李中正，向 波，鄧 文，楊城城，王建霞，王思源，石 欣，田 果，李 輝*

金屬有機(jī)骨架-分子印跡復(fù)合微球的溶膠-凝膠法制備、表征及其對杜仲中桃葉珊瑚苷的提取分離

李中正1，向 波2#，鄧 文3，楊城城3，王建霞1，王思源1，石 欣1，田 果1，李 輝3*

1. 吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000 2. 吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 吉首 416000 3. 吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000

以金屬有機(jī)骨架（metal-organic frameworks，MOFs）為載體，制備桃葉珊瑚苷印跡復(fù)合材料，并用于杜仲中桃葉珊瑚苷的提取和分離。采用溶膠-凝膠法制備了桃葉珊瑚苷印跡聚合物（EM@MIPs），并通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）表征了該聚合物（EM@MIP3）表面化學(xué)官能團(tuán)和形貌特征，通過色譜法考察了印跡材料對杜仲桃葉珊瑚苷的分離效果。印跡材料（EM@MIP3）具有較高的印跡因子（6.830）和較高選擇性，相對于喇叭糖苷、車前草苷和京尼平苷，其對桃葉珊瑚苷的選擇性因子（）值分別為4.931、4.896和3.418。采用色譜法測定EM@MIP3柱對桃葉珊瑚苷的吸附能力，其吸附量為51.34 mg/g。使用EM@MIP3柱對杜仲提取物中桃葉珊瑚苷進(jìn)行在線分離純化時(shí)，桃葉珊瑚苷產(chǎn)品純度大于85%，回收率高于95%。此外，EM@MIP3聚合物可重復(fù)使用。印跡材料（EM@MIP3）有望發(fā)展成為一種高效的吸附介質(zhì)，用于中藥中桃葉珊瑚苷的分離和純化。

杜仲；溶膠-凝膠法；分子印跡聚合物；金屬有機(jī)骨架材料；桃葉珊瑚苷；提取分離；喇叭糖苷；車前草苷；京尼平苷

桃葉珊瑚苷是一種廣泛存在于杜仲、車前草、人參、延胡索等植物中的天然產(chǎn)物，具有降壓、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗纖維化、抗癌等多種生物活性[1-4]。從杜仲藥材中提取高附加值的桃葉珊瑚苷已成為杜仲產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要一環(huán)。然而，由于植物中成分復(fù)雜，且存在大量結(jié)構(gòu)相似的化合物，使得桃葉珊瑚苷的分離費(fèi)時(shí)費(fèi)力[5]。桃葉珊瑚苷的傳統(tǒng)分離往往涉及沉淀、結(jié)晶、兩相萃取、大孔樹脂吸附等繁瑣的程序。而高選擇吸附劑的研究和應(yīng)用對于該化合物的分離純化具有重要意義。

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）基于其對目標(biāo)化合物的高選擇性結(jié)合能力，為從復(fù)雜系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效分離提供了可能。MIPs已廣泛應(yīng)用于色譜分離[6-8]、生物傳感器[9-10]、催化[11-12]和其他領(lǐng)域[13-14]。表面印跡法可將吸附位點(diǎn)布置在載體表面，從而在很大程度上改善分子識別過程中的傳質(zhì)動力學(xué)。但選擇高比表面、易于修飾和具有較多活性基團(tuán)的載體至關(guān)重要。

金屬有機(jī)骨架（metal-organic frameworks，MOFs）是金屬離子與有機(jī)配體組裝而成的多孔晶體材料[15]。MIL-101（Cr）作為MOFs家族的一員，通過金屬鉻離子（III）與對苯二甲酸[16-18]配位而成。與傳統(tǒng)多孔材料（如活性炭、沸石、分子篩等）相比，MIL-101（Cr）具有比表面積大、孔隙率高、孔可設(shè)計(jì)、易于合成等特點(diǎn)[19-20]，廣泛用于吸附分離、催化、載藥及藥物控釋等領(lǐng)域[21-22]。但MOFs材料對目標(biāo)化合物選擇性不夠高，限制了其應(yīng)用。將MOFs的高吸附容量與MIPs的高選擇性相結(jié)合，有利于制備選擇性和吸附性能優(yōu)良的新型吸附材料，這為以MOFs為基體制備新型分子印跡聚合物提供了新思路。通過該方法獲得的新型印跡聚合物在吸附選擇性、結(jié)合容量和傳質(zhì)動力學(xué)方面將大幅提高。一些研究人員將MIPs固定在MOFs上，開發(fā)出了新型分子印跡電化學(xué)傳感器，在色譜分析中表現(xiàn)出更高的選擇性和靈敏度[23-25]。

MOFs基MIPs的制備主要是將MIPs負(fù)載到MOFs基質(zhì)上或直接通過黏合劑進(jìn)行結(jié)合，但這種固化方法很不穩(wěn)定，并會引起嚴(yán)重的非特異性結(jié)合而導(dǎo)致測量差異[26-27]。溶膠-凝膠法是一種通過水解來制備高交聯(lián)無定形二氧化硅材料的新技術(shù)[28]。二氧化硅基材是綠色、生物相容性高和環(huán)境友好型材料。近年來，溶膠-凝膠法被用來制備MIPs[29-30]。溶膠-凝膠反應(yīng)可在水或醇介質(zhì)中進(jìn)行，其前驅(qū)體毒性明顯低于有機(jī)試劑，且溶膠-凝膠法制備的MIPs具有更高的選擇性和更快的傳質(zhì)速率[31]。凝膠二氧化硅的剛性及高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)有利于創(chuàng)建形狀選擇性的印跡位點(diǎn)，增強(qiáng)印跡材料的物理剛性、化學(xué)惰性、熱穩(wěn)定性和親水性[32]。

本研究以氨基修飾的MIL-101（Cr）材料為載體，采用溶膠-凝膠法制備了MOFs基桃葉珊瑚苷印跡聚合物（EM@MIPs）。優(yōu)化了制備條件，并將分子印跡聚合物EM@MIP3用作液相色譜固定相，評價(jià)其分子識別能力。此外，還研究了EM@MIP3在線提取和分離杜仲粗提物中桃葉珊瑚苷的應(yīng)用性，并考察了EM@MIP3的重復(fù)使用性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

S-3400型掃描電子顯微鏡（SEM）、LC-2010 AHT型高效液相色譜儀、UV-2550型紫外/可見分光光度計(jì)，日本島津儀器公司；WGH-30A型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）光譜儀，天津儀器有限公司；Branson型超聲波清洗器，上海必能信超聲波有限公司。

1.2 試劑

桃葉珊瑚苷（批號20160202）、京尼平苷（批號20130514）、喇叭糖苷（批號20130615）和車前草苷（批號20130525）購自中國河南萬嘉股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。MIL-101（Cr），平均粒徑300 nm，來自中國江蘇先鋒納米材料股份有限公司。甲苯、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、異丙醇、乙腈、乙酸和乙醇，均為分析純，來自中國天津永大化學(xué)試劑廠。3-氨丙基三乙氧基硅烷（3- aminopropyltriethoxysilane，APTES，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）和四乙氧基硅烷（tetraethyl orthosilicate，TEOS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）來自中國上海阿拉丁生化技術(shù)股份有限公司。濃HCl和濃NH3·H2O購自中國上海申博化工廠。去離子水使用前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過。不銹鋼空柱（5 cm×2 mm）來自日本島津公司。

1.3 材料

1.3.1 藥材 杜仲購自中藥材市場（產(chǎn)地湖南慈利），經(jīng)湘西土家族苗族自治州民族中醫(yī)院藥劑科王洪副主任中藥師鑒定，為杜仲科杜仲屬落葉喬木杜仲Oliver.的干燥樹皮。

1.3.2 杜仲提取物樣品溶液的制備 將10.0 g干燥杜仲原料粉末加入200 mL石油醚中，在54.9 ℃下加熱回流12 h。濾過后，將固體用200 mL乙醇在49.9 ℃下再萃取30 min。將收集的乙醇濾液減壓蒸發(fā)以除去大部分溶劑。將杜仲提取物溶解在含有1% H2O的20 mL乙腈中待用[33]。

2 方法與結(jié)果

2.1 EM@MIPs的制備

2.1.1 MIL-101（Cr）的氨基改性 為提高載體活性，制備前，先用乙二胺為改性劑[34]對金屬有機(jī)骨架MIL-101（Cr）進(jìn)行化學(xué)修飾。將MIL-101（Cr）粉末4.0 g和乙二胺0.3 g加入100 mL甲苯中，加熱回流12 h，濾過得到的固體用50 mL無水乙醇洗滌3次，真空干燥24 h，得到灰色固體，即MIL-101（Cr）-NH2（EM）。

2.1.2 EM@MIPs的制備 采用溶膠-凝膠法進(jìn)行，制備流程如圖1所示，EM@MIPs的合成始于溶膠-凝膠功能前體APTES的酸性水解。在20 mL異丙醇-乙醇混合溶劑（5∶1）中加入一定體積的APTES（如表1所示）和0.5 mL 0.1 mol/L HCl，待APTES水解。攪拌均勻后，室溫下放置6 h。然后，在劇烈攪拌下加入0.1 mmol桃葉珊瑚苷、400 mg EM和0.2 mL DMSO，均勻分散后，靜置4 h，得溶液A。另將一定體積的功能前體TEOS（如表1所示）和0.5 mL 0.1 mol/L HCl加入到10 mL異丙醇-乙醇混合溶劑（5∶1）中，攪拌20 min，得溶液B。將溶液A與溶液B混合，混合溶液通入Ar氣流中鼓泡20 min，加入1.0 mL 1.0 mol/L NH3·H2O，溶液在室溫下放置12 h。然后將反應(yīng)混合物倒入20 mL甲醇中，反復(fù)超聲處理直至濾液中檢測不到桃葉珊瑚苷。收集固體并在49.9 ℃下干燥過夜，生成桃葉珊瑚苷印跡聚合物EM@MIPs。作為對照，按照相同的程序（但不添加模板桃葉珊瑚苷）制備非印跡聚合物EM@NIPs。

2.1.3 EM@MIPs制備條件優(yōu)化 溶劑類型、功能單體和交聯(lián)劑用量等影響聚合物性能。用異丙醇-乙醇（5∶1）混合物為溶劑時(shí)，因極性較弱有利于模板和功能單體間的相互作用，而乙醇可促進(jìn)單體溶解。優(yōu)化了模板、功能單體和交聯(lián)單體的物質(zhì)的量比。表1分別給出了摩爾比為1∶4∶5、1∶6∶10、1∶8∶15和1∶10∶20時(shí)，制備的EM@MIPs的IF值（色譜條件：EM@MIPs色譜柱；流動相為乙腈；體積流量0.2 mL/min；柱溫24.9℃；檢測波長235 nm；進(jìn)樣量10 μL。底物質(zhì)量濃度0.2 mg/mL）。從表1可知，IF值隨功能前驅(qū)體和交聯(lián)前驅(qū)體的體積增加而增加，當(dāng)APTES和TEOS與模板的物質(zhì)的量比高于8∶1和15∶1時(shí)，IF值增加緩慢。因此，選用模板-APTES-TEOS的物質(zhì)的量比為1∶8∶15來制備印跡材料，這樣獲得的印跡聚合物EM@ MIP3的IF值最高（6.830）。

圖1 桃葉珊瑚苷印跡聚合物(EM@MIPs)的制備示意圖

2.2 EM@MIP3和EM@NIP3的表征

2.2.1 FT-IR分析 EM@MIP3和EM@NIP3的FT-IR光譜圖如圖2所示。EM@MIP3有幾個(gè)主要的紅外吸收峰，即3526 cm?1處O-H鍵伸縮振動、3475 cm?1處N-H鍵伸縮振動、3028 cm?1處-CH2基團(tuán)中C-H鍵伸縮振動、1650 cm?1處C＝O鍵伸縮振動，1410 cm?1桃葉珊瑚苷分子雙環(huán)框架振動，1253 cm?1處C-O鍵伸縮振動，1145 cm?1處C-O-C伸縮振動，1082 cm?1處Si-O鍵伸縮振動，以及桃葉珊瑚苷分子中615 cm?1處糖苷環(huán)框架振動。

圖2 EM@MIP3和EM@NIP3的FT-IR光譜

與EM@MIP3的FT-IR光譜相比，EM@NIP3在1410 cm?1和615 cm?1（桃葉珊瑚苷分子的2個(gè)特定吸收峰）處沒有顯示出紅外吸收。EM@NIP3的吸收峰為3522 cm?1處O-H鍵伸縮振動，3481 cm?1處N-H鍵伸縮振動，3030 cm?1處-CH2基團(tuán)中C-H鍵伸縮振動，1655 cm?1處C＝O鍵伸縮振動，1253 cm?1處C-O鍵伸縮振動、1147 cm?1處C-O-C伸縮振動、1086 cm?1處Si-O鍵伸縮振動。這些紅外吸收峰表明印跡過程成功。

2.2.2 SEM觀察 EM@MIP3和EM@NIP3的SEM照片如圖3所示，2種聚合物微球顆粒大小較均勻，平均粒徑0.5～1.0 μm。此外，還觀察到一些微細(xì)顆?；蝾w粒微團(tuán)，這可能來源于制備過程中的一些副反應(yīng)，例如交聯(lián)前體或功能單體之間的低聚作用等。這種均勻印跡微球更適合作為色譜介質(zhì)。因此，使用EM@MIP3和EM@NIP3顆粒作為色譜固定相來評價(jià)其分子識別性能。

圖3 EM@MIP3 (a) 和EM@NIP3 (b) 的SEM照片

2.3 EM@MIP3色譜行為測試

用分子印跡聚合物作為固定相，在LC-2010 AHT高效液相色譜系統(tǒng)中測試EM@MIP3的色譜行為。首先將中空不銹鋼柱（5 cm×2 mm）用甲醇和去離子水反復(fù)清洗，除去柱內(nèi)壁的灰塵和污垢，然后風(fēng)干。稱取0.15 g EM@MIP3粉末，分散到異丙醇中，以甲醇為介質(zhì)，用勻漿法將聚合物填充到柱中。最后將柱連接到液相色譜系統(tǒng)中，用甲醇和乙腈為流動相依次洗脫，直至觀察到穩(wěn)定的基線。用乙腈-甲醇（20∶1）為混合溶劑，分別配制桃葉珊瑚苷、喇叭糖苷、車前草苷、京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mg/mL，所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均保持在24.9 ℃。用含水乙腈（含10%、5%、2%、1%水）作為流動相，流動相體積流量為0.2 mL/min，檢測波長為235 nm，等度模式下，測定了EM@MIP3柱的色譜行為。柱溫在24.9～44.9 ℃變化，進(jìn)樣體積為10 μL。用丙酮測試色譜柱的死時(shí)間。容量因子（）、選擇性因子（）和IF分別由公式（1）、（2）和（3）計(jì)算。

＝(r－0)/0（1）

＝桃葉珊瑚苷/com（2）

IF＝MIP3/NIP3（3）

r是化合物的保留時(shí)間，0是色譜柱的死時(shí)間，桃葉珊瑚苷和com是模板和結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物的容量因子，MIP3和NIP3分別是EM@MIP3和EM@NIP3色譜柱的容量因子

采用前沿液相色譜法測試了EM@MIP3柱對目標(biāo)物的吸附能力，用目標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL- 1%水的乙腈溶液為流動相，當(dāng)流動相以0.2 mL/min的速率泵入柱中后，當(dāng)流出曲線達(dá)到一穩(wěn)定的平臺后，完成突破。由突破曲線可計(jì)算印跡聚合物的吸附量[35]。

將分子印跡聚合物作為色譜固定相，通過色譜法可獲得其對不同化合物的保留值[6-37]及分離效能。但色譜柱填裝的均勻性和通透性均會影響測定結(jié)果。本研究采用漿料法填充色譜柱，裝柱前將聚合物分散在異丙醇中，再用高壓泵進(jìn)行裝填。

色譜柱通透性通過柱后壓（又稱背壓，其高低反映了色譜柱的通透性）來評價(jià)。圖4分別以甲醇、水、乙腈和2.0 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（pH 8.0）緩沖溶液為流動相，不同體積流量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min）時(shí)的柱后壓。從圖4中可以看出，當(dāng)使用2.0 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（pH 8.0）緩沖溶液或純水作為流動相時(shí)，柱后壓較高；而當(dāng)使用乙腈時(shí)柱后壓相對較低。另外，柱后壓對流動相流速高度依賴，流速越快柱后壓越高。因此，選擇乙腈作為基礎(chǔ)流動相，選擇體積流量為0.2 mL/min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

使用不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈溶液（含10%、5%、2%、1%水）作為流動相，測試了桃葉珊瑚苷及其結(jié)構(gòu)類似物（喇叭糖苷、車前草苷和京尼平苷，分子結(jié)構(gòu)如圖5所示）在EM@MIP3和EM@NIP3柱上的保留能力。表2顯示了EM@MIP3色譜柱在不同流動相下的值。從表中數(shù)據(jù)可知，以乙腈為流動相時(shí)，EM@MIP3色譜柱對桃葉珊瑚苷的保留能力最強(qiáng)，值最高，為10.64；當(dāng)乙腈流動相中水含量增加時(shí)，桃葉珊瑚苷的值減少。當(dāng)流動相中的水含量高于10%時(shí)，選擇性喪失。這表明印跡位點(diǎn)和模板分子之間的作用力主要為氫鍵。但分析物的分子結(jié)構(gòu)，如分子形狀、官能團(tuán)位置和數(shù)量，也會影響其保留，這可從相同流動相下幾種化合物不同的保留因子推斷得出。喇叭糖苷是一種模板類似物，可視為桃葉珊瑚苷分子C8位羥甲基被乙酸甲酯取代的產(chǎn)物，盡管含有1個(gè)糖基和1個(gè)環(huán)戊烯基吡喃雙環(huán)結(jié)構(gòu)，但在印跡柱上的保留因子降低。同樣，京尼平苷在印跡柱上的弱保留也可能是由于京尼平苷分子結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)位置和類型的差異造成的。車前草苷分子除含有1個(gè)糖基外，與模板分子的分子結(jié)構(gòu)存在較大差異，因此，其在EM@MIP3柱上的保留最弱。

圖5 桃葉珊瑚苷（AU）、京尼平苷（GP）、喇叭糖苷（BG）和車前草苷（PG）的分子結(jié)構(gòu)

表2 使用不同體積分?jǐn)?shù)乙腈作為流動相時(shí)，EM@MIP3和EM@NIP3柱對桃葉珊瑚苷及其結(jié)構(gòu)類似物的保留行為

表2還顯示了分子印跡柱對桃葉珊瑚苷的與變化規(guī)律。隨著流動相中水含量的增加，EM@ MIP3色譜柱的選擇性先增大后減小。當(dāng)使用含1%水的乙腈作為流動相時(shí)，印跡聚合物對模板選擇性最高，其相對于喇叭糖苷、車前草苷和京尼平苷，分別為2.799、2.812和2.576。與印跡聚合物柱相比，非印跡柱EM@NIP3對幾種化合物的保留能力較弱，幾乎沒有選擇性。

印跡柱對桃葉珊瑚苷的高選擇性源于EM@ MIP3柱基質(zhì)中與模板分子在大小、形狀和官能團(tuán)等方面匹配的結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果也可從圖6所示的色譜洗脫曲線得到證實(shí)（色譜條件：EM@MIP3色譜柱，含1%水的乙腈為流動相，柱溫24.9 ℃；底物質(zhì)量濃度0.2 mg/mL；進(jìn)樣量10 μL）。因此，用含1%水的乙腈作為流動相時(shí)，EM@MIP3柱對桃葉珊瑚苷具有較高的選擇性保留能力。

用含1%水的乙腈作為流動相時(shí)，測試了EM@ MIP3柱在不同溫度（24.9、34.9、44.9 ℃）下的保留行為。表3顯示了該印跡柱對幾種化合物的值（色譜條件：EM@MIP3色譜柱；以含1%水的乙腈為流動相，體積流量為0.2 mL/min，底物質(zhì)量濃度0.2 mg/mL；進(jìn)樣量10 μL）?？梢园l(fā)現(xiàn)，柱溫24.9 ℃時(shí)，印跡柱具有最高的值，其對模板的為7.470。柱溫升高，值下降。不同柱溫下EM@MIP柱的值如表3所示。結(jié)果表明，印跡柱的值隨溫度先升高后降低，當(dāng)柱溫34.9 ℃時(shí)選擇性最高，EM@ MIP柱對桃葉珊瑚苷的值相對于喇叭糖苷、車前草苷和京尼平苷分別為4.931、4.896、3.418。優(yōu)化的色譜條件：柱溫34.9 ℃、流動相為含1%水的乙腈、體積流量0.2 mL/min。

2.4 EM@MIP3柱分離桃葉珊瑚苷

基于EM@MIP3柱對模板分子的選擇識別能力，測試了印跡柱對模擬混合物中桃葉珊瑚苷、喇叭糖苷、車前草苷和京尼平苷的分離能力。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，柱溫為34.9 ℃時(shí)，圖7-a和b分別顯示了模型混合物在EM@MIP3和EM@NIP3聚合物固定相上的流出曲線。顯然，分子印跡柱EM@NIP3可以將桃葉珊瑚苷從模擬混合物中完全分離出來。但對于EM@NIP3色譜柱，在色譜圖上僅觀察到單峰，模擬混合物沒有分離。

本實(shí)驗(yàn)還測試了分子印跡材料的固相萃取應(yīng)用性能。但萃取前，需知道其吸附容量。為此，利用前沿色譜技術(shù)進(jìn)行測量。所謂前沿色譜，就是以含有待測物質(zhì)的溶液為流動相，當(dāng)流動相留給固定相時(shí)，待測物在固定相上進(jìn)行吸附脫附，當(dāng)吸附劑達(dá)到吸附飽和時(shí)，待測物質(zhì)便隨流動相流出，在色譜圖上呈現(xiàn)出待測物的流出曲線，即穿透曲線；當(dāng)目標(biāo)物在色譜柱上不再被保留時(shí)，流出曲線呈現(xiàn)一高的平臺。一般而言，穿透時(shí)間越長，吸附量越高，根據(jù)流出曲線形狀、平臺半高處的保留值及相應(yīng)色譜理論便可計(jì)算吸附量。圖7-c給出了桃葉珊瑚苷在分子印跡柱EM@NIP3及非印跡柱EM@MIP3上的穿透曲線，可以發(fā)現(xiàn)，在加載初期，由于聚合物基質(zhì)中存在大量結(jié)合位點(diǎn)，桃葉珊瑚苷分子幾乎完全保留在結(jié)合位點(diǎn)上，流出液中未檢測到桃葉珊瑚苷。隨著桃葉珊瑚苷的不斷流入，空白吸附位點(diǎn)變少，流出曲線上升。當(dāng)所有結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)后，桃葉珊瑚苷將不再被保留，流出曲線構(gòu)建了1個(gè)高的平臺。通過半高法，求得桃葉珊瑚苷在EM@NIP3柱和EM@MIP3柱上的吸附容量分別為23.72、51.34 mg/g。

表3 不同柱溫下EM@MIP3柱對印跡模板桃葉珊瑚苷及其結(jié)構(gòu)類似物的k和α值

圖7 桃葉珊瑚苷、京尼平苷、喇叭糖苷和車前草苷的模型混合物在EM@MIP3 (a) 和EM@NIP3 (b) 柱的洗脫曲線和0.01 mg·mL?1桃葉珊瑚苷在2根柱上的穿透曲線(c)

使用在線色譜系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)化合物的分離應(yīng)用。進(jìn)樣前，用含有1%水的乙腈溶液作為流動相平衡色譜柱。桃葉珊瑚苷的分離以一種在線方式進(jìn)行，以EM@MIP3為分離柱，洗脫劑為含1%水的乙腈溶液，體積流量0.2 mL/min，柱溫設(shè)定為34.9 ℃。向EM@MIP3色譜柱中分別注入20、40、60、80、100 μL的杜仲提取物樣品溶液，收集保留時(shí)間為6.5～9.0 min的流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除溶劑，即得桃葉珊瑚苷產(chǎn)品。

各產(chǎn)品的純度及目標(biāo)物回收率如表4所示，可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品溶液進(jìn)樣體積小于60 μL時(shí)，得到的桃葉珊瑚苷產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%以上，回收率高于95%。圖8-b和c給出了杜仲提取物樣品溶液的HPLC圖及裝載體積為60 μL時(shí)，分離所得桃葉珊瑚苷產(chǎn)品的HPLC圖［色譜條件：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水-乙酸混合溶液（20∶80∶1.5）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長235 nm）］。

表4 EM@MIP3色譜柱在線分離杜仲桃葉珊瑚苷

利用分子印跡材料從含有0.2 mg/mL桃葉珊瑚苷的乙腈溶液中分離目標(biāo)化合物，探討了EM@MIP3的重復(fù)使用性能。結(jié)果表明印跡材料重復(fù)使用10次后，桃葉珊瑚苷回收率幾乎恒定，聚合物重復(fù)使用性高。

3 討論

采用溶膠-凝膠法成功制備了MOF基桃葉珊瑚苷印跡復(fù)合微球，優(yōu)化制備條件為桃葉珊瑚苷與APTES和TEOS的物質(zhì)的量比為1∶8∶15。優(yōu)化條件下制備的分子印跡聚合物EM@MIP3具有最高的IF值（6.830）。當(dāng)以EM@MIP3為液相色譜固定相，以含1%水的乙腈混合溶液為流動相（體積流量0.2 mL/min，柱溫34.9 ℃）時(shí)，印跡柱對桃葉珊瑚苷具有最高的選擇保留能力，其對桃葉珊瑚苷的相對于喇叭糖苷、車前草苷和京尼平苷分別為4.931、4.896和3.418。EM@MIP3柱對桃葉珊瑚苷的吸附容量達(dá)51.34 mg/g?；诜肿佑≯E聚合物的高選擇性及高吸附能力，以之為吸附劑在線萃取杜仲粗提物中的桃葉珊瑚苷時(shí)，當(dāng)樣品溶液裝載體積小于60 μL時(shí)，一次萃取可獲得純度85%以上的桃葉珊瑚苷產(chǎn)品，回收率高于95%。這種分子印跡固相萃取為杜仲桃葉珊瑚苷的分離純化提供了一種新的簡單方法，有望推廣到其他中藥活性成分的提取及分離純化。

圖8 桃葉珊瑚苷標(biāo)準(zhǔn)品(a)、杜仲粗提物(b)及經(jīng)EM@ MIP3柱分離后的桃葉珊瑚苷產(chǎn)品(c)的HPLC圖

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Zeng X C, Guo F, Ouyang D S. A review of the pharmacology and toxicology of aucubin [J]., 2020, 140: 104443.

[2] Huang T L, Yang S H, Chen Y R,. The therapeutic effect of aucubin-supplemented hyaluronic acid on interleukin-1beta-stimulated human articular chondrocytes [J]., 2019, 53: 1-8.

[3] Liao Y H, Chen F, Xu L J,. Study on extraction and antibacterial activity of aucubin fromseed-draff waste biomass [J]., 2022, 8(10): e10765.

[4] Poto?njak I, Marini? J, Bati?i? L,. Aucubin protects against cisplatin-induced acute kidney injury in mice via attenuation of oxidative stress, apoptosis and inflammation [J]., 2020, 142: 111472.

[5] Yu L, Cao L, Chang Y H,. Enhanced extraction performance of iridoids, phenolic acids fromleaves by tailor-made ternary deep eutectic solvent [J]., 2021, 161: 105788.

[6] Xu Y W, Tan Y L, Majeed Z,. Hybrid molecularly imprinted polymers for targeted separation and enrichment of 10-hydroxycamptothecin inDecne [J]., 2023, doi: 10.1080/14786419.2023.2228981.

[7] Karaman Ersoy ?, Tütem E, S?zgen Ba?kan K,. Preparation, characterization and usage of molecularly imprinted polymer for the isolation of quercetin from hydrolyzed nettle extract [J]., 2016, 1017/1018: 89-100.

[8] 倪付勇, 劉露, 宋亞玲, 等. 分子印跡技術(shù)定向分離桂枝茯苓膠囊中活性成分去氫土莫酸 [J]. 中草藥, 2015, 46(6): 853-856.

[9] Karimi-Maleh H, Yola M L, Atar N,. A novel detection method for organophosphorus insecticide fenamiphos: Molecularly imprinted electrochemical sensor based on core-shell Co3O4@MOF-74 nanocomposite [J]., 2021, 592: 174-185.

[10] Aftim N, Istamboulié G, Piletska E,. Biosensor- assisted selection of optimal parameters for designing molecularly imprinted polymers selective to phosmet insecticide [J]., 2017, 174: 414-419.

[11] Cai J T, Chen T, Xu Y H,. A versatile signal- enhanced ECL sensing platform based on molecular imprinting technique via PET-RAFT cross-linking polymerization using bifunctional ruthenium complex as both catalyst and sensing probes [J]., 2019, 124/125: 15-24.

[12] Cho S J, Noh H B, Won M S,. A selective glucose sensor based on direct oxidation on a bimetal catalyst with a molecular imprinted polymer [J]., 2018, 99: 471-478.

[13] Mokhtari P, Ghaedi M. Water compatible molecularly imprinted polymer for controlled release of riboflavin as drug delivery system [J]., 2019, 118: 614-618.

[14] Loghmani M H, Shojaie A F, Hosseini S A. Glutathione- responsive hydrogel and molecularly imprinted polymer nanospheres: New aspect on cisplatin delivery [J]., 2021, 96: 98-108.

[15] 蔡夢如, 姚宇, 尹東閣, 等. 金屬有機(jī)骨架材料在中藥研究的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(16): 5028-5038.

[16] Yang K, Sun Q, Xue F,. Adsorption of volatile organic compounds by metal-organic frameworks MIL- 101: Influence of molecular size and shape [J]., 2011, 195: 124-131.

[17] Rajati H, Navarchian A H, Tangestaninejad S. Preparation and characterization of mixed matrix membranes based on Matrimid/PVDF blend and MIL-101(Cr) as filler for CO2/CH4separation [J]., 2018, 185: 92-104.

[18] Gargiulo N, Peluso A, Aprea P,. Chromium-based MIL-101 metal organic framework as a fully regenerable D4 adsorbent for biogas purification [J]., 2019, 138: 230-235.

[19] Kirchon A, Feng L, Drake H F,. From fundamentals to applications: A toolbox for robust and multifunctional MOF materials [J]., 2018, 47(23): 8611- 8638.

[20] Li J, Wang X X, Zhao G X,. Metal-organic framework-based materials: Superior adsorbents for the capture of toxic and radioactive metal ions [J]., 2018, 47(7): 2322-2356.

[21] Li J R, Sculley J, Zhou H C. Metal-organic frameworks for separations [J]., 2012, 112(2): 869-932.

[22] Xie L J, Liu S Q, Han Z B,. Preparation and characterization of metal-organic framework MIL-101 (Cr)-coated solid-phase microextraction fiber [J]., 2015, 853: 303-310.

[23] Hageneder S, Bauch M, Dostalek J. Plasmonically amplified bioassay-total internal reflection fluorescence. epifluorescence geometry [J]., 2016, 156/157: 225-231.

[24] Eskandari H, Amirzehni M, Asadollahzadeh H,. MIP-capped terbium MOF-76 for the selective fluorometric detection of cefixime after its preconcentration with magnetic graphene oxide [J]., 2018, 275: 145-154.

[25] Rawool C R, Srivastava A K. A dual template imprinted polymer modified electrochemical sensor based on Cu metal organic framework/mesoporous carbon for highly sensitive and selective recognition of rifampicin and isoniazid [J]., 2019, 288: 493-506.

[26] Arabi M, Ostovan A, Bagheri A R,. Strategies of molecular imprinting-based solid-phase extraction prior to chromatographic analysis [J]., 2020, 128: 115923.

[27] Chen G N, Guo P Q, Wang Y,. Preparation of molecularly imprinted polymers and application in a biomimetic biotin-avidin-ELISA for the detection of bovine serum albumin [J]., 2019, 198: 55-62.

[28] Lofgreen J E, Ozin G A. Controlling morphology and porosity to improve performance of molecularly imprinted sol-gel silica [J]., 2014, 43(3): 911-933.

[29] Chen G N, Shu H, Wang L,. Facile one-step targeted immobilization of an enzyme based on silane emulsion self-assembled molecularly imprinted polymers for visual sensors [J]., 2019, 145(1): 268-276.

[30] Zhao T, Wang Q Q, Li J,. Study on an electrochromatography method based on organic- inorganic hybrid molecularly imprinted monolith for determination of trace trichlorfon in vegetables [J]., 2014, 94(10): 1974-1980.

[31] Bie Z J, Chen Y, Ye J,. Boronate-affinity glycan- oriented surface imprinting: A new strategy to mimic lectins for the recognition of an intact glycoprotein and its characteristic fragments [J]., 2015, 54(35): 10211-10215.

[32] Shang L, Liu C J, Watanabe M,. LSPR sensor array based on molecularly imprinted sol-gels for pattern recognition of volatile organic acids [J]., 2017, 249: 14-21.

[33] 陳玉甫, 張學(xué)俊, 王明力, 等. 不同方法提取杜仲中桃葉珊瑚苷等4種高活性成分的比較研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2019, 31(1): 10-15.

[34] Tian H X, Hui L, Mao L,. Preparation of a pinoresinol diglucoside imprinted polymer using metal organic frame as the matrix for extracting target compound from[J]., 2021, 56(18): 3136-3150.

[35] Ostrihoňová M, Cabadaj P, Polakovi? M. Design of frontal chromatography separation of 1-phenylethanol and acetophenone using a hydrophobic resin [J]., 2023, 314: 123578.

[36] Wang D D, Luo X X, Wang M,. Selective separation and purification of polydatin by molecularly imprinted polymers from the extract ofet, rats’ plasma and urine [J]., 2020, 1156: 122307.

[37] Miura C, Li H, Matsunaga H,. Molecularly imprinted polymer for chlorogenic acid by modified precipitation polymerization and its application to extraction of chlorogenic acid fromleaves [J]., 2015, 114: 139-144.

Preparation of metal-organic frameworks-based molecularly imprinted polymer microsphere by a sol-gel technique and its application in extraction and separation of aucubin from

LI Zhong-zheng1, XIANG Bo2, DENG Wen3, YANG Cheng-cheng3, WANG Jian-xia1, WANG Si-yuan1, SHI Xin1, TIAN Guo1, LI Hui3

1. School of Medicine, Jishou University, Jishou 416000, China 2. Department of Clinical Laboratory, First Affiliated Hospital of Jishou University, Jishou 416000, China 3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China

To prepare an aucubin imprinted polymer (EM@MIPs) composite with metal-organic frameworks (MOFs) as the carrier and apply its to the extraction and separation of aucubin from Duzhong ().A sol-gel method was utilized to prepared EM@MIPs and the superficial chemical functional groups and morphology of polymers were characterized by Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR) and scanning electron microscope (SEM). The molecular recognition behavior for this imprinted material was evaluated through chromatographic method.The imprint materials (EM@MIP3) obtained under the optimized conditions possessed a high imprinting factor (6.830) and a high selectivity toward the template, with selectivity factor () values of 4.931, 4.896 and 3.418 relative to bugle glucoside, plantain glucoside and geniposide, respectively. The binding capacity for aucubin on the EM@MIP3 column was determined by frontal chromatography technique, with a value of 51.34 mg/g. The EM@MIP3 column can be utilized to on-line separation of aucubin from the extract of, obtaining more than 90% purity of aucubin products, with a recovery higher than 95%. In addition, the reusability for the EM@MIP3 polymer was satisfactory.This imprint materials (EM@MIP3) are expected to be developed into an efficient adsorption media for the separation and purification of aucubin from Chinese medicines.

Oliv.; sol-gel technique; molecularly imprinted polymer; metal organic frameworks; aucubin; extraction and separation; bugle glucoside; plantain glucoside; geniposide

R283.6

A

0253 - 2670(2023)22 - 7402 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.016

2023-08-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21865011）

李中正，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究。E-mail: 397182163@163.com

通信作者：李 輝，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子印跡藥物載體的研究。E-mail: lihuijsdx@163.com

向 波，碩士，主任技師，主要從事藥物檢驗(yàn)新劑型與新技術(shù)的研究。E-mail: xiangbobo1999@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]