張翼臻 裴大兵

大腸癌是結(jié)直腸癌的統(tǒng)稱,臨床較常見,發(fā)病年齡趨于老年化,且男性患者多發(fā)。大腸癌患者早期一般無明顯癥狀,一般只有消化不良、大便潛血等輕微癥狀,但是隨著病情發(fā)展,患者會出現(xiàn)腸梗阻、發(fā)熱消瘦等較為明顯的全身癥狀［1］,所以,尋找判斷大腸癌分期和預(yù)后的指標,盡早制定治療方案對預(yù)后有積極意義。TILs 與癌細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),是腫瘤環(huán)境參數(shù),可反映大腸癌侵襲能力和預(yù)后［2］。MSI是指腫瘤中DNA 發(fā)生錯配修復(fù)而導(dǎo)致的缺陷［3］,是腫瘤免疫治療的重要生物標志物之一,其檢測近年來備受關(guān)注。故本研究主要對TILs 數(shù)量、MSI 與大腸癌分期及預(yù)后的相關(guān)性進行分析,旨在為臨床治療提供指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018 年1 月～2020 年1 月本院收治的98 例大腸癌患者,納入標準：①符合大腸癌診斷標準［4］；②臨床資料完整,患者或家屬知情同意。排除標準：①處于妊娠/哺乳期者；②合并其他腫瘤者［5］；③有精神疾病者；④近1 個月內(nèi)接受過放化療者。98 例大腸癌患者年齡26～78 歲,平均年齡(57.83±11.23)歲；男52 例,女46 例；其中原發(fā)腫瘤位于結(jié)腸45 例,位于直腸53 例；大腸癌分期：Ⅰ期20 例,Ⅱ期38 例,Ⅲ期21 例,Ⅳ期19 例。根據(jù)腫瘤分期將Ⅰ期和Ⅱ期設(shè)為早期組(58 例),Ⅲ期和Ⅳ期設(shè)為晚期組(40 例)。早期組患者年齡27～75 歲,平均年齡(57.45±11.24)歲；男31 例,女27 例。晚期組患者年齡26～78 歲,平均年齡(58.29±11.37)歲；男21 例,女19 例。早期組和晚期組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。將患者根據(jù)生存情況分為存活組(82 例)和死亡組(16 例)。

1.2 檢測方法 TILs 檢測：采用免疫組織化學(xué)法檢測,將患者腫瘤標本使用甲醛溶液固定,用常規(guī)石蠟包埋,將標本連續(xù)切片(3 μm)后制片,進行檢測。主要流程為二甲苯溶液脫蠟、水化后水洗,進行抗原修復(fù)后孵育沖洗。滴加稀釋的免疫組化染色液,觀察出現(xiàn)終止反應(yīng)后沖洗、復(fù)染,通過鹽酸酒精分化,水洗、沖洗、漂洗后以中性樹膠封片。CD4+和CD8+為細胞膜著色,通過顯微鏡選擇5 個具有代表性區(qū)域在×400 視野下計算CD4+和 CD8+T 淋巴細胞數(shù)量,求平均值。微衛(wèi)星狀態(tài)：采用聚合酶鏈式反應(yīng)檢測MSI,通過比較腫瘤細胞和正常細胞中核苷酸重復(fù)序列的長度來檢測,通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增選擇性微衛(wèi)星以及在自動測序儀上通過毛細管電泳分析片段大小來識別,分為MSI 高(MSI-H,≥30%標記物不穩(wěn)定)、MSI 低(MSI-L,＜30%標記物不穩(wěn)定)和微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS,無標記物不穩(wěn)定)3 種類型。

1.3 治療方法 兩組患者均進行化療,根據(jù)相關(guān)診療指南［6］制定患者的化療方案,包括卡培他濱片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國藥準字H20133365)1250 mg/m2,分早晚兩次飯后30 min 口服,患者服藥2 周后停藥1 周；奧沙利鉑(深圳海王藥業(yè)有限公司,國藥準字H20031048)按照患者體表面積130 mg/m2給藥,加入5%葡萄糖溶液250～500 ml 中靜脈滴注2～6 h,每3 周給藥1 次。同時給予常規(guī)護理干預(yù),嚴密監(jiān)測患者生命體征,并給予抗生素以防感染。

1.4 觀察指標 比較早期組和晚期組TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)(表達陰性數(shù)量),分析TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)與大腸癌分期的相關(guān)性。對患者進行隨訪,自患者入組之日開始隨訪,隨訪截止時間為2023 年1 月,比較存活組和死亡組TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)(表達陰性數(shù)量),分析TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)對大腸癌預(yù)后的評估價值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差 ()表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)與大腸癌分期的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析,TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)在大腸癌患者預(yù)后評估中的價值采用ROC 曲線評估。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期組和晚期組患者TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)比較 早期組患者CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量及微衛(wèi)星表達陰性數(shù)量均高于晚期組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 早期組和晚期組大腸癌TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)比較()

表1 早期組和晚期組大腸癌TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)比較()

注：與晚期組比較,aP＜0.05

2.2 TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)與大腸癌分期的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析顯示：大腸癌分期與CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量及微衛(wèi)星表達陰性數(shù)量呈負相關(guān)(r=-0.451、-0.447,-0.487,P＜0.05)。

2.3 存活組和死亡組患者TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)比較 存活組患者CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量及微衛(wèi)星表達陰性數(shù)量均高于死亡組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 存活組和死亡組患者TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)比較()

表2 存活組和死亡組患者TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)比較()

注：與死亡組比較,aP＜0.05

2.4 TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)與大腸癌預(yù)后的ROC 分析 ROC 結(jié)果顯示,CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量和微衛(wèi)星表達陰性數(shù)量診斷大腸癌預(yù)后的AUC 分別為0.765、0.741 和0.730,此時各水平的截斷值分別為60.240%、9.157%和1.940 個(P＜0.05)。見圖1,表3。

圖1 TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)與大腸癌患者預(yù)后的ROC 曲線圖

表3 TILs 數(shù)量和微衛(wèi)星狀態(tài)對大腸癌患者預(yù)后的ROC 曲線分析

3 討論

流行病學(xué)研究顯示,2020 年全球新發(fā)近200 萬大腸癌患者,發(fā)病率居于惡性腫瘤第3 位,另外生存率較低,5 年內(nèi)死亡率高達50%,占第2 位［7］,目前臨床主要執(zhí)行以手術(shù)切除為主的綜合治療方案,但是制定手術(shù)綜合治療方案前需要明確患者的具體情況,對其治療效果和預(yù)后具有重要意義。TILs 是腫瘤特異性免疫反應(yīng)的一種產(chǎn)物［8］,微衛(wèi)星狀態(tài)檢測已成為大腸癌患者診療的常規(guī)檢查項目［9］。有研究顯示,MSI 臨床檢測對患者病情篩查、治療方案的制定有重要意義［10］。近年來,人們逐漸重視在控制腫瘤進展中宿主免疫系統(tǒng)的重要性,并將新的免疫生物標記物作為其治療效果和預(yù)后的預(yù)測工具。本次研究結(jié)果顯示,Pearson 相關(guān)性分析顯示：大腸癌分期與CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量及微衛(wèi)星表達陰性數(shù)量呈負相關(guān)(r=-0.451、-0.447,-0.487,P＜0.05)。由此提示與MSS 相比,MSI-H的大腸癌患者具有更好的預(yù)后,其預(yù)后的改善可能與宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)更明顯相關(guān)。事實上,淋巴細胞浸潤在MSI 大腸癌患者中也很突出,這是由于錯配修復(fù)蛋白系統(tǒng)的缺失以及隨之產(chǎn)生的幀移突變的積累導(dǎo)致氨基酸序列改變的多肽(新抗原)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,新抗原由人類白細胞抗原Ⅰ(HLAⅠ)類呈現(xiàn)并被細胞毒性T 細胞識別［11］。病情發(fā)展不良的大腸癌患者一般免疫功能較差,CD8+T 細胞浸潤多發(fā)生在癌癥早期,隨著病程的進展會不斷變少,說明這些細胞可以限制腫瘤細胞浸潤生長［12,13］。

本次研究結(jié)果顯示,早期組患者CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量及微衛(wèi)星表達陰性數(shù)量均高于晚期組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。存活組患者CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量及微衛(wèi)星表達陰性數(shù)量均高于死亡組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由此說明微衛(wèi)星不穩(wěn)定患者的預(yù)后情況明顯優(yōu)于微衛(wèi)星穩(wěn)定患者,且患者的病情會隨著微衛(wèi)星高頻數(shù)量的減少而加重。相關(guān)研究顯示［14,15］,MSI 是篩查大腸癌的重要工具,是患者化療和免疫治療效果和預(yù)后結(jié)局的重要標志物,其中MSI-H 腫瘤多發(fā)生于右半結(jié)腸,具有密集的免疫浸潤,與腫瘤發(fā)生具有密切的相關(guān)性。MSI-H 患者淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移幾率均較低,微衛(wèi)星不穩(wěn)定患者的預(yù)后較好,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移較少。

綜上所述,大腸癌患者的TILs 數(shù)量和MSI 會隨著患者的病情加重而減少,且這兩種指標對大腸癌患者的預(yù)后有一定的評估效能,可以為臨床治療提供指導(dǎo)作用。