鄒 佳，堯章洪，鄭其祥，管詠梅，陳麗華，朱衛(wèi)豐*，劉麗麗, 2*

鹽酸小檗堿對(duì)芍藥苷的經(jīng)皮促透規(guī)律及促透機(jī)制研究

鄒 佳1, 3，堯章洪1，鄭其祥4，管詠梅1，陳麗華1，朱衛(wèi)豐1*，劉麗麗1, 2*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004 3. 江西科技學(xué)院，江西 南昌 330098 4. 江西中醫(yī)藥大學(xué)19級(jí)中藥科研實(shí)踐班，江西 南昌 330004

考察鹽酸小檗堿對(duì)芍藥苷體外經(jīng)皮滲透行為的影響，篩選最佳促透條件并探索促透機(jī)制。采用改良Franz擴(kuò)散池法，選擇適宜的供給液及接收液，探索鹽酸小檗堿促進(jìn)芍藥苷經(jīng)皮滲透的最佳促透條件及促透規(guī)律；利用掃描電子顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、分子模擬探究促透機(jī)制。選擇20%乙醇-pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）為接收液，鹽酸小檗堿-芍藥苷在pH 5.0的介質(zhì)條件下透皮效果最佳，且在此條件下，高、中、低質(zhì)量濃度的芍藥苷與鹽酸小檗堿配伍后，芍藥苷的24 h累積透過量（24）分別增加了78.03%、44.73%、35.63%，其中高質(zhì)量濃度配伍組中芍藥苷的24與芍藥苷單獨(dú)給藥組相比具有顯著性差異（＜0.05），芍藥苷透皮速率顯著增加，促透比為1.74。促透機(jī)制研究結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿可能使角質(zhì)層整齊緊密堆積排列的疊瓦式結(jié)構(gòu)松動(dòng)，表面的褶皺明顯增多加深；鹽酸小檗堿可促進(jìn)水溶性成分熒光素鈉和脂溶性成分尼羅紅在皮膚中的滲透，相應(yīng)皮膚滲透量及滲透深度均有所增加。鹽酸小檗堿可競(jìng)爭(zhēng)性地與角質(zhì)層脂質(zhì)的頭部結(jié)合，使芍藥苷擺脫皮膚脂質(zhì)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的束縛，進(jìn)而促進(jìn)芍藥苷的經(jīng)皮吸收。芍藥苷-鹽酸小檗堿透皮的最佳pH值為5.0，鹽酸小檗堿可促進(jìn)芍藥苷的經(jīng)皮吸收，且具有濃度依賴性，促透機(jī)制可能為鹽酸小檗堿通過調(diào)控角質(zhì)層緊密連接易化皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)阻力、影響皮膚通透性及競(jìng)爭(zhēng)性與角質(zhì)層脂質(zhì)的極性頭部結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)芍藥苷經(jīng)皮滲透。

芍藥苷；鹽酸小檗堿；組分配伍；促透規(guī)律；促滲機(jī)制

外治專著《理瀹駢文》[1]中黃連/黃柏、赤芍/白芍常配伍使用，多用于治療陰虛、濕熱及一切無名腫毒之癥。黃連/黃柏的主要質(zhì)控和有效成分為小檗堿，小檗堿是一種季銨型生物堿，具有抗菌、抗炎等作用[2]，臨床常用其鹽酸鹽[3]，即鹽酸小檗堿，外用可治療新生兒膿痱子[4]、修復(fù)糖尿病感染造成的創(chuàng)面[5]等。赤芍/白芍的主要質(zhì)控和有效成分為芍藥苷，芍藥苷是一種蒎烷單萜苦味苷，具有鎮(zhèn)靜抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用[6]，對(duì)多種炎癥性皮膚病和自身免疫性皮膚病等具有良好的治療效果，不僅能有效緩解癥狀，還能減少激素或免疫抑制劑的劑量[7-8]。然目前未見相關(guān)經(jīng)皮給藥制劑上市。鹽酸小檗堿及芍藥苷經(jīng)皮給藥制劑開發(fā)具有廣闊前景。

文獻(xiàn)報(bào)道鹽酸小檗堿可促進(jìn)芍藥苷的經(jīng)皮吸收，然促透規(guī)律及機(jī)制不明[9]。皮膚表面和給藥系統(tǒng)的pH值均可影響有機(jī)弱酸、有機(jī)弱堿類藥物的解離程度，影響其溶解和分配性能，進(jìn)而影響藥物的經(jīng)皮滲透性[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了不同pH值條件下芍藥苷-鹽酸小檗堿的體外經(jīng)皮滲透行為，確定芍藥苷-鹽酸小檗堿透皮吸收的最佳pH值，進(jìn)而研究鹽酸小檗堿與不同質(zhì)量濃度芍藥苷配伍對(duì)芍藥苷體外經(jīng)皮吸收行為的影響，探究其促透規(guī)律，并在此基礎(chǔ)上開展促滲機(jī)制研究，以期為含鹽酸小檗堿及芍藥苷相關(guān)外用制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；TP-6型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，天津市正通科技有限公司，配套改良Franz擴(kuò)散池，＝1.13 cm2，＝15 mL；BT25S型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；THZ-300C恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；EPED型超純水器，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FEI Quanta 250型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM），美國(guó)FEI公司；SP5型激光共聚焦顯微鏡（laser confocal microscope，CLSM），德國(guó)Leica公司。

1.2 試劑

芍藥苷（批號(hào)20030203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)20111102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈，HPLC級(jí)，湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司；磷酸、甲醇、無水乙醇，AR級(jí)，西隴科學(xué)股份有限公司；2.5%戊二醛，北京索萊寶科技有限公司；乙酸異戊酯、丙酮，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氮酮，上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司；尼羅紅、熒光素鈉，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)，健康昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK（湘）2019-0004。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循江西中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為芍藥苷0.978 mg/mL和鹽酸小檗堿0.938 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液的制備

（1）不同pH值介質(zhì)條件下的芍藥苷-鹽酸小檗堿混合溶液的制備：按照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則下的方法制備pH值分別為4.0、5.0、6.8、7.4、8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）[11]，向PBS中加入一定量的芍藥苷和過飽和的鹽酸小檗堿，配制成芍藥苷-鹽酸小檗堿的過飽和水溶液。

（2）鹽酸小檗堿-芍藥苷不同配比混合溶液的制備：精密稱取適量芍藥苷溶解在最佳pH值的PBS中，用玻棒持續(xù)攪拌，制備成含芍藥苷分別為10、20、30 mg/mL的溶液。另稱取適量芍藥苷和鹽酸小檗堿，用最佳pH值的PBS配成不同質(zhì)量濃度的芍藥苷（10、20、30 mg/mL）-鹽酸小檗堿（1.5 mg/mL）配伍溶液。將配好的溶液放在37 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中放置過夜，即得。

2.2 體外分析方法的建立及方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 菲羅門C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.15%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～12 min，16%乙腈；12～15 min，16%～25%乙腈；15～30 min，25%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2.2 專屬性試驗(yàn) 空白接收液、對(duì)照品溶液、供試品溶液及含藥鼠皮提取液的HPLC譜圖如圖1所示，由圖可知，小鼠皮膚和基質(zhì)溶劑對(duì)芍藥苷、鹽酸小檗堿的測(cè)定無干擾，該測(cè)定方法專屬性良好。

2.2.3 線性關(guān)系考察 依次稀釋芍藥苷-鹽酸小檗堿混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以所得到的芍藥苷、鹽酸小檗堿色譜圖峰面積積分值（）與其質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：芍藥苷＝11.08－71.20，＝0.999 7、鹽酸小檗堿＝20.77－76.80，＝0.999 0，結(jié)果表明芍藥苷在9.78～489.00 μg/mL、鹽酸小檗堿在0.938～375.200 μg/mL與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（芍藥苷97.8 μg/mL-鹽酸小檗堿93.8 μg/mL、芍藥苷48.9 μg/mL-鹽酸小檗堿46.9 μg/mL、芍藥苷24.45 μg/mL-鹽酸小檗堿23.45 μg/mL）的芍藥苷-鹽酸小檗堿混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下所示色譜條件進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定芍藥苷和鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果芍藥苷高、中、低質(zhì)量濃度峰面積值的RSD分別為0.29%、0.75%、1.71%；鹽酸小檗堿高、中、低質(zhì)量濃度峰面積值的RSD分別為0.05%、0.08%、1.15%。

圖1 空白接收液(A)、對(duì)照品溶液(B)、供試品溶液(C)和含藥鼠皮提取液(D)的HPLC圖

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算得芍藥苷、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度的RSD分別為0.49%、1.98%，結(jié)果表明供試品溶液重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一個(gè)供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果芍藥苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.38%、0.18%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取空白皮膚接收液，加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的芍藥苷、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，配成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度供試品溶液3份，共9個(gè)供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定芍藥苷和鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果芍藥苷低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為99.56%、103.25%、104.38%，RSD分別為3.71%、1.89%、1.24%，鹽酸小檗堿的加樣回收率分別為101.60%、103.64%、99.52%，RSD分別為1.69%、1.47%、1.19%，均＜5%，符合測(cè)定要求。

2.3 鼠皮的制備

雄性昆明種小鼠安樂死后，剔去腹部的毛發(fā)，確保角質(zhì)層完好，用動(dòng)物手術(shù)彎剪迅速將動(dòng)物腹部皮膚剝離，用脫脂棉蘸取生理鹽水擦去脂肪組織和結(jié)締組織，塑封包裝后于?20 ℃冷凍保存，1周內(nèi)使用。

2.4 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

2.4.1 接收介質(zhì)的選擇 因鹽酸小檗堿水溶性差，故考察了其在10%乙醇-PBS、10%乙醇-生理鹽水及20%乙醇-PBS、20%乙醇-生理鹽水中的飽和溶解度，由表1可知，鹽酸小檗堿在20%乙醇-PBS中溶解度最好，且滿足漏槽條件，因此選用20%乙醇- PBS作為透皮接收液。

2.4.2 體外透皮試驗(yàn)裝置及條件 使用有效擴(kuò)散面積為1.13 cm2的改良型Franz立式擴(kuò)散池進(jìn)行滲透研究。將“2.3”項(xiàng)下準(zhǔn)備的鼠皮固定在擴(kuò)散池之間，表皮面向供給池，真皮層面向接收池，彈簧夾固定，用接收液平衡30 min后準(zhǔn)確移取1 mL供給液，注入供給池，在接收池中加入15 mL接收液。溫度保持在（37.0±0.5）℃，攪拌速度400 r/min。分別于2、4、6、8、10、12、24 h共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，每次取樣體積為1 mL，取樣后立即補(bǔ)充同溫等量空白接收液，以維持漏槽條件。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，HPLC測(cè)定芍藥苷、鹽酸小檗堿含量。

表1 鹽酸小檗堿在各接收介質(zhì)中的溶解度(, n = 3)

2.4.3 皮膚滯留量（s）測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚，用生理鹽水洗凈皮膚表面的藥物，剪下給藥部分，剪碎，加1 mL甲醇，渦旋5 min，超聲30 min，10 000 r/min離心10 min（離心半徑4.5 cm），取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，HPLC測(cè)定芍藥苷、鹽酸小檗堿的含量。

2.4.4 數(shù)據(jù)分析與處理[12-13]藥物的累積透過量（Q）的計(jì)算公式如下：

為接收液總體積，C為第次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度，C為第次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度，V為取樣體積，為有效擴(kuò)散面積

以藥物的24 h累積透過量（24）對(duì)取樣時(shí)間作曲線，并對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（s）。

藥物的皮膚滯留量（s）的計(jì)算公式如下：

s＝/

藥物的促透比（ER）的計(jì)算公式如下：

ER＝s(含促透劑)/s(不含促透劑)

2.4.5 介質(zhì)pH值對(duì)芍藥苷-鹽酸小檗堿體外透皮吸收的影響 結(jié)果見圖2和表2。芍藥苷在pH 5.0的介質(zhì)中24最大，與芍藥苷在pH 8.0介質(zhì)中的24相比，具有極顯著性差異（＜0.01）。鹽酸小檗堿在不同pH值介質(zhì)中24排列：pH 5.0＞pH 6.8＞pH 8.0＞pH 7.4＞pH 4.0。故選擇pH 5.0作為芍藥苷-鹽酸小檗堿透皮吸收的最佳pH值。

2.4.6 鹽酸小檗堿對(duì)不同質(zhì)量濃度的芍藥苷體外透皮吸收的影響 鹽酸小檗堿對(duì)不同質(zhì)量濃度的芍藥苷均顯示一定的促透效應(yīng)且具有濃度相關(guān)性。高質(zhì)量濃度配伍組中芍藥苷的24與其單獨(dú)給藥組相比具有顯著性差異（＜0.05），配伍后芍藥苷透皮速率為單獨(dú)給藥組的1.74倍，表明鹽酸小檗堿可促進(jìn)芍藥苷更快透過角質(zhì)層。此外，芍藥苷與鹽酸小檗堿配伍后，芍藥苷的皮膚滯留量均有所增加，促進(jìn)了芍藥苷的皮膚貯庫效應(yīng)形成，有利于其持續(xù)釋放，具體結(jié)果見圖3和表3。

2.5 鹽酸小檗堿對(duì)芍藥苷的促透機(jī)制研究

2.5.1 SEM觀察不同處理的小鼠皮膚 按“2.3”項(xiàng)下方法制備新鮮完整鼠皮，剪取1 cm2大小皮膚，分別浸入pH 5.0的PBS溶液、3%氮酮溶液、芍藥苷-鹽酸小檗堿配伍溶液（根據(jù)前面得到的高質(zhì)量濃度配伍組促透效應(yīng)好，繼而根據(jù)這個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行促透機(jī)制的研究，所以其質(zhì)量濃度為鹽酸小檗堿1.5 mg/mL-芍藥苷30 mg/mL），在室溫下密封浸泡12 h后，置于2.5%戊二醛溶液中避光固定，4 h后用pH 7.0的PBS液清洗，用1%鋨酸避光固定2 h，用pH 7.0的PBS液清洗，濾紙吸干，冷凍干燥后噴金，SEM下觀察[14]。觀察結(jié)果如圖4所示，正常皮膚組小鼠皮膚表面較為光滑平整，紋理清晰致密，最外層的角質(zhì)層細(xì)胞呈疊瓦式結(jié)構(gòu)有規(guī)律地，整齊緊密地堆積排列。溶劑處理后的小鼠皮膚表面褶皺打開，光滑程度下降，出現(xiàn)部分小小的間隙。氮酮組完整皮膚表面有大量的褶皺出現(xiàn)，皮膚表面光滑度嚴(yán)重下降，角質(zhì)細(xì)胞間隙明顯增寬，皮表裂隙清晰可見，有部分表皮鱗片向上翻起，角質(zhì)層大面積脫落現(xiàn)象。芍藥苷-鹽酸小檗堿配伍組皮膚變現(xiàn)出與氮酮組類似的變化，角質(zhì)層有規(guī)律的整齊緊密堆積排列的疊瓦式結(jié)構(gòu)有一定程度的松動(dòng)，形成了部分小小的間裂隙，而且其表面的褶皺明顯增多加深。

圖2 芍藥苷和鹽酸小檗堿在不同pH值介質(zhì)中的Qn(, n = 6)

與pH 8.0 PBS比較：*＜0.05 與pH 4.0 PBS比較：#＜0.05

*< 0.05pH 8.0 PBS#< 0.05pH 4.0 PBS

圖3 鹽酸小檗堿(1.5 mg?mL?1)與不同質(zhì)量濃度芍藥苷配伍前后芍藥苷Qn變化(, n = 6)

表3 鹽酸小檗堿與芍藥苷配伍前后芍藥苷滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)

與芍藥苷比較：*＜0.05

*< 0.05paeoniflorin

圖4 經(jīng)不同處理的小鼠皮膚SEM圖(放大倍數(shù)×1600)

2.5.2 CLSM技術(shù)觀察不同處理的小鼠皮膚對(duì)熒光素鈉的通透性 運(yùn)用CLSM技術(shù)分別考察鹽酸小檗堿對(duì)0.05%熒光素鈉溶液（親水性染料）和飽和尼羅紅溶液（親脂性染料）[15]的皮膚滲透量及滲透深度的影響，以期間接反饋鹽酸小檗堿對(duì)皮膚滲透性的影響以及熒光物質(zhì)在角質(zhì)細(xì)胞和脂質(zhì)中的分布程度，推測(cè)相關(guān)促滲作用機(jī)制。

將全層小鼠腹部皮膚固定于TP-6改良型Franz擴(kuò)散池上，表皮層朝向供給池。供給液分為4組，分別為含芍藥苷的0.05%熒光素鈉水溶液、含芍藥苷-鹽酸小檗堿的0.05%熒光素鈉水溶液、含芍藥苷的飽和尼羅紅水溶液、含芍藥苷-鹽酸小檗堿的飽和尼羅紅水溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下的體外透皮實(shí)驗(yàn)方法處理，經(jīng)皮滲透1 h后，取出皮膚樣本，用PBS洗凈表面的殘留染料，于共聚焦皿上展開，使用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行成像。熒光素鈉及尼羅紅的激發(fā)波長(zhǎng)分別設(shè)定為542、488 nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、6所示，芍藥苷單獨(dú)給藥組中熒光素鈉在小鼠皮膚中的熒光強(qiáng)度較低。而配伍組能顯著提升熒光素鈉在皮膚中的滲透深度及滲透強(qiáng)度。說明配伍促進(jìn)熒光素鈉在皮膚上滲透量及滲透深度。芍藥苷單獨(dú)給藥組中尼羅紅在小鼠皮膚中的滲透深度及熒光強(qiáng)度均較低。配伍后，尼羅紅的在小鼠皮膚中的滲透深度增大，熒光強(qiáng)度更強(qiáng)。說明鹽酸小檗堿與芍藥苷配伍后，促進(jìn)尼羅紅在皮膚中的滲透量及滲透深度。

2.5.3 計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接 使用Autodock vina軟件分別將鹽酸小檗堿及芍藥苷與皮膚角質(zhì)層的代表性脂質(zhì)成分神經(jīng)酰胺1、神經(jīng)酰胺3、神經(jīng)酰胺6、神經(jīng)酰胺7進(jìn)行分子對(duì)接，將鹽酸小檗堿及芍藥苷分子進(jìn)行加氫與定義扭轉(zhuǎn)鍵的預(yù)處理，定義為配體，神經(jīng)酰胺進(jìn)行去水加氫的預(yù)處理，定義為受體，將配體與受體執(zhí)行對(duì)接，并將輸出的對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入PyMOL軟件進(jìn)行可視化繪圖。

將鹽酸小檗堿及芍藥苷與代表性脂質(zhì)成分進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果顯示，兩者均可與神經(jīng)酰胺1、3、6、7的極性頭部以氫鍵形式結(jié)合，并計(jì)算形成氫鍵的復(fù)合物之間的對(duì)接能（a），a可在一定程度上反映出分子間相互作用的強(qiáng)度，其值為負(fù)表示分子間存在顯著的相互作用，并且作用越強(qiáng)負(fù)值則越大[16-17]，具體結(jié)果如圖7、8所示。以上結(jié)果顯示，芍藥苷和鹽酸小檗堿均能和神經(jīng)酰胺1、3、6、7的極性頭部以氫鍵形式結(jié)合，而鹽酸小檗堿與神經(jīng)酰胺的a皆大于芍藥苷與其a，說明鹽酸小檗堿與神經(jīng)酰胺的親和力要強(qiáng)于芍藥苷與神經(jīng)神經(jīng)酰胺之間的親和力，可產(chǎn)生“競(jìng)爭(zhēng)性氫鍵效應(yīng)”，使芍藥苷能夠擺脫皮膚脂質(zhì)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的束縛，更多地被游離出來，實(shí)現(xiàn)促透效應(yīng)。

圖5 經(jīng)不同處理的小鼠皮膚對(duì)熒光素鈉的通透性

圖6 經(jīng)不同處理的小鼠皮膚對(duì)尼羅紅的通透性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了黃連/黃柏、赤芍/白芍中的主要有效成分小檗堿、芍藥苷在不同pH值條件和配伍比例下經(jīng)皮吸收行為的變化規(guī)律。鹽酸小檗堿及芍藥苷均在pH 5.0的介質(zhì)中透皮吸收效果最佳。此外，課題組前期還探討了兩者在pH 10.8條件下的透皮吸收情況，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿在pH 10.8的條件下透皮吸收最好，其次是pH 5.0，這可能與其在pH＞10的堿性溶液中以不大穩(wěn)定的氮雜縮醛的形式存在，極性大大降低，油水分配系數(shù)增大有關(guān)[18]。值得注意的是實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)芍藥苷在堿性條件下不穩(wěn)定，且隨著pH值的升高，水解反應(yīng)加速[19]，芍藥苷中的苯甲酸酯鍵鍵能很低，在pH 10.8強(qiáng)堿性條件下易斷裂生成去苯芍藥苷和苯甲酸[20]。通過SEM觀察到pH 10.8的介質(zhì)對(duì)皮膚角質(zhì)層產(chǎn)生了較為明顯的破壞作用，可能產(chǎn)生皮膚刺激性等問題。綜合考慮芍藥苷和鹽酸小檗堿在不同pH值下的穩(wěn)定性、透皮性能及皮膚刺激性等問題，最終確定pH 5.0為最佳pH值。

圖8 芍藥苷與神經(jīng)酰胺的分子對(duì)接結(jié)果

在確定最佳pH值之后，進(jìn)一步考察了芍藥苷-鹽酸小檗堿不同配伍比例下對(duì)芍藥苷經(jīng)皮吸收行為的影響，研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷與鹽酸小檗堿配伍后，芍藥苷累計(jì)透過量和皮膚滯留量均有所增加，其中高濃度配伍組較芍藥苷單獨(dú)給藥組之間的透皮吸收存在極顯著差異（＜0.01），確證了鹽酸小檗堿對(duì)芍藥苷的促滲效應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其促滲機(jī)制。相關(guān)促透機(jī)制可能一方面與配伍可使皮膚表面的光滑度下降，角質(zhì)細(xì)胞間隙明顯增大，皮表裂隙清晰可見，角質(zhì)細(xì)胞疊瓦式結(jié)構(gòu)松動(dòng)，配伍可通過調(diào)控角質(zhì)層緊密連接，進(jìn)而易化皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)阻力而產(chǎn)生促滲效應(yīng)。另一方面，配伍能顯著增加熒光素鈉及尼羅紅的滲透強(qiáng)度及深度，推測(cè)配伍可通過調(diào)控皮膚通透性從而產(chǎn)生促滲效應(yīng)。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展分子對(duì)接模擬研究，選擇了皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)的主要成分：神經(jīng)酰胺1、3、6、7、膽固醇、游離脂肪酸C24、C26，將鹽酸小檗堿及芍藥苷與上述成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿及芍藥苷均未與膽固醇、游離脂肪酸C24、C26形成分子間氫鍵，但兩者均可與神經(jīng)酰胺1、3、6、7以氫鍵形式結(jié)合，鹽酸小檗堿與神經(jīng)酰胺結(jié)合的親和力大于芍藥苷與神經(jīng)酰胺的親和力，推測(cè)可形成競(jìng)爭(zhēng)性氫鍵效應(yīng)，使更多的芍藥苷擺脫皮膚脂質(zhì)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的束縛，使芍藥苷游離出來進(jìn)而促進(jìn)芍藥苷的經(jīng)皮吸收。本研究從藥物與皮膚相互作用的角度研究鹽酸小檗堿對(duì)芍藥苷的促透規(guī)律及機(jī)制，為芍藥苷經(jīng)皮給藥制劑的開發(fā)提供新視角，為含黃連/黃柏、赤芍/白芍中藥外用制劑組方提供理論指導(dǎo)，同時(shí)為新型潛在中藥經(jīng)皮促透劑的開發(fā)充實(shí)基礎(chǔ)。然在促滲機(jī)制研究部分還不夠全面深入，如配伍前后改變藥物在角質(zhì)層的分配[21]、對(duì)角質(zhì)層內(nèi)角蛋白和脂質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及成分含量的影響[22-23]等仍需進(jìn)一步的探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Transdermal permeation law and permeation mechanism of paeoniflorin by berberine hydrochloride

ZOU Jia1, 3, YAO Zhang-hong1, ZHENG Qi-xiang4, GUAN Yong-mei1, CHEN Li-hua1, ZHU Wei-feng1, LIU Li-li1, 2

1. Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang 330004, China 2. School of Pharmacy,Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. Jiangxi University of Technology, Nanchang 330098, China 4. Class 19 Chinese Medicine Research Practice Class, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To investigate the effect of berberine hydrochloride on transdermal permeation behavior of paeoniflorin, screen the best penetration promoting conditions and explore the penetration promoting mechanism.A modified Franz diffusion cell method was used to select suitable supply and receiving solutions to explore the optimal permeation-promoting conditions and rules for berberine hydrochloride to promote transdermal permeation of paeoniflorin; Scanning electron microscopy, confocal laser scanning microscopy and molecular simulation were used to investigate the mechanism of permeation promotion.The 20% ethanol-pH 7.4 phosphate buffer solution (PBS) was selected as the receiving solution, and the best transdermal effect of berberine hydrochloride - paeoniflorin was achieved under the media condition of pH 5.0, and the 24 h cumulative permeation (24) of paeoniflorin was increased by 78.03%, 44.73%, and 35.63% in the high, medium and low concentrations of paeoniflorin paired with berberine hydrochloride under this condition, respectively. The24of paeoniflorin in the high concentration combination group was significantly different (< 0.05) compared with the paeoniflorin alone administration group, and the transdermal rate of paeoniflorin increased significantly with a pro-permeation ratio of 1.74. The results of the study onpermeation promoting mechanism showed that berberine hydrochloride could loosen the stacked tile structure of the neat and tightly stacked arrangement of the stratum corneum, and the surface folds were significantly increased and deepened; Berberine hydrochloride could promote the permeation of the water-soluble component sodium fluorescein and lipid-soluble nile red in the skin, and the amount and depth of skin permeation were increased. Berberine hydrochloride can competitively bind to the head of stratum corneum lipids, freeing paeoniflorin from the hydrogen bonding network with skin lipids, and thus promoting the transdermal absorption of paeoniflorin.The optimal pH of paeoniflorin-berberine hydrochloride transdermal permeation is 5.0. Berberine hydrochloride can promote the transdermal absorption of paeoniflorin with concentration dependence, and the mechanism of promoting permeation may be that berberine hydrochloride promotes the transdermal permeation of paeoniflorin by modulating the tight junctions of stratum corneum to ease skin transport resistance, affecting skin permeability and competitively binding to the polar head of stratum corneum lipids.

paeoniflorin; berberine hydrochloride; component compatibility; transdermal permeation law; penetration promoting mechanism

R283.6

A

0253 - 2670(2023)22 - 7412 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.017

2023-06-16

江西省教育廳科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（GJJ201201）；江西高校省級(jí)示范研究生導(dǎo)師創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（中藥資源開發(fā)與利用研究生導(dǎo)師創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（中藥藥劑學(xué)）

鄒 佳，在讀碩士研究生，主要從事中藥經(jīng)皮給藥研究。Tel: 18720189041 E-mail: ZJ1103@126.com

通信作者：朱衛(wèi)豐，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥經(jīng)皮給藥新劑型與新技術(shù)研究。E-mail: zwf0322@126.com

劉麗麗，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥經(jīng)皮給藥研究。E-mail: liulili1985@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]