和耀威,張 林,向 準,李 鵬

(1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2.貴州高山六芝園種植有限公司，貴州 貴陽 550014)

靈芝具有很高的藥用價值，對提升免疫力、改善心血管系統(tǒng)和防治高血壓等具有較好的作用[1]，市場前景廣闊。傳統(tǒng)的固體食用菌菌種生產(chǎn)相比液體菌種過程復雜，流程繁瑣，生產(chǎn)周期長且成本高昂，菌種活力不均一，菌種上部易出現(xiàn)老化現(xiàn)象[2]，制約靈芝產(chǎn)業(yè)規(guī)?；s化發(fā)展。液體菌種的生產(chǎn)是在發(fā)酵罐內(nèi)進行，菌體細胞處于最適的溫度、酸堿度、氧氣、碳氮比等條件下，以動態(tài)方式培養(yǎng)，具有生產(chǎn)周期短、菌種純度高活力強、接種方便、滿袋（瓶）時間短、成品率高等優(yōu)點，是食藥用菌規(guī)?；蜋C械化生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。為縮短菌種生產(chǎn)周期和提高菌種活力，以液體菌種碳氮源篩選獲得的結(jié)果為基礎（一級液體種培養(yǎng)基配方為每升中含葡萄糖25.0 g，酵母浸粉5.0 g，CaCO30.2 g，KH2PO41.0 g，蛋白胨1.5 g，ZnSO4·7H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH 自然），選用優(yōu)化配方［二級液體種基質(zhì)配方為每升中含葡萄糖2%，蔗糖2%，玉米粉1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，消泡劑（豆油）0.05%，pH 自然］作為發(fā)酵罐液體種的基礎配方，通過測定不同對發(fā)酵液pH、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間條件下的菌絲生物量，探究優(yōu)化二級液體菌種的培養(yǎng)條件及生產(chǎn)工藝，以期為靈芝液體菌種的推廣和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株選用南GL11，由國家菌草工程中心提供的福建省審定品種。

1.2 培養(yǎng)基配方

1.2.1 PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，水1 000 mL。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)基配方(1 L) 葡萄糖25.0 g，酵母浸粉5.0 g，CaCO30.2 g，KH2PO41.0 g，蛋白 胨1.5 g，ZnSO4·7H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g。

1.2.3 發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)基 葡萄糖2%，蔗糖2%，玉米粉1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，豆 油0.05%，pH自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 搖瓶菌種和發(fā)酵罐培養(yǎng)基的制作

1）搖瓶菌種的制作。每個三角瓶裝培養(yǎng)基500 mL，并加入少量玻璃珠，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后在超凈工作臺中接種經(jīng)過活化的母種菌塊10 塊。在培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃黑暗靜置2 d，肉眼可見菌塊萌發(fā)后內(nèi)置于搖床26 ℃培養(yǎng)4～5 d，轉(zhuǎn)速為120～140 r/min。當搖瓶菌種培養(yǎng)好后，在超凈工作臺酒精燈火焰旁，按照無菌操作將液體菌種收集于已滅菌干燥的大三角瓶內(nèi)，用于后續(xù)接種。

2）發(fā)酵罐培養(yǎng)基的制作。首先對空氣過濾器進行單獨滅菌，滅菌條件為121 ℃維持30 min，并調(diào)整空氣閥大小，將空氣過濾器吹干。然后進行發(fā)酵罐空消，將夾套中的水排干凈后，進行121 ℃高溫滅菌30 min。滅菌后待溫度降至80 ℃以下，排干凈管內(nèi)冷凝水。最后將培養(yǎng)料投入發(fā)酵罐內(nèi)，每個發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基40 L，高壓滅菌30 min，冷卻至25 ℃時接入搖瓶菌種1 500 mL，通入經(jīng)過過濾的空氣，培養(yǎng)5～7 d。

1.3.2 發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1）發(fā)酵液培養(yǎng)溫度試驗。試驗溫度24～32 ℃，共設置5 個溫度處理，分別為24 ℃、26℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃。起始pH 6.0，發(fā)酵罐每罐裝液量均為40 L，培養(yǎng)時間均為7 d。培養(yǎng)過程中觀察并記錄每個處理的菌絲體或菌絲球的生長情況，并統(tǒng)計每個處理的菌絲生物量。

2）發(fā)酵液起始pH 試驗。以液體培養(yǎng)基為基礎，試驗pH 5～7，共設置5 個梯度處理，pH 分別為4、5、6、7、8。培養(yǎng)溫度26 ℃，發(fā)酵罐每罐裝液量均為40 L，培養(yǎng)時間均為7 d。觀察并統(tǒng)計菌絲生物量。

3）發(fā)酵液接種量試驗。選用容積為60 L的液體發(fā)酵罐，發(fā)酵罐每罐裝液量均40 L；接種量1%～10%，共設置6 個處理，依次是接種量為1%、2%、4%、6%、8%、10%。培養(yǎng)基的起始pH 均調(diào)節(jié)至6.0，培養(yǎng)溫度26 ℃，培養(yǎng)時間均為7 d。觀察并統(tǒng)計菌絲生物量。

4）發(fā)酵液培養(yǎng)時間試驗 發(fā)酵液培養(yǎng)時間范圍4～8 d，共設置5 個時間處理，依次為培養(yǎng)4 d、5 d、6 d、7 d、8 d。發(fā)酵罐每罐裝液量均40 L，培養(yǎng)基的起始pH均調(diào)節(jié)至6.0，培養(yǎng)溫度26 ℃。觀察并統(tǒng)計菌絲生物量。

1.3.3 菌絲生物量測定 各處理培養(yǎng)液混勻后取100 mL 發(fā)酵液，分裝于兩個50 mL 離心管內(nèi)，置于離心機內(nèi)，進行5 000 r/min 離心，時間為10 min。然后放入烘箱，50 ℃條件下烘干菌絲至恒重，測定各處理菌絲生物量干重。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗數(shù)據(jù)均用SPSS Statistics 17進行統(tǒng)計分析（P＜0.05），用origin 進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵液培養(yǎng)溫度靈芝的菌絲生物量

從圖1 可知，不同培養(yǎng)溫度處理下，靈芝菌絲生物量具有顯著性差異。其中培養(yǎng)溫度為28 ℃時，菌絲生物量最重，達132.18 mg/100mL，培養(yǎng)溫度為26 ℃時，菌絲生物量略有下降，為128.16 mg/100mL，但與28 ℃處理間無顯著性差異。當培養(yǎng)溫度較低，為24 ℃時，靈芝菌絲體生物量最少，為90.12 mg/100mL。溫度從24～28 ℃變化時，菌絲生物量隨溫度的增加而增加；靈芝雖為高溫菌，但當溫度增加到32 ℃時，菌絲生物量降低，不適合菌絲體的生長與擴繁。因此靈芝發(fā)酵液的最適培養(yǎng)溫度為26～28 ℃。

圖1 不同發(fā)酵液培養(yǎng)溫度靈芝的菌絲生物量

2.2 不同發(fā)酵液起始pH靈芝的菌絲生物量

從圖2 可知，培養(yǎng)液pH 4～8 時，靈芝菌絲體均能生長，當發(fā)酵罐液體菌種的培養(yǎng)液起始pH 增加時，菌絲生物量出現(xiàn)先增后減的規(guī)律。pH 6 處理的菌絲生物量最大，為121.52 mg/100mL，并顯著高于其余處理。菌絲生物量依次是pH 6 處理＞pH 5 處理＞pH 7處理＞pH 8＞處理＞pH 4處理。因此，靈芝最適pH為6，為偏酸性高溫木腐菌。

圖2 不同發(fā)酵液起始pH靈芝的菌絲生物量

2.3 不同發(fā)酵液接種量靈芝的菌絲生物量

從圖3可知，不同接種量處理的菌絲生物量差異顯著。其中接種量1%的生物量最低，菌種量過少，不利于短時間內(nèi)獲得足夠菌絲量；接種量從1%增加到4%時，菌絲生物量從40.00 mg/100mL 急劇增加到132.00 mg/100mL。接種量增加到6%時，菌絲生物量比4%接種量相比略有降低，為128.43 mg/100mL，但兩者間無顯著差異；接種量達10%時，菌絲生物量下降至82.65 mg/100mL。接種量過低，萌發(fā)點少，菌絲生物量低；接種量過多，菌絲亦衰老自溶，菌絲生物量亦會降低。因此接種量以4%～6%為宜。

圖3 不同發(fā)酵液接種量靈芝的菌絲生物量

2.4 不同發(fā)酵液培養(yǎng)時間靈芝的菌絲生物量

從圖4 可知，4～6 d 處于對數(shù)生長期，菌絲生物量增加顯著，6 d 時最高為123.60 mg/100mL，7 d 時菌絲生物量較6 d稍有下降，8 d 時菌絲生物量較6 d 顯著降低，可能是由于6～7 d 時靈芝菌絲處于穩(wěn)定生長期，菌絲生長量與消亡量處于動態(tài)平衡，生長狀態(tài)基本趨于穩(wěn)定。而從8 d 開始菌絲體進入衰亡期，菌絲量減少顯著。因此，發(fā)酵罐液體菌種在的最佳培養(yǎng)時間為6 d，此時菌絲生物量最大，菌絲生命力旺盛，菌種活力強。

3 討論與小結(jié)

不同液體菌種生產(chǎn)技術(shù)對靈芝生物量及相關代謝產(chǎn)物或營養(yǎng)成分的影響不同，有研究發(fā)現(xiàn)，接種量為10%、發(fā)酵周期6 d、pH 5.5時最適宜菌絲生物量和代謝產(chǎn)物的提升[3]；還有研究得出實現(xiàn)多糖高產(chǎn)的最佳發(fā)酵溫度為27 ℃、培養(yǎng)基初始pH 6.0、發(fā)酵時間144 h[4]。本試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度為26～28 ℃時菌絲生物量最多，為128.16～132.18 mg/100mL，培養(yǎng)液pH 6 時菌絲生物量達最大值，為121.52 mg/100mL，靈芝的生物學特性表現(xiàn)為偏酸性高溫菌。接種量過低，萌發(fā)點少，菌絲物量低；接種量過多，菌絲亦衰老自溶，菌絲生物量亦降低，接種量為4%～6%時菌絲生物量較高，為128.43～132.00 mg/100mL。發(fā)酵罐液體菌種的最佳培養(yǎng)時間為6 d，此時生物量最大，為123.60 mg/100mL，菌絲生命力旺盛，菌種活力強。因此，適宜發(fā)酵罐液體菌種的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度26～28 ℃、培養(yǎng)液pH 6、接種量4%～6%、培養(yǎng)時間6 d。