胡雄 顏聰 張宇 黎貴蕓 周喆焱 阮永華 劉士岳 邊莉

1 資料和方法

1.1 主要試劑 云錫礦粉（原云錫勞動衛(wèi)生研究所提供），顆粒粒徑中值5.189 μm[7]；RLE-6TN細胞株（美國ATCC公司）；DMEM/F12培養(yǎng)液（美國Hyclone）；細胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿（美國Coring公司）；Recombinant Rat Leptin/OB（rRtLeptin，美國R&D公司）；絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase,MEK）抑制劑U0126、蛋白質定量檢測試劑盒（BCA法）（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase, ERK）1/2、pERK多克隆抗體（美國Proteintech公司）；刀豆凝集素A（concanavalin A, ConA）（美國Sigma公司）；MTT粉劑（Solarbio公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞毒染模型的建立 以含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM/F12完全培養(yǎng)液在37oC、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RLE-6TN細胞，待細胞處于對數(shù)生長期傳代，加入含200 μg/mL礦粉的10% DMEM/F12完全培養(yǎng)基進行毒染，隔一代毒染一次，每次處理72 h，至第9代時一共毒染5次。將毒染組細胞命名為R200組，相應代次正常培養(yǎng)的RLE-6TN細胞命名為R組。

1.2.2 rRtLeptin及MEK抑制劑U0126對毒染細胞惡性轉化的影響 （1）篩選rRtLeptin及MEK抑制劑U0126作用毒染細胞的最適濃度：取對數(shù)生長期的R200組細胞，制備單細胞懸液，以每孔1×103個細胞的密度接種于96孔板，24 h后更換無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，分別加入含rRtLeptin濃度為0、50、100、200、500、800 ng/mL的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h；取對數(shù)生長期的R200組細胞，制備單細胞懸液，以每孔1×103個細胞的密度接種于96孔板，24 h后更換無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，分別加入含U0126濃度10、20、30、40、50 μmol/L的無血清培養(yǎng)基孵育，1 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h；收集上述各組細胞，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT液和180 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使用酶標儀在492 nm波長下測定每個孔的吸光度值（OD值）。（2）選用100 ng/mL的rRtLeptin和30 μmol/L的U1026進行后續(xù)實驗，取處于對數(shù)生長期的R200組細胞，更換為無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，按下列分組添加試劑：R200組為對照組，添加PBS溶液，R200L組添加100 ng/mL rRtLeptin；R200LU組添加100 ng/mL rRtLeptin+30 μmol/L U0126。

上述各組細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，分別收集培養(yǎng)第25代（P25）、30代（P30）、40代（P40）細胞，利用倒置顯微鏡對細胞形態(tài)學變化進行觀察，并行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色進行ConA凝集反應和錨著獨立生長實驗，觀察細胞功能差異。

1.2.3 HE染色及ConA凝集實驗 HE染色：收集P40 R200組和R200L兩組細胞制備細胞爬片，蘇木素染色樣品5 min后，使用1%鹽酸酒精進行分化處理、溫水返藍，0.5%伊紅染色1 min，采取梯度酒精脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察。ConA凝集實驗：收集P25和P30的各組細胞，制備單細胞懸液并調整至5×104個/mL的細胞密度，加入不同濃度的ConA溶液（0、25、50、100、200 μg/mL）在室溫下進行顯微鏡觀察，如果細胞在30 min內出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則判定為陽性。

1.2.4 細胞凝集現(xiàn)象觀察實驗 通過制備單細胞懸液并調整細胞密度至5×104個/mL，隨后加入不同濃度的ConA溶液（0、25、50、100、200 μg/mL）。在室溫條件下，通過顯微鏡觀察30 min，如果細胞在30 min內出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則判定為陽性。

2018年7月23日，原浙江省國土資源廳轉發(fā)《自然資源部關于健全建設用地“增存掛鉤”機制的通知》，同時提出工作要求：一是各地要高度重視批而未供、閑置土地消化利用工作，按照省廳統(tǒng)一部署，制訂盤活和處置方案，及時做好清理消化工作；二是各地要切實轉變觀念，樹立“增存掛鉤”的用地理念，提高土地節(jié)約集約利用水平；三是省廳將建立健全省級“增存掛鉤”獎懲機制。

1.2.5 錨著獨立性生長實驗 制備0.6%的底層瓊脂注入6孔板中，取P30和P40 R200各組細胞，用2×DMEM/F-12培養(yǎng)基（含有2×抗生素和20% FBS）將細胞密度調整至1×103個/mL，與0.7%瓊脂糖按1:1比例混勻，注入鋪有底層瓊脂的6孔培養(yǎng)板。待上層瓊脂凝固后，在37oC、5% CO2、飽和濕度孵育箱中，將細胞培養(yǎng)至14 d，每3 d更換一次培養(yǎng)液。利用顯微鏡觀察并記錄超過50個細胞的克隆數(shù)量并計算克隆形成率。

1.2.6 Western blot 收集細胞用細胞裂解液處理，提取總蛋白。通過BCA試劑盒測定各組細胞的蛋白濃度，調整蛋白濃度為70 μg/18 μL，SDS-PAGE電泳并濕轉法轉移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，1×TBST洗膜；5 mL一抗在4oC環(huán)境下孵育過夜；再使用1×TBST進行3次洗膜；酶標二抗室溫下孵育2 h；再使用1×TBST進行3次洗膜；化學發(fā)光，顯影，定影并采集圖像，ImageJ軟件對結果進行灰度值測定。

1.3 統(tǒng)計學處理 用Graphad Prism 8.0（Graphad software.San Diego, SA）對數(shù)據(jù)進行分析。以均數(shù)±標準差（Mean±SD）的方式來表示所獲得的數(shù)據(jù)。在進行兩組數(shù)據(jù)的比較時采用獨立樣本t檢驗作為分析方法；多組數(shù)據(jù)間比較使用方差分析和LSD-t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 R組、R200組細胞均表達leptin受體OB-R Western blot檢測顯示，正常及200 μg/mL礦粉毒染的RLE-6TN中均存在leptin受體（OB-R）蛋白表達，比較兩組細胞的OB-R蛋白表達水平，未發(fā)現(xiàn)明顯差異（圖1）。

2.2 rRtLeptin和U0126對毒染細胞作用的最適濃度

2.2.1 100 ng/mL rRtLeptin對R200組細胞的促增殖效果最佳 用不同濃度leptin處理R200組細胞，與對照組（0 ng/mL rRtLeptin）比較，增殖效應明顯，且對照組與各組之間OD值差異均有統(tǒng)計學意義（表1，P<0.05）。在0-100 ng/mL之間，rRtLeptin濃度越高，細胞增殖越明顯；當rRtLeptin濃度達100 ng/mL時，其促增殖效應最顯著；在100-800 ng/mL范圍內，rRtLeptin濃度與細胞增殖相關性減弱，細胞增殖趨于穩(wěn)定，且100 ng/mL作用組與大于100 ng/mL各濃度rRtLeptin作用組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；故選100 ng/mL為最適rRtLeptin濃度作用于R200細胞（圖2A）。

圖2 rRtLeptin和U0126作用毒染細胞的濃度篩選折線圖Fig 2 Concentration screening of the effects of rRtLeptin and U0126 on toxic stained cells fold plot

表1 不同濃度的rRtLeptin刺激R200細胞后的OD值（Mean±SD）Tab 1 OD value of R200 cells stimulated by rRtLeptin at different concentrations (Mean±SD)

2.2.2 30 μmol/L U0126對R200組細胞的生長抑制效果最佳 與對照組相比，10、20、30、40、50 μmol/L的U0126對R200細胞生長均有抑制作用（P<0.05）；且在濃度為30和50 μmol/L時，抑制生長效應最明顯，但兩組之間無統(tǒng)計學差異（表2，P>0.05），因此選濃度為30 μmol/L的U0126用于后續(xù)實驗（圖2B）。

表2 不同濃度的U0126刺激R200細胞后的OD值（Mean±SD）Tab 2 OD value of R200 cells stimulated by different concentrations of U0126 (Mean±SD)

2.3 rRtLeptin促進礦粉毒染細胞發(fā)生惡性轉化

2.3.1 rRtLeptin促進礦粉毒染細胞形態(tài)改變 用100 ng/mL的rRtLeptin誘導的R200L組細胞至P25時，部分細胞變梭，折光性降低，細胞間的黏附作用減弱，胰酶消化時間明顯縮短，單細胞脫落現(xiàn)象顯著。至P30時，細胞形態(tài)轉變?yōu)槎嘟乔也灰?guī)則，染色核變大，出現(xiàn)多核和巨核現(xiàn)象，核仁明顯，顯示出惡性轉化的特征，至P40惡性轉化特征顯著；而R200組及R200LU組細胞在P40時才出現(xiàn)惡性轉化特征（圖3）。

圖3 rRtLeptin和U0126對R200組細胞形態(tài)的影響Fig 3 Effect of rRtLeptin and U0126 on the morphology of R200 group cells. R200L group: leptin-induced R200 group; R200LU group: U0126-induced R200 group.

將P40的R200組和R200L組細胞行HE染色發(fā)現(xiàn)，R200組細胞大小不等、呈短梭形，核畸形、核仁明顯肥大、亦可見多個核仁。R200L組細胞呈多角不規(guī)則形，可見多核、巨核、核仁明顯，核分裂像多見，出現(xiàn)明顯惡性轉化特征（圖4）。上述結果表明rRtLeptin可促進云錫礦粉誘導的上皮細胞轉化，經MEK阻斷劑U0126處理后，其促轉化作用減弱。

圖4 rRtLeptin對R200組細胞形態(tài)的HE結果圖Fig 4 Plot of HE results of rRtLeptin on the morphology of R200 group cells. HE: hematoxylin-eosin.

2.3.2 rRtLeptin增強毒染細胞凝集能力，U0126可減弱其促凝集能力 采用ConA凝集素實驗檢測P25、P30 R200組、R200L組、R200LU組細胞凝集能力的情況，結果發(fā)現(xiàn)，以R組細胞為陰性對照，R200L組、R200LU組細胞最早在P25、ConA的濃度達到25 μg/mL時出現(xiàn)凝集，凝集時間分別為19、21 min，其余各組在同一Con A濃度下于P30出現(xiàn)凝集，并且隨著ConA濃度的不斷提升，細胞凝集的速度逐漸加快，凝集的先后順序為：R200L組>R200LU組>R200組（表3）。表明rRtLeptin可增強毒染細胞的凝集能力，經U0126處理后，其促凝集作用減弱。

表3 第25、30代各組細胞ConA實驗結果Tab 3 The results of the 25th and 30th generation of each group of cells of ConA experiments

2.3.3 rRtLeptin增強毒染細胞克隆形成能力，U0126可減弱其作用 將P30、P40的R200組、R200L組、R200LU組細胞行錨著獨立性生長實驗，結果發(fā)現(xiàn)，P30各組細胞未出現(xiàn)克隆集落；P40的R200L組細胞可見克隆形成，克隆形成率為2.25‰±0.5‰，R200組、R200LU組及R組細胞均可觀察到數(shù)個到數(shù)十個的細胞聚集成為團狀，但并未發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)量超過50的克隆群落（圖5）。結果表明rRtLeptin能促進毒染細胞的克隆形成能力，經U0126處理后，其促增殖能力減弱。

圖5 rRtLeptin和U0126作用R200組細胞后克隆形成圖（×100）Fig 5 Clone formation after the action of rRtLeptin and U0126 on R200 group cells (magnification ×100)

2.4 rRtLeptin激活毒染細胞的ERK通路 錨著獨立性生長實驗及ConA凝集實驗結果表明，rRtLeptin可增強第40代R200組細胞的克隆形成能力及凝集能力；進一步對該代次的細胞行ERK蛋白及其磷酸化蛋白pERK表達水平檢測，結果顯示，各組細胞ERK的表達無顯著差異（P>0.05）；與R組細胞比較，R200組細胞pERK表達增強，經rRtLeptin處理的R200L組細胞pERK表達進一步增強，加入U0126阻斷后，可部分抑制R200L組細胞ERK的磷酸化（圖6）。上述結果進一步表明，rRtLeptin可能通過激活ERK信號轉導調控毒染細胞的惡性轉化及相關功能改變。

圖6 rRtLeptin和U0126作用R200組細胞Western blot結果圖。A、B：ERK總蛋白的Western blot結果圖及其對應的柱狀圖；C、D：磷酸化ERK蛋白的Western blot結果圖及其對應的柱狀圖。*P<0.05。Fig 6 Western blot results of R200 cells treated with rRtLeptin and U0126. A, B: Western blot results of ERK total protein and corresponding histogram; C, D: Western blot results of phosphorylated ERK protein and corresponding bar graphs. *P<0.05.

3 討論

Leptin是一種具有多種生物學效應的生長因子，主要由脂肪組織合成、分泌，并參與調節(jié)脂肪代謝和神經內分泌[8,9]，除了存在于能量代謝相關的下丘腦、骨骼肌和脂肪組織，它還普遍存在于全身各組織器官中。近來多項研究結果表明，leptin與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關，其不僅可以促進人乳腺癌細胞、人胰腺癌細胞的體外增殖[10,11]，還能降低癌細胞的凋亡能力[12]。食管癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、大腸癌、胃癌等惡性腫瘤中l(wèi)eptin也呈現(xiàn)高表達[13-19]，且血清leptin水平的檢測可能提示預后信息。

由于其獨特的地域特性，云錫肺癌病理組織學類型主要表現(xiàn)為鱗狀細胞癌，且常伴隨肺組織廣泛的纖維化和腫瘤間質反應[20]。肺癌與肺纖維化之間存在密切關系，多數(shù)觀點認為彌漫性肺纖維化可增加患肺癌的風險，甚至有觀點認為肺纖維化可以作為獨立的指標來預測肺癌的發(fā)生，但其具體的發(fā)病機制仍未完全闡明[21]。課題組既往研究[22]顯示正常肺上皮細胞和毒染上皮細胞表達OB-R，經礦粉誘導后的活化成纖維細胞分泌表達的leptin為正常成纖維細胞的17倍。采用rRtLeptin作用于經礦粉誘導的RLE-6TN能夠促進其細胞增殖，增強毒染細胞的凝集能力和克隆形成能力等惡性轉化能力，且在rRtLeptin濃度為100 ng/mL時細胞增殖效應顯著，提示leptin是礦粉誘導成纖維細胞活化促進上皮細胞轉化的關鍵因子。

Leptin通過內分泌、外分泌或旁分泌的方式與其受體相互作用，并通過相應的信號轉導途徑發(fā)揮其多種生物學作用。據(jù)文獻報道，leptin/OB-R軸可激活ERK通路上調卵巢癌細胞表達基質金屬蛋白酶-7（matri x metalloproteinase-7, MMP-7），從而促進卵巢癌的侵襲轉移[23]，也可誘導腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞高表達白介素8（interleukin-8, IL-8），為乳腺癌的侵襲遷移提供有利條件[24]。在肺癌中，高表達的leptin/leptin受體軸可持續(xù)刺激ERK信號通路，促進核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）、即刻早期基因c-fos轉錄調控基因表達，以促進腫瘤的發(fā)生、上皮間質轉化及侵襲轉移[16,25]。Li等[26]也發(fā)現(xiàn)由腫瘤相關成纖維細胞分泌的leptin可能以旁分泌方式激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）/ERK1/2和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT）信號通路促進非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細胞的增殖和遷移。本研究采用ERK信號通路特異性抑制劑U0126作用于礦粉誘導的RLE-6TN，發(fā)現(xiàn)U0126可逆轉leptin促毒染細胞的增殖、惡性轉化、凝集及克隆形成能力，提示ERK信號通路在leptin促進毒染上皮細胞轉化過程中發(fā)揮關鍵作用，其作用機制有待進一步研究。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)leptin可能通過ERK信號通路促進礦粉誘導上皮細胞的轉化，提示leptin-OB-R/ERK軸作為溝通成纖維細胞活化和肺上皮細胞惡性轉化間關系的重要橋梁，可為探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤間質與腫瘤細胞的相互交聯(lián)提供新的研究思路。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Hu X and Bian L conceived and designed the study. Hu X,Yan C, Zhang Y and Li GY performed the experiments. Hu X, Yan C, Zhang Y and Zhou ZY analyzed the data. Hu X,Yan C, and Ruan YH contributed analysis tools. Hu X, Yan C,and Liu SY provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.