張佩琛，方 棟，郝海軍

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064； 2.河南大學(xué)，河南 鄭州 450000； 3.上海雷允上藥業(yè)有限公司，上海 201401）

吳茱萸堿是吳茱萸主要活性成分之一，屬于吲哚類生物堿［1］，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用［2-4］，可通過調(diào)節(jié)JAK2/ STAT3 通路蛋白表達(dá)、抑制胃黏膜組織Gli1-Gli2-Sufu 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等機(jī)制來抑制胃潰瘍炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，從而減輕組織損傷［5-7］，有潛力開發(fā)成治療胃潰瘍或胃部疾病的新藥［8］。研究表明，吳茱萸堿在胃部有一定吸收，適合制成胃滯留給藥制劑［9］，但尚未見該成分首關(guān)效應(yīng)的報(bào)道。

胃滯留給藥系統(tǒng)是指口服制劑可長時(shí)間滯留于胃部，從而實(shí)現(xiàn)定位釋藥，可減少藥物損失，有助于提高胃部疾病的治療效果［10-13］。胃漂浮片通過保持自身密度小于胃內(nèi)容物密度來實(shí)現(xiàn)漂浮，從而成為長時(shí)間緩慢釋放藥物的儲庫，可實(shí)現(xiàn)靶向、長效治療，并且該制劑制備工藝簡便，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，是藥劑學(xué)研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)制備吳茱萸堿胃漂浮片，并評價(jià)該制劑對家兔胃黏膜損傷的保護(hù)作用，以期為相關(guān)藥物開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1200 型高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）； PR124ZH型電子天平［奧豪斯儀器（上海） 有限公司］；TDP-5 型單沖壓片機(jī) （北京海富達(dá)科技有限公司）； RT612 型溶出儀（深圳銳拓科技有限公司）；SK8210HP 型臺式超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）； 9240A 型鼓風(fēng)干燥箱（上海百典儀器設(shè)備有限公司）； GZX-9070MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）； BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 試劑與藥物 吳茱萸堿對照品 （批號110802-201925，純度99.5%，中國食品藥品檢定研究院）； 吳茱萸堿原料藥（批號200328，純度97.0%，湖北帝柏化工有限公司）。西咪替丁膠囊（批號20220219，重慶科瑞制藥有限公司）。羥丙甲基纖維素K4M （HPMC K4M，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司）； 碳酸氫鈉（批號202006，上海虹光化工廠）； 十六醇（批號191210，西隴科學(xué)股份有限公司）； 硬脂酸鎂（批號WS171008，河南毅碩生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物 健康新西蘭家兔，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸堿含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱（5 μm，200 mm×4.6 mm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸（含2%四氫呋喃） （40 ∶60）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長225 nm。

2.1.2 供試品溶液制備 取10 片胃漂浮片，研細(xì)，精密稱取粉末0.3 g （含吳茱萸堿約10 mg），轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加入30 mL 乙腈超聲處理10 min，流動(dòng)相定容，搖勻后8 500 r/min 離心10 min，取上清液1 mL 至50 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取吳茱萸堿對照品適量，乙腈制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的貯備液，密封，取適量，流動(dòng)相稀釋至0.05、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝23.489 2X+0.136 5 （r＝0.999 9），在0.05 ～10.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學(xué)考察 取1 片胃漂浮片，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得吳茱萸堿含量RSD 為1.30%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得吳茱萸堿含量RSD 為0.45%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取低（0.05 μg/mL）、中（1.0 μg/mL）、高（10.0 μg/mL） 質(zhì)量濃度對照品溶液適量，同一天內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得吳茱萸堿含量 RSD 分別為 0.36%、0.22%，0.24%，表明該方法日內(nèi)精密度良好； 同法連續(xù)測定6 d，每天1 次，測得吳茱萸堿含量RSD 分別為0.63%、0.47%、0.52%，表明該方法日間精密度良好。取10 片胃漂浮片，研細(xì)，精密稱取9 份，每份約0.15 g （含吳茱萸堿約5 mg），分成3 組，分別加入“2.1.3” 項(xiàng)下貯備液2.5、5.0、7.5 mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得吳茱萸堿平均加樣回收率分別為101.08%、100.82%、99.40%，RSD 分別為1.04%、0.68%、0.79%。

2.2 釋放度測定 采用2020 年版《中國藥典》四部0931 通則第二法，設(shè)定釋放介質(zhì)為1 000 mL人工胃液（超聲處理30 min 脫氣），溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，取樣點(diǎn)為1、2、4、6、8、10、12 h，取樣體積為3 mL，并補(bǔ)加3 mL空白介質(zhì)，0.45 μm 微孔濾膜過濾，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)累積釋放度，繪制釋藥曲線。

2.3 固體分散體制備及溶解度、釋放度測定 取2 g 吳茱萸堿原料藥、10 g PVP K30，加入100 mL 無水乙醇，在50 ℃下攪拌3 h，減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得，收集粉末，置于40 ℃真空干燥箱中過夜。

取16.4 mL 稀鹽酸至1 000 mL 量瓶中，加800 mL純化水、10 g 胃蛋白酶，超聲溶解，調(diào)節(jié)pH 至1.3 左右，純化水定容，即得人工胃液，采用飽和溶劑測得吳茱萸堿及其固體分散體溶解度分別為4.03、68.72 μg/mL，即后者增加了17.05倍。取吳茱萸堿、物理混合物（吳茱萸堿、PVP K30 用量比例1 ∶5）、吳茱萸堿固體分散體粉末適量，5 mL 人工胃液制成混懸液，置于透析袋（截留分子量35 000 Da） 中，扎緊，按“2.2” 項(xiàng)下方法測定累積溶出度，結(jié)果見圖1，可知固體分散體能促進(jìn)原料藥溶出度。

圖1 吳茱萸堿體外溶出曲線（n＝3）Fig.1 In vitro dissolution curves for evodiamine （n＝3）

2.4 胃漂浮片制備 采用粉末直接壓片法［14-16］，固定吳茱萸堿用量10 mg/片 （固體分散體中約60 mg/片），取HPMC K15M、十六醇、碳酸氫鈉、填充劑（乳糖） 適量，過100 目篩，通過等量遞加法混勻，加入1%硬脂酸鎂后再混勻，在單沖壓片機(jī)上壓制成直徑為8 mm，片重約為0.3 g，即得，硬度控制在（45±5） N。

2.5 漂浮性能測定 設(shè)定介質(zhì)為1 000 mL 人工胃液（超聲處理30 min 脫氣），溫度為 （37 ±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，以胃漂浮片從接觸介質(zhì)到穩(wěn)定漂浮在液面的時(shí)間為浮動(dòng)滯后時(shí)間，從開始漂浮到下沉的時(shí)間為漂浮時(shí)間。

2.6 處方優(yōu)化 采用Box-Behnken 響應(yīng)面法。

課題組前期以浮動(dòng)滯后時(shí)間、漂浮時(shí)間為評價(jià)指標(biāo)，對HPMC K15M 用量、十六醇用量、碳酸氫鈉用量進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)三者分別在20% ～36%、4% ～10%、8% ～16% 時(shí)可滿足浮動(dòng)滯后時(shí)間小于60 s、漂浮時(shí)間大于12 h 的要求，但它們對胃漂浮片體外釋藥有較大影響。因此，本實(shí)驗(yàn)以HPMC K15M 用量（X1）、十六醇用量（X2）、碳酸氫鈉用量（X3） 為影響因素，2、6、12 h 內(nèi)累積釋放度（Q2h、Q6h、Q12h） 的綜合評分Q為評價(jià)指標(biāo)，公式為Q＝|Q2h-25%|×100+|Q6h-55%|×100+|Q12h-90%|×100，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得方程為Q＝3.80+7.13X1+2.54X2-12.79X3+3.07X1X2-6.23X1X3-4.50X2X3+7.35X21+9.87X22+13.77X23，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬度P＞0.05，R2＝0.961 8，AdjR2＝0.912 7，表明模型可用于處方優(yōu)化，未知因素干擾很小； 因素X2、X3、X1X3、X21、X22、X23 均有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖2。設(shè)置綜合評分目標(biāo)值為最小，得到最優(yōu)處方為HPMC K15M 用量25.44%，十六醇用量7.03%，碳酸氫鈉用量13.57%，綜合評分為0.7 分，為了便于實(shí)際操作，將其調(diào)整為HPMC K15M 用量25.5%，十六醇用量7.0%，碳酸氫鈉用量13.6%。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 固定吳茱萸堿用量10 mg/片，HPMC K15M 用量25.5%，十六醇用量7.0%，碳酸氫鈉用量13.6%，乳糖補(bǔ)充片重至0.3 g，混勻后加入1%硬脂酸鎂，再次混勻后壓制3 批樣品，按“2.5” 項(xiàng)下方法測得平均浮動(dòng)滯后時(shí)間為76 s，平均漂浮時(shí)間達(dá)12 h，12 h 內(nèi)累積釋放度均大于90% （圖3），綜合評分為1.6 分，可知該工藝重復(fù)性良好，模型精確可靠。再按2020 年版《中國藥典》 四部通則測得胃漂浮片平均硬度為47 N，脆碎度檢查顯示片劑減失量為0.73%，重量差異為3.66%。

圖3 吳茱萸堿體外釋藥曲線（n＝6）Fig.3 In vitro drug release curves for evodiamine （n＝6）

2.8 胃黏膜損傷保護(hù)作用研究

2.8.1 分組、給藥與造模 家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為5 組，即正常組、模型組、吳茱萸堿胃漂浮片低劑量組（20 mg/kg）、吳茱萸堿胃漂浮片高劑量組（40 mg/kg）、西咪替丁組（20 mg/kg），每組6 只，雌雄兼具，其中正常組、模型組灌胃給予生理鹽水，給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)13 d，正常進(jìn)食飲水，觀察其活動(dòng)、精神狀態(tài)。給藥13 d 后，各組家兔禁食不禁水，除正常組外灌胃給予5.0 mL 無水乙醇以建立急性胃黏膜損傷模型，1.5 h 后空氣栓塞法處死，取出胃組織。

2.8.2 胃組織病理變化觀察 生理鹽水洗去家兔胃組織內(nèi)容物，平鋪于玻璃板上，棉球清理胃黏膜表面血絲，切取約1 cm×1 cm，置于10%中性福爾馬林溶液中24 h，乙醇脫水后二甲苯透明，石蠟包埋，HE 染色，在顯微鏡下觀察其病理變化，結(jié)果見圖4。由此可知，正常組黏液層結(jié)構(gòu)未缺失，腺體頂部圓潤完好，組織細(xì)胞排列致密，未見炎性細(xì)胞浸潤、水腫、充血等（圖4A）； 模型組黏液層消失，受損嚴(yán)重，組織細(xì)胞排列紊亂（圖4B）； 吳茱萸堿胃漂浮片低劑量組受損情況明顯低于模型組，組織細(xì)胞排列相對致密，腺體頂部仍圓潤完好，但有出血現(xiàn)象，胃黏膜缺失（圖4C）； 吳茱萸堿胃漂浮片高劑量組、西咪替丁組無出血現(xiàn)象，黏液層仍清晰可見，但部分區(qū)域變薄，腺體結(jié)構(gòu)完整，排列整齊（圖4D～4E）。

圖4 各組家兔胃組織病理變化（×200）Fig.4 Pathological changes of rabbit gastric tissue in various groups （×200）

2.8.3 行為特征觀察 正常組家兔飲食正常，行動(dòng)靈活，精神狀態(tài)良好； 模型組家兔喜扎推，活動(dòng)量明顯減少，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，四肢有抖動(dòng)現(xiàn)象； 吳茱萸堿胃漂浮片低劑量組家兔有1 只出現(xiàn)糞便溏稀現(xiàn)象，精神狀態(tài)尚可； 吳茱萸堿胃漂浮片高劑量組、西咪替丁組家兔整體情況基本類似，精神狀態(tài)、活動(dòng)量均明顯好于模型組。

2.8.4 潰瘍抑制率測定 采用游標(biāo)卡尺測量家兔胃內(nèi)部潰瘍長度、寬度，其中前者為潰瘍部位的最大直徑d1，后者為與最大直徑垂直的最寬距離d2，計(jì)算潰瘍面積S，公式為S＝π×d1/2×d2/2。再根據(jù)文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道計(jì)算胃黏膜損傷指數(shù)，潰瘍面積1～12 mm2為1 分，13 ～25 mm2為2 分，26 ～37 mm2為3 分，38 ～50 mm2為4 分，大于51 mm2為5 分，穿孔為6 分。最后再計(jì)算胃潰瘍抑制率，公式為抑制率＝ ［（模型組胃潰瘍指數(shù)-給藥組胃潰瘍指數(shù)） /模型組胃潰瘍指數(shù)］ ×100%，結(jié)果見表4，可知高劑量胃漂浮片可達(dá)到與西咪替丁類似的保護(hù)作用。

表4 潰瘍抑制率測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab.4 Results of ulcer inhibition rate determination （±s，n＝6）

表4 潰瘍抑制率測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab.4 Results of ulcer inhibition rate determination （±s，n＝6）

組別劑量/（mg·kg-1）胃黏膜損傷指數(shù)潰瘍抑制率/%模型組—5.02±0.75—吳茱萸堿胃漂浮片低劑量組202.84±0.6243.43吳茱萸堿胃漂浮片高劑量組402.08±0.4058.56西咪替丁組201.89±0.3562.35

3 討論

吳茱萸堿胃漂浮片與水相接觸后體積發(fā)生膨脹，導(dǎo)致其密度下降，從而有助于實(shí)現(xiàn)漂浮，并且加入十六醇、碳酸氫鈉的目的也是減小片劑密度［18］，提高漂浮性能。雖然十六醇用量在一定程度上會影響片劑釋藥情況［19］，但碳酸氫鈉用量對釋藥的影響比十六醇用量大，這是因?yàn)榍罢哂昧亢线m時(shí)可有效消除片劑延遲釋放、提高Q6h、Q12h，但用量過大時(shí)生成的CO2包裹在片劑表面，反而阻礙介質(zhì)滲入內(nèi)部。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行吳茱萸堿胃漂浮片處方優(yōu)化時(shí)，將Q2h、Q6h、Q12h轉(zhuǎn)換為綜合評分，期望Q2h釋放度能達(dá)25%，防止出現(xiàn)遲釋情況；Q6h釋放度能在55% 左右，防止出現(xiàn)過釋情況；Q12h釋放度能達(dá)90%，防止出現(xiàn)釋藥不足情況，最終獲得了漂浮性能良好、緩慢持續(xù)釋藥、累積釋放度較高的處方。

按照家兔與成人（體質(zhì)量按60 kg 計(jì)） 劑量之間的比例系數(shù)（3 ～4），結(jié)合本實(shí)驗(yàn)所制備的吳茱萸堿胃漂浮片劑量（10 mg/片，整片給藥），最終確定家兔每日口服西咪替丁劑量為20 mg/kg［20］，并設(shè)置了低劑量組（20 mg/kg）、高劑量組（40 mg/kg） 進(jìn)行比較。前期報(bào)道，吳茱萸堿給藥劑量為2.68 g/kg 時(shí)動(dòng)物未發(fā)生毒性反應(yīng)，因此高劑量組灌胃40 mg/kg 時(shí)具有較高的安全性［21］。結(jié)果顯示，吳茱萸堿胃漂浮片對家兔胃黏膜損傷具有一定預(yù)防性保護(hù)作用，但需加大給藥劑量才能達(dá)到與西咪替丁相似的效果。對于茱萸和胃止痛膠囊、左金膠囊等臨床上治療胃病的常用中成藥，吳茱萸堿、吳茱萸次堿每天口服總劑量在2.7 ～19.1 mg 之間［22-23］，故確定吳茱萸堿胃漂浮片含藥量為10 mg/片。今后，需結(jié)合毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)來確定吳茱萸堿胃漂浮片給藥方案，并且其不同規(guī)格的相關(guān)情況也是研究重點(diǎn)。