǎo)率結(jié)合Logistic方程計算半致死溫度反映植物耐寒性是當(dāng)前最為可靠的抗寒性鑒定方法。

本實驗通過對82份馬鈴薯材料進行電解質(zhì)滲出率測定,并結(jié)合Logistic方程計算半致死溫度,研究表明,馬鈴薯栽培種絕大多數(shù)抗寒性較差,與前人[15-16,22-23]研究結(jié)果一致。聚類分析可將82份馬鈴薯材料分為11份霜凍敏感型材料(抗寒能力最弱)、64份中間型材料和7份較強抗寒型材料。鑒定篩選出抗寒性最強的馬鈴薯材料為大同20和Cip43,可為后續(xù)馬鈴薯抗寒性研究及育種提供參考。